LAPORAN PRAKTIKUM PATOLOGI DAN KIMIA KLINIK

PRAKTIKUM III TES FUNGSI HATI

PENENTUAN BILIRUBIN TOTAL PADA SERUM

DOSEN PENGAMPU : I. K. PUTRA JULIANTARA, S.Pd.,M.Si

Hari, Tanggal Praktikum : 15 Juni 2019

Kelas A2D Farmasi Klinis

I Wayan Juniarsa (171200248)

PRAKTIKUM PATOLOGI DAN KIMIA KLINIK

PROGRAM STUDI FARMASI KLINIS
INSTITUT ILMU KESEHATAN
MEDIKA PERSADA BALI
2019

BAB I
 PENDAHULUAN

1.1 Tujuan Praktikum

1. Untuk penentuan kunatitatif secara in vitro dari total bilirubin dalam serum
1.2 Prinsip Praktikum
1. BILIRUBIN
Bilirubin diubah menjadi azobilirubin yang berwarna oleh asam diozotized
sulfanilic dan diatur secara fotometrik. Dari dua fraksi yang mengandung dalam serum,
bilirubin – glucoramide dan bilirubin bebas yang terikat ke albumin hanya yang
pertama bereaksi langsung dalam larutan cair (bilirubin langsung), sementara bilirubin
bebas yang membutukan solubilisasi dengan dimethylsulpoxide untuk bereaksi
(bilirubin tak langsung). Dalam penentuan bilirubin tak langsung, yang langsung (direct
bilirubin) juga dibersikan. Hasil sesuai dengan total bilirubin. Sesuai dengan total
bilirubin intensitas warna yang terbentuk sebanding dengan konsentrasi bilirubin
dalam.

BAB II
 DASAR TEORI

1.1 BILIRUBIN TOTAL

Pemeriksaan bilirubin total mengukur jumlah total bilirubin dalam darah untuk
mengevaluasi fungsi hati atau membantu diagnosis anemia yang disebabkan oleh
kerusakan sel darah merah (anemia hemolitik). Bilirubin merupakan komponen hasil
pemecahan sel darah merah yang sudah tua. Secara normal, bilirubin akan
dimetabolisme lalu dikeluarkan melalui feses dan urin. Bila terjadi kerusakan pada
hati, bilirubin dapat masuk ke dalam aliran darah. Peningkatan bilirubin dalam darah
dapat menyebabkan jaundice (warna mata dan kulit menjadi kuning), urin berwarna
gelap, atau feses berwarna lebih terang. Pemeriksaan bilirubin total menggunakan
sampel darah yang diambil dari pembuluh darah vena di lengan.( Israr, Y. A, 2010).
Bilirubin adalah produk penguraian hem: sebagian besar (85-90%) terjadi dari
penguraian hemoglobin dan sebagian kecil (10-15%) dari senyawa lain seperti
mioglobin. Sel retikuloendotel menyerap kompleks haptoglobin dengan hemoglobin
yang telah dibebaskan dari sel darah merah .Sel-sel ini kemudian mengeluarkan besi
dari hem sebagai cadangan untuk sintesis berikutnya dan memutuskan cincin hem
untuk menghasilkan tetrapirol bilirubin, yang disekresikan dalam bentuk tidak larut
air (bilirubin tidak terkonjugasi, indirek) sehingga bilirubin dalam plasma terikat ke
albumin untuk diangkut ke medium air. Pada saat bilirubin terikat pada plasma
beredar dalam tubuh dan melewati lobulus hati, hepatosit melepas bilirubin dari
albumin dan meyebabkan larut air dengan mengikat bilirubin ke asam glukuronat
(bilirubin terkonjugasi, direk) (Israr, Y. A, 2010).
Setelah bilirubin masuk ke dalam usus, bakteri kolon merubah bilirubin menjadi
urobilinogen (suatu istilah kolektif untuk beberapa senyawa tidak berwarna yang
kemudian mengalami oksidasi menjadi pigmen coklat urobilin). Urobilin disekresikna
ke dalam feses, tetapi sebagian urobilinogen direabsorpsi melalui usus dan melalui
sirkulasi portal diserap oleh hati dan direekskresikan dalam empedu. Karena larut air,
urobilinogen juga dapat keluar melalui urine apabila mencapai ginjal. (Sacher dan
McPherson, 2004)
 Gambar 1: Metabolisme Bilirubin

