PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Suatu analisis kimia seperti pengambilan cuplikan, pemisahan senyawa pengganggu,
isolasi senyawa yang dimaksudkan, pemekatan terlebih dahulu sebelum identifikasi dan
pengukuran banyak dilakukan. Sekarang ini deteksi sifat spesifik suatu senyawa menjadi
sangat penting, terutama dalam bidang farmasi, kimia, dan klinik, serta bidang lainnya.
Banyak metode analisis seperti spektrofotometri, manganometri, atau lainnya, akan tetapi
semuanya membutuhkan kerja ekstra dan waktu yang cukup lama untuk mendapatkan hasil
analisis dibandingkan dengan teknik kromatografi.
Teknik kromatografi adalah metode pemisahan yang digunakan untuk sintesis
senyawa murni (atau hampir murni). Pada umumnya sebelum suatu senyawa diidentifikasi
dan dapat di ukur kadarnya, perlu di pisahkan dari matriknya. Oleh karena itu, pemisahan
merupakan langkah penting dalam analisi kualitatis. Suatu analisis kimia menjadi
meragukan jika pengukuran sifat tidak berhubungan dengan sifat spesifik senyawa terukur.
Terdapat banyak teknik pemisahan tetapi kromatografi merupakan teknik yang paling
banyak di gunakan. Salah satunya yaitu kromatografi kolom.
Berbagai metode kromatografi memberikan cara pemisahan paling kuat. Karena
pemanfaatannya yang leluasa, dipakai secara luas untuk pemisahan analitik dan preparatif.
Biasanya, kromatografi analitik dipakai pada tahap permulaan untuk semua cuplikan, dan
kromatografi preparatif hanya dilakukan jika diperlukan fraksi murni dari campuran.
Pemisahan secara kromatografi dilakukan dengan cara mengotak-atik langsung beberapa
sifat fisika umum dari molekul. Pemisahan senyawa biasanya menggunakan beberapa teknik
kromatografi. Pemilihan teknik kromatografi sebagian besar bergantung pada sifat kelarutan
senyawa yang akan dipisahkan. Berdasarkan uraian tersebut, maka pada makalah ini akan
dibahas tentang metode kromatografi kolom.
1
B. Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang masalah yang telah dikemukakan. Di bawah ini dirumuskan
beberapa masalah yang akan dibahas dalam makalah :
C. Tujuan
1. Untuk mengetahui pengertian dari kromatografi kolom
2. Untuk mengetahui prinsip dari kromatografi kolom
3. Untuk mengetahui fase diam dan fase gerak dari kromatografi kolom
4. Untuk mengetahui proses pemisahan / mekanisme pemisahan pada kromatografi kolom
5. Untuk mengetahui analisis kualititatif dan kuantitatif kromatografi kolom
6. Untuk mengetahui penerapan kromatografi kolom dalam kehidupan.
2
BAB II
PEMBAHASAN
3
Keuntungan kromatografi kolom yaitu dapat digunakan untuk analisis dan
aplikasi preparatif, digunakan untuk menentukan jumlah komponen campuran digunakan
untuk memisahkan dan purifikasi substansi. Kerugian dari kromatografi kolom yaitu
untuk mempersiapkan kolom dibutuhkan kemampuan teknik dan manual, sehingga
metode ini sangat membutuhkan waktu yang lama.
4
B. Fase Diam dan Fase Gerak dalam Kromatografi Kolom
Dalam kromatografi terdapat istilah fase diam dan fase gerak. Ditinjau dari
pengertian keduanya dimana fase diam (Stationary phase) merupakan salah satu komponen
yang penting dalam proses pemisahan dengan kromatografi karena dengan adanya interaksi
dengan fase diamlah terjadi perbedaan waktu retensi (tR) dan terpisahnya komponen suatu
senyawa analit. Fase diam dapat berupa bahan padat atau porous (berpori) dalam bentuk
molekul kecil atau cairan yang umumnya dilapiskan pada padatan pendukung.
Sedangkan fase gerak (Mobile phase) merupakan pembawa analit, dapat bersifat inert
maupun berinteraksi dengan analit tersebut. Fase gerak dapat berupa bahan cair dan dapat
juga berupa gas inert yang umumnya dapat dipakai sebagai carrier gas senyawa yang
mudah menguap (volatile).
Pada kromatografi kolom, kolomnya (tabung gelas) diisi dengan bahan seperti pati
yang dicampur dengan adsorben, dan pastanya diisikan kedalam kolom. Larutan sampel
kemudian diisikan kedalam kolom dari atas sehingga sampel diasorbsi oleh adsorben.
