MODUL 8

PRAKTIKUM GENETIKA
AMPLIFIKASI DAERAH ITS 2 DARI DNA GENOM FABACEAE

PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik memperbanyak segmen DNA
dengan urutan tertentu secara in vitro dengan pemanjangan primer sebagai prekursor
memanfaatkan DNA polimerase. Proses ini disebut juga amplifikasi gen. Metode PCR pertama
kali diperkenalkan oleh Mulis et al. dari Cetus Corporation (Williams et al., 1988). Penggunaan
PCR sangat jarang dilakukan hingga ditemukan enzim DNA polimerase yang stabil di suhu tinggi,
salah satunya adalah Taq polymerase yang diisolasi dari bakteri termofilik yakni Thermus
aquaticus.
PCR dapat dimanfaatkan untuk mengisolasi gen maupun segmen tertentu dari keseluruhan
genom. Reaksi PCR merupakan reaksi yang meniru reaksi replikasi DNA dan terjadi di luar tubuh
organisme. Komponen utama dari PCR adalah
1. DNA templat
2. Primer (forward dan reverse)
3. dNTP (deoksinukleosida trifosfat)
4. buffer
5. DNA polimerase
DNA templat merupakan cetakan untuk perbanyakan DNA. Deoksinukleosida trifosfat
(dNTP) merupakan bahan untuk sintesis nukleotida (bulding blocks) yang membentuk DNA.
Buffer DNA polimerase merupakan larutan untuk menjaga pH larutan DNA polimerase dan
menstabilkan pembentukkan untai ganda DNA dengan menetralkan muatan untuk mencegah gaya
tolak menolak antara DNA karena muatan masing-masing untai DNA bermuatan negatif. Buffer
DNA polimerase umumnya juga mengandung Mg2+ yang merupakan kofaktor DNA polimerase
yang dapat meningkatkan spesifitas pengikatan DNA polimerase dengan DNA templat pada reaksi
elongasi. DNA polimerase merupakan enzim yang digunakan untuk reaksi sintesis untai DNA
yang baru. Primer merupakan oligonukleotida pendek yang mengawali reaksi polmerisasi DNA
dan dimanfaatkan sebagai batas dari segmen DNA yang akan diamplifikasi. Dalam reaksi PCR,
terdapat 2 macam PCR yakni primer forward dan primer reverse. Primer forward merupakan
primer yang urutannya sama seperti DNA sense (DNA yang urutannya sama seperti transkripnya),
sedangkan primer reverse merupakan primer yang urutannya merupakan reverse complement dari
DNA sense. Primer forward akan menempel pada DNA dengan orientasi 3’ → 5’, sedangkan
primer reverse akan menempel pada DNA dengan orientasi 5’ → 3’ (dapat dilihat pada Gambar
1).

Gambar 1. Primer forward dan primer reverse

 Secara umum, siklus PCR dibagi menjadi 3 tahap yakni denaturasi, annealing, dan ekstensi.
Pada tahap denaturasi DNA akan terbuka untai gandanya. Tahap ini pada umumnya terjadi pada
suhu 94-95°C. Pada tahap annealing, terjadi penempelan primer ke untai DNA. Suhu terjadinya
penempelan primer dapat terjadi bergantung pada melting temperature dari primer. Melting
temperature (Tm) adalah suhu di mana 50% dari molekul primer terdenaturasi atau berbentuk untai
tunggal. Nilai dari melting temperature akan bergantung pada urutan basa nukleotida pada primer.
Nilai annealing temperature pada umumnya dioptimasi terlebih dahulu dan bernilai pada
umumnya sekitar 3-5°C di bawah Tm primer terbawah. Temperatur annealing harus cukup rendah
agar primer dapat menempel pada DNA tetapi cukup tinggi agar tidak terbetuk ikatan yang tidak
spesifik primer dengan DNA templat (adanya pita tambahan pada hasil elektroforesis amplikon).
Pada tahap ekstensi DNA polimerase akan mensintesis DNA dengan menyambungkan dNTP ke
primer dari 5’ ke 3’. Enzim Taq polymerase akan menambahkan basa A (overhang A) pada ujung
3’ amplikon. Tahap ini dilakukan sesuai dengan suhu optimal enzim Taq polymerase yakni 72 °C.
Waktu tahap ekstensi akan bergantung dengan kecepatan enzim dalam mereplikasi DNA. Taq
polymerase memiliki kecepatan sintesis 1 kbp per menit. Jumlah reaksi yang direkomendasikan
jika menggunakan Taq polymerase adalah 25-30 siklus. Jumlah reaksi hingga 40 siklus diperlukan
jika DNA yang digunakan sangat kecil atau kurang dari 10 kopi. Satu reaksi PCR akan
menghasilkan 2 kopi segmen DNA. Program PCR biasa ditampilkan pada diagram PCR seperti
pada Gambar 2.