 Macam dan Sifat Bilirubin

a) Bilirubin terkonjugasi / direct
Bilirubin terkonjugasi /direct adalah bilirubin bebas yang bersifat larut
dalam air sehingga dalam pemeriksaan mudah bereaksi. Bilirubin
terkonjugasi (bilirubin glukoronida atau hepatobilirubin ) masuk ke saluran
empedu dan diekskresikan ke usus. Selanjutnya flora usus akan
mengubahnya menjadi urobilinogen (Israr, Y. A, 2010).
Bilirubin terkonjugasi bereaksi cepat dengan asam sulfanilat yang
terdiazotasi membentuk azobilirubin. Peningkatan kadar bilirubin direk atau
bilirubin terkonjugasi dapat disebabkan oleh gangguan ekskresi bilirubin
intrahepatik antara lain Sindroma Dubin Johson dan Rotor, Recurrent
(benign) intrahepatic cholestasis, Nekrosis hepatoseluler, Obstruksi saluran
empedu. Diagnosis tersebut diperkuat dengan pemeriksaan urobilin dalam
tinja dan urin dengan hasil negatif (Israr, Y. A, 2010).
b) Bilirubin tidak terkonjugasi / indirect
Bilirubin tak terkonjugasi (hematobilirubin) merupakan bilirubin bebas
yang terikat albumin, bilirubin yang sukar larut dalam air sehingga untuk
memudahkan bereaksi dalam pemeriksaan harus lebih dulu dicampur
dengan alkohol, kafein atau pelarut lain sebelum dapat bereaksi, karena itu
dinamakan bilirubin indirek. Peningkatan kadar bilirubin indirek
mempunyai arti dalam diagnosis penyakit bilirubinemia karena lemah
jantung akibat gangguan dari pengantaran bilirubin ke dalam peredaran
darah. Pada keadaan ini disertai dengan tanda-tanda lemah jantung, setelah
lemah jantung diatasi maka kadar bilirubin akan normal kembali dan harus
dibedakan dengan chardiac chirrhosis yang tidak selalu disertai
bilirubinemia (Israr, Y. A, 2010)

BAB III
ALAT DAN BAHAN
 3.1 Alat
a) Tabung reaksi
b) Mikropipet
c) Tissue
d) Kuvet
e) Spektrofotometer
f) Beaker glass
g) Yellow tip dan blue tip
h) Timer/Stopwatch
i) Water bath

3.2 Bahan
a) Aquadest
b) Sampel Serum darah Kode E
c) Larutan Standar
d) Larutan reagen

BAB IV
CARA KERJA

I. Cara Kerja
A. Pembuatan reagen Blank

Siapkan alat dan bahan yang diperlukan.

 Pipet dengan pipet mikro 1000 µL sebanyak 300 µL reagen 1
bilirubin total. Kemudian ambil 10 µL reagen 2.

Kemudian tutup tabung dan inkubasi pada dengan suhu ruangan

15-25oC selama 5 menit.

B. Pembuatan sampel Blank

Siapkan alat dan bahan yang diperlukan.

Pipet dengan pipet mikro 1000 µL sebanyak 300 µL reagen 1

bilirubin total.

Pipet reagen 2 sebanyak 10 µL. Kemudian masukan kedalam

tabung reaksi.

Kemudian campurkan reagen dan tutup tabung. Lakukan

inkubasi selama suhu 15-25oC selama 5 menit.

C. Pembuatan Sampel

Siapkan alat dan bahan yang diperlukan.

Pipet dengan pipet mikro sebanyak 300 µL reagen 1 bilirubin

total. Dan pipet 10 µL reagen 2.