Kemudian pelarut (fase gerak) ditambahkan tetes demi tetes dari atas kolom. Partisi zat
terlarut berlangsung di pelarut yang turun ke bawah (fasa gerak) dan pelarut yang
teradsorbsi oleh adsorben (fase diam). Berdasarkan uraian diatas maka dapat kita simpulkan
bahwa fase gerak dalam kromatografi kolom merupakan pelarut sedangkan fase diamnya
adalah adsorben.
5
Fase diam: Cair
Untuk kromatografi jenis ini dasarnya adalah senyawa yang memiliki kemiripan sifat fisika
kimia dengan fase diam akan tertambat lebih lama pada fase diam –> tR lebih besar
Sebagai contoh jika kita ingin memisahkan kafein dan parasetamol pada sampel obat flu dengan
fase diam ODS (Oktadesil silika) yang nonpolar, maka parasetamol akan lebih dulu keluar dari
kolom atau tR lebih kecil daripada kafein. karena Kafein sifatnya nonpolar dan lebih terlarut
pada fase diam, sedangkan parasetamol bisa terlarut sedikit tapi hanya sebentar saja.
6
C. Proses Pemisahan atau Mekanisme Pemisahan
Penggunaan Kromatografi Kolom
1. Penyiapan Sampel
Sampel ditimbang kemudian dilarutkan dalam pelarut yang sesuai, lalu
dituangkan hati-hati diatas packing kolom. Fase gerak dikeluarkan tetes demi tetes,
diatur kecepatan menetesnya (tergantung besar-kecilnya kolom) dan dijaga kolom
tetap terendam, untuk itu ditambah fase gerak perlahan-lahan dan dijaga tidak
merusak packing kolom. Fase gerak yang keluar ditampung sebagai fraksi. Volume
fraksi tergantung berat sampel dan pemisahan yang nampak pada kolom saat proses
awal elusi ini. Makin kecil volume fraksi, akan diperoleh pemisahan yang lebih baik.
Cara meletakkan sampel pada kolom yang lebih baik adalah dengan mencampurnya
dengan fase diam. Satu bagian sampel dilarutkan dalam pelarut yang sesuai, biasanya
pelarut yang digunakan adalah pelarut yang digunakan untuk pembuatan ekstrak.
Larutan ekstrak ini kemudian dicampur dengan 2,0-3.0 bagian fase diam, dengan hati-
hati campuran ini dikeringkan didalam rotary evaporator hingga diperoleh serbuk
ekstrak kering. Serbuk ini ditaburkan diatas packing kolom dan ditutup dengan
selapis pasir. Selanjutnya sampel siap dielusi.
2. Elusi
Fase gerak dimasukkan kedalam kolom dengan cara dituangkan sedikit demi
sedikit atau dialirkan dari bejana yang diletakkan diatas kolom sehingga fase gerak
mengalir dengan sendirinya. Cara yang praktis adalah dengan memasukkan kedalam
corong pisah, ujung corong pisah dimasukkan kedalam kolom dan ujung lain tertutup,
sedangkan keran terbuka. Fase gerak akan keluar dengan sendirinya sesuai dengan
keluarnya fase gerak dari kolom.
Pada sistem partisi, ialah pemisahan komponen yang didasarkan atas perbedaan
polaritas pada fase diam. Sistem ini terjadi pada kromatografi yang menggunakan fase
diam dan fase bergeraknya berupa cairan, fase diam dan fase bergeraknya berupa gas,
fase diam berupa cairan sedangkan fase bergerak berupa gas, atau fase diam berupa gas
sedangkan fase diamnya berupa cairan.
7
1. Preparasi Bahan Penyangga
Untuk bahan penyangga berupa silica gel, bahan penyangga ini harus
dicampur dengan fase diam yang akan digunakan dengan perbandingan 0,5-1,0
bagian fase diam dengan 1,0 bagian bahan penyangga. Pencampuran harus baik,
misalnya dengan menggunakan mortar atau blender sehmgga akan dihasilkan
semacam pasta atau bubur yang tidak terlalu basah tetapi juga tidak kering. Fase
diam kemudian ditambahkan berlebihan pada pasta tersebut sehingga terjadi sluri.
Setelah itu sluri dimasukkan tabung, sluri diaduk dengan pengaduk berbentuk
cakram yang diameternya lebih kecil sedikit daripada diameter tabung. Pada pusat
cakram diberi tangkai panjang. Jika cakram dimasukkan ke dalam tabung dan
digerakkan berkali-kali sepanjang tabung ke atas dan ke bawah, maka cakram akan
dapat bergerak leluasa, dan sluri akan dapat bergerak melalui sela-sela cakram
dengan dinding tabung. Gerakan cakram harus perlahan-lahan, dilakukan beberapa
kali. Sesudah itu cakram diambil dan kelebihan fase diam dikeluarkan melalui mulut
tabung yang terletak di bagian dasar tabung.