Gambar 2. Diagram PCR

PCR berbeda dari replikasi DNA. Pada replikasi DNA, untai ganda dibuka dengan bantuan
helikase dan SSB (single strand binding) protein. Pada replikasi DNA, primer disintesis oleh
enzim primase. Pada replikasi DNA, sintesis primer banyak terjadi pada lagging strand karena
arah pembukaan garpu replikasi berlawanan dengan arah sintesis DNA sehingga setiap sintesis
DNA harus dilakukan diperlukan primer baru. Hal ini menyebabkan sintesis DNA lagging strand
lebih lambat dari leading strand. Pada replikasi DNA, enzim DNA polimerase berjalan pada suhu
37°C, sedangkan pada PCR digunakan enzim DNA polimerase yang digunakan bersifat
termostabil. Pada PCR, fragmen yang direplikasi hanya sebagian dari genom sedangkan replikasi
DNA terjadi untuk mereplikasi seluruh genom. Pada PCR, tidak terdapat lagging strand maupun
terbentuknya fragmen Okazaki.
Pada PCR, suhu annealing primer dapat diubah-ubah sesuai kebutuhan. Primer yang baik
memiliki syarat-syarat tertentu. Panjang primer sekitar 18-22 bp. Melting temperature primer
sekitar 52-58°C Annealing temperature tidak boleh terlalu jauh dari melting temperature.
Kandungan GC berada di sekitar 40-60%. Kandungan GC yang tinggi akan meningkatkan melting
temperature karena basa G terikat oleh lebih banyak ikatan hidrogen dengan C dibandingkan A
dengan T. Primer yang didesain tidak boleh membentuk hairpin yang diakibatkan pada satu urutan
primer terdapat daerah yang saling komplemen sehingga primer itu dapat membentuk struktur
sekunder dengan primer itu sendiri, self dimer di mana urutan primer cocok dengan urutannya
sendiri sehingga membentuk dimer antara dua primer yang sama, dan cross dimer di mana urutan
primer forward dan reverse dapat berkomplemen sehingga membentuk dimer
ITS (Internal Transcribed Spacer) merupakan daerah di antara dua gen pengkode RNA
yang akan ditranskripsikan menjadi RNA ribosomal (rRNA). Pada tanaman secara umum, terdapat
3 macam rRNA yakni 5,8 S rRNA, 18 S rRNA dan 26 S rRNA (28 S rRNA pada hewan dan fungi).
Daerah di antara DNA pengkode 18 S rRNA dan 5,8 S rRNA disebut sebagai ITS 1, sedangkan
daerah di antara DNA pengkode 5,8 S rRNA dan 26 S rRNA disebut sebagai ITS 2. Daerah RNA
ribosomal dan spacernya pada eukariot tersusun dalam tandem repeats yang tersusun dari ribuan
kopi ITS. Setiap daerah RNA ribosomal beserta spacernya terpisah antarasatu dengan yang lain
oleh DNA yang tidak ditranskripsikan yang disebut intergenic spacer (IGS). Struktur daerah ITS
dapat dilihat pada Gambar 3. Daerah ITS umum digunakan dalam taksonomi dan filogenetik
molekular. Wilayah ITS memiliki ukuran yang kecil, mudah terdeteksi dari DNA dengan
konsentrasi kecil karena memiliki jumlah kopi yang tinggi akibat berada di kluster rRNA, wilayah
ini memiliki tingkat variasi yang tinggi antara spesies yang berkerabat dekat. ITS 2 pada Fabaceae
memiliki ukuran sekitar 500 bp.

Gambar 3. Struktur Daerah ITS

Tujuan
1. Mengamplifikasi daerah ITS 2 dari DNA genom Caesalpinia pulcherima, Delonix regia,
Calliandra sp., Crotolaria sp.
2. Mengonfirmasi keberadaan daerah ITS 2 pada amplikon dengan elektroforesis gel agarosa

Dasar Teori
 Penjelasan mengenai PCR
 Prinsip kerja dan fungsi setiap tahap dan setiap reagen dalam PCR
 Perbedaan PCR dan replikasi DNA secara alami
Alat & Bahan
Alat Bahan
PCR Go Taq Green Master Mix 2X
Ice box Primer forward (S2F :5’-ATG CGA TAC TTG
GTG TGA AT - 3’)
Mikropipet putih dan kuning Primer reverse (S3R : 5’ GAC GCT TCT CCA
GAC TAC AAT 3’)
Set elektroforesis agarosa Nuclease free water
Sentrifuga spindown DNA templat
Tips putih dan tips kuning
PCR tube 0,2 mL
TAE 1X
Agarosa
EtBr
DNA ladder 1 kb
Loading dye 6x