Masukan kedalam tabung bersih. Kemudian ambil Sampel

serum darah Kode E sebanyak 20 µL dan masukan kedalam
tabung yang berisi reagen bilirubin total.
 Kemudian campurkan reagen dan tutup tabung dan inkubasi
pada suhu 15-25oC selama 5 menit.
D. Pemeriksaan dengan Spektrofotometri

Siapkan alat Spektrofotometer UV 1000, kemudian nyalakan

alat dengan menekan tombol “Power” pada alat. Dan atur
panjang gelombang 555 nm

Kemudian masukan reagen Blank yang telah di inkubasi 5

menit kedalam cuvet. Bersihkan sisi cuvet dengan tisu
dengan satu arah. Kemudian masukan kedalam
spektrofotometer pada kotak pertama

Kemudian masukan reagen sampel serum darah Kode E

yang telah dibuat diinkubasi selama 5 menit kedalam cuvet.
Bersihkan sisi cuvet dengan tisu dengan satu arah.
Kemudian masukan kedalam spektrofotometer pada kotak
ketiga.

Kemudian tutup dan tarik tuas 1x hingga bunyi “klik” untuk

menggeser reagen yang telah ditaruh didalam
spektrofotometer. Kemudian pada reagen Blank tekan “zero”
pada spektrofotometer.

Kemudian masukan sampel blank yang telah di inkubasi

selama 5 menit kedalam cuvet. Bersihkan sisi cuvet dengan
tisu dengan satu arah. Kemudian masukan kedalam

Kemudian tarik tuas 1x hingga bunyi “klik” untuk

menggeser reagen Blank ke reagen sampel blank dan catat
hasil yang ditunjukan dilayar.
 Kemudian tarik tuas 1x hinggaBAB V “klik” untuk menggeser
bunyi
reagen sample blankHASIL PRAKTIKUM
ke Sampel dan catat hasil yang
ditunjukan dilayar.

BAB V
HASIL PRAKTIKUM

5.1 Hasil Pengamatan

Keterangan Reagen Blank Sampel Blank Sampel

R1 300 ml 300 ml 300 ml
R2 10 ml - 10 ml
Standar - - -
 Sampel 20 ml - 20 ml

Larutan Nilai Absorbansi

Reagent blank 0
Sampel blank 1 0,009
Sampel blank 2 0,313
Sampel 1 0,024
Sampel 2 0,029

Rumus :
Bilirubin = (abs sampel – abs sampel blank) x faktor (19,1)
Sampel 1 = (0,024 – 0,09) x 19,1
= 0,015 x 19,1
= 0,2865 mg/dl
Sampel 2 = (abs sampel – abs blanko) x faktor (19,1)
= (0,029 – 0,013) x 19,1
= 0,3056 mg/dl