Untuk kolom selulosa, maka bubuk selulosa direndam ke dalam aseton.
Campuran kemudian dituangkan ke dalam tabung. Kelebihan aseton dikeluarkan
melalui mulut tabung yang terletak di bagian dasar tabung. Kolom kemudian dicuci
dengan fase bergerak sampai terjadi keseimbangan. Kadang-kadang sebelum dicuci
dengan fase bergerak, dicuci terlebih dahulu dengan air berlebihan.
2. Teknik Elusi
Ada beberapa cara mengelusi sampel. Yang pertama dengan cara bertahap
(batch elution atau stepwise elution), yaitu mengelusi kolom dengan suatu jenis
pelarut (dapat merupakan campuran dua macam atau lebih pelarut) sampai sejumlah
volume eluat tertentu dikumpulkan, kemudian elusi dilanjutkan dengan jenis pelarut
lain dengan cara yang sama, demikian seterusnya dengan jenis pelarut yang lain lagi
sampai selesai. Keuntungan dengan menggunakan cara ini adalah mudah dilakukan
penyeimbangan (conditioning) kolom. Dengan demikian fraksi fraksi yang ingin
dipisahkan dapat dielusi dengan sesedikit mungkin eluen.
8
Cara yang kedua adalah mengalirkan eluen secara berterusan (continuous
elution). Hal ini dapat dilakukan dengan menggunakan pompa peristaltik atau secara
sederhana dengan meletakkan tangki penyedia freservoir) pelarut tepat di atas kolom.
Cara yang ketiga adalah mengelusi kolom dengan dua macam atau lebih
pelarut sekaligus dengan rasio yang berubah selama elusi. Cara ini lazim disebut
sebagai pengelusian bertingkat (gradient elution).
9
D. Analisis Kualitatif dan Kuantitatif
1. Analisis Kuantitatif
Komponen (eluat) yang diperoleh dapat diteruskan untuk ditetapkan kadarnya
dengan cara titrasi ataupun spektofotometri.
2. Analisis Kualitatif
Pergerakan komponen melalui kolom akan terjadi kesetimbangan baru antara
bahan penyerap, komponen campuran dan eluen. Kesetimbangan dikatakan tetap bila
suatu komponen yang satu dengan lainnya bergerak ke bagian bawah kolom dengan
waktu atau kecepatan berbeda-beda sehingga terjadi pemisahan dengan terbentuk pita-
pita (zona-zona) yang setiap zona berisi satu macam komponen (eluat). Setiap zona yang
keluar dari kolom dapat ditampung dengan sempurna sebelum zona yang lain keluar dari
kolom.
10
3. Dalam bidang clinical (klinik)
Kromatografi kolom sangat bermanfaat terutama dalam menginvestigasi fluida badan
antara lain:
a. Air liur
Dari air liur seorang pasien, dokter dapat mengetahui jenis penyakit yang sedang
diderita pasien tersebut. Seorang perokok dapat diketahui apakah dia termasuk
perokok berat atau ringan hanya dengan mengetahui konsentrasi CN- (sianida) dari
sampel air liurnya.
b. Air kencing
Dari air kencing dapat dideteksi jenis penyakit yang diderita oleh pasien yakni
mendeteksi senyawa oksalat. Demikian halnya air liur, air kencing, darah dan fluida
badan lainnya bisa memberikan data yang akurat dan cepat sehingga keberadaan
suatu penyakit dalam tubuh manusia dapat dideteksi secara dini dan cepat.
11
BAB III
PENUTUP
A. Kesimpulan
Berdasarkan pembahasan diatas maka dapat disimulkan bahwa :
1. Kromatografi kolom adalah kromatografi yang menggunakan kolom sebagai alat untuk
memisahkan komponen-komponen dalam campuran. Kromatografi Kolom adalah proses
pemisahan yang tergantung pada perbedaan distribusi campuran komponen antara fase
gerak dan fase diam.
2. Didasarkan pada absorbsi komponen-komponen campuran dengan afinitas berbeda
terhadap permukaan fase diam. Absorben bertindak sebagai fase diamdan fase geraknya
adalah cairan yang mengalir membawa komponen campuran sepanjang kolom. Sampel
yang mempunyai afinitas besar terhadap absorben akan secara selektif bertahan dan
afinitasnya paling kecil akan mengikuti aliran pelarut.
B. Saran
Diharapkan untuk mahasiswa agar lebih memahami materi tentang kromatografi
kolom agar dalam penerapannya tidak terdapat masalah ataupun kendala yang dapat
menghambat.
12