BAB VI
PEMBAHASAN

6.1 Bilirubin
Pada praktikum yang dilakukan, sampel darah yang dipakai adalah sampel K
(sampel yang digunakan adalah serum darah) dan dibuat larutan reagen blank, larutan
sampel blank dan larutan sampel. Percobaan kali ini tidak menggunakan larutan
standar blank dan larutan standar. Masing-masing larutan reagen dan sampel dibuat
oleh orang yang berbeda bertujuan untuk mengetahui apakah hasil yang didapatkan
sama ataukah berbeda.
Pada saat praktikum, semua larutan tidak perlu dipanaskan menggunakan
water bath, dikarenakan suhu 15-250C merupakan suhu ruangan, hanya ditunggu
selama 5 menit, kemudian akan dibaca dengan menggunakan spektrofotometer
dengan panjang gelombang 555 nm. Larutan blank merupakan larutan yang
digunakan sebagai kontrol atau sebagai nilai transmittan sebanyak 100% (Rizkiany,
2011). Larutan reagen blank yang digunakan dalam praktikum adalah reagen 1
sebanyak 300 ul dan reagen 2 sebanyak 10ul yang dilakukan untuk mengkalibrasi
spektrofotometr, larutan sampel blank yang digunakan dalam praktikum adalah
reagen 1 sebanyak 300ul dan sampel sebanyak 20ul. Larutan sampel merupakan
larutan yang akan digunakan untuk mengecek kadar bilirubin didalam darah. Lautan
sampel yang digunakan pada praktikum adalah campuran antara reagen 1 sebanyak
300 ul dengan reagen 2 sebanyak 10 ul dan dicampurkan dengan sampel sebanyak 20
ul.
Percobaan penentuan kadar bilirubin total didalam darah menggunakan
metode spektrofotometri dimana metode ini memiliki prinsip menggnakan cahaya
untuk mengetahui kadar bilirubin didalam darah. Terdapat dua cahaya yang ada pada
spektrofotometri, yaitu cahaya absorban dan cahaya transmittan. Cahaya absorban
merupakan cahaya yang tidak bergerak atau diam pada kuvet yang sudah mengandung
sampel yang akan dicek kadar bilirubin totalnya. Nilai yang keluar dari cahaya yang
diteruskan akan dinyatakan dalam suatu nilai yang disebut nilai absorbansi karena
nilai absorbansi memiliki hubungan dengan konsentrasi didalam sampel (Rizkiany,
2011). Cahaya transmittan merupakan cahaya yang bergerak atau melewati kuvet
yang sudah mengandung sampel.
Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu
sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Prinsip kerja spektrofotometer uv-vis
mengacu pada hukum Lambert-Beer. Apabila cahaya monokromatik melalui suatu
media, maka sebagian cahaya tersebut akan diserap, sebagian dipantulkan dan
sebagian lagi akan dipancarkan (Basset, 1994). Pada panjang gelombang inilah
diharapkan hasil yang didapat daya absorbansinya optimal. Pada saat menggunakan
alat spekrofotometer UV-Vis, kuvet yang akan digunakan harus dicuci bersih agar
tidak ada kontaminan. Adanya kontaminan menyebabkan pengukuran tidak tepat.
Pada saat memegang kuvet harus diperhatiakan cara memegangnya. Kuvet harus
dipegang pada bagian yang buram, karena jika dipegang pada bagian bening kuvet
maka dikhawatirkan akan mengganggu absorbansi, disebabkan oleh adanya protein
dari tangan kita yang mungkin tertinggal pada kuvet.

Konsentrasi bilirubin yang ada didalam darah memiliki nilai yang sama
dengan cahaya yang diam, maka perhitungan untuk konsentrasi bilirubin dapat
dirumuskan sebagai berikut:
 Berdasarkan hasil praktikum yang sudah didapatkan, maka dihasilkan nilai
larutan reagen blank adalah 0, nilai larutan sampel blank 1 adalah 0,009 dan nilai
larutan sampel adalah 0,024 Bilirubin Total didapatkan dengan mengurangi nilai
sampel dengan nilai sampel blank dan dikalikan faktor (19,1) . Sehingga, berdasarkan
data diatas kadar bilirubin total didalam darah didapatkan hasil sebesar 0.02865
mg/dL. Nilai normal Bilirubin total berada pada rentang 0,2-1,10 mg/dL. Nilai
bilirubin yang didapatkan saat praktikum tberada pada rentang nilai normal.

BAB VII
KESIMPULAN

Berdasarkan hasil praktikum dapat disimpulkan bahwa sampel yang digunaka

adalah sampel K (Serum Darah) dengan hasil pengukuran kadar bilirubin didalam
darah mendapatkan hasil yang vaild karena kadar yang didapatkan berada di normal
yaitu 0,02865 mg/dl. Hal tersebut sudah memenuhi.rentang bilirubin.
 DAFTAR PUSTAKA

Israr, Y. A, 2010, Metabolisme Bilirubin, Diakses dari bilirubin/ . diakses pada tanggal

10

Mei 2018

Rizkiany, H.N. 2011. Pendahuluan Spektrofotometer. Bogor: Institut Pertanian Bogor.

Sacher, Ronald A dan Richard A, McPherson, 2004. Tinjauan Klinis Hasil Pemeriksaan
Laboratorium, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.
LAMPIRAN