Cara Kerja
Amplifikasi ITS 2 (Internal Transcribed Spacer 2)
PCR tube 0,2 mL
 Ditambahkan ddH2O steril atau nuclease free water (NFW) sesuai campuran yang
diperlukan
 Ditambahkan primer forward dan primer reverse sesuai campuran yang diperlukan
 Ditambahkan master mix PCR sesuai campuran yang diperlukan
 Ditambahkan DNA template sesuai campuran yang diperlukan
 Dicampurkan dengan cara quick spin atau di-spindown
 Dimasukkan ke dalam mesin PCR yang telah dinyalakan
 Mesin PCR diatur program PCR-nya meliputi suhu dan durasi denaturasi awal, denaturasi,
annealing, ekstensi, ekstensi akhir beserta jumlah siklus yang digunakan
 Mesin PCR diatur volume total reaksi yang digunakan (35 µL)
Hasil PCR
 Tabel 1. Mix PCR
Konsentrasi
Komponen Volume
Akhir
Nuclease free water - 11,0 µL
Forward primer 10 µM 0,5 µM 1,75 µL
Reverse primer 10 µM 0,5 µM 1,75 µL
Go Taq Green Master Mix 2X (Taq 1X 17,5 µL
polymerase, buffer, MgCl2, dNTPs,
loading dye)
DNA template <250 ng 3,0 µL
TOTAL 35,0 µL

Tabel 2. Program PCR

Program PCR Suhu (°C) Waktu Siklus
Denaturasi awal 95 03:00 1
Denaturasi 95 00:30 30
Annealing 56 00:30
Ekstensi 72 01:00
Ekstensi akhir 72 05:00 1
Penyimpanan 4 ∞ ∞

Elektroforesis gel agarosa

1. Encerkan stok TAE 50X menjadi TAE 1x sebanyak 500 mL
2. Untuk membuat 1 % gel agarosa, campurkan 0.35 gram agarosa pada 35 mL buffer TAE
1x, panaskan dengan microwave hingga agarosa larut sempurna.
3. Setelah agak dingin, tuang larutan ke dalam cetakan gel yang telah dipasangi cetakan
sumur, lalu diamkan sampai gel mengeras.
4. Lepaskan cetakan sumur pada gel secara perlahan.
5. Letakkan gel beserta cetakanya pada tangki elektroforesis, lalu tuang buffer TAE 1x
yang, hingga seluruh permukaan gel terendam.
6. Masukkan campuran sampel DNA ladder 1 kb dan loading buffer ke dalam cetakan
sumur.
7. Masukkan hasil PCR sebanyak 5 µL ke dalam well pada gel agarosa
8. Hubungkan alat elektroforesis dengan sumber arus, dan nyalakan sumber arus (pada
tegangan 100 V, 26 menit) sampai loading dye tampak mencapai daerah sekitar 1/3 dari
ujung gel.
9. Matikan sumber arus.
10. Angkat gel, lakukan pewarnaan gel dengan larutan EtBr lalu rendam gel pada akuades,
amati pita DNA dengan menggunakan sinar UV.

Spek : gloves berwarna biru, jas lab bersih, tisu

Tugas Pendahuluan
(dikerjakan di lobook setelah daftar pustaka, tabel boleh diprint dan ditempel ke logbook, soal tidak
perlu ditulis ulang)
1. Anda telah mendapatkan DNA genom Asteraceae sebagai templat dalam amplifikasi daerah ITS 2
dengan konsentrasi 5 μg dalam 50 μL air bebas nuklease. Selain itu, asisten telah menyediakan stok larutan
yang diperlukan untuk reaksi PCR sebagaimana dijelaskan pada tabel dibawah. Hitunglah volume setiap
komponen larutan yang diperlukan untuk membuat 25 μL reaksi PCR, juga sertakan perhitungan yang
dilakukan pada kolom yang disediakan!
NO Nama Bahan Konsentrasi Konsentrasi Perhitungan Volume
stok akhir dalam larutan yang
reaksi diperlukan
1 Buffer PCR 10X 1X
Taq
2 dATP 10 mM 200 μM
3 dCTP 10 mM 200 μM
4 dGTP 10 mM 200 μM
5 dTTP 10 mM 200 μM
6. MgCl2 25 mM 2 mM

7 Primer 10 μM 0.2 μM
Forward
8 Primer 10 μM 0.2 μM
Reverse
9 Nuclease-free - -
water
10 Templat DNA 5 μg/50 μL 200 ng

11 Taq DNA 100 unit/100 1 unit/10 μL

Polymerase μL
 2. Jika asisten menginstruksikan praktikan untuk menggunakan Promega GoTaq® Green Master Mix
dalam reaksi PCR dengan DNA template seperti pada nomor 1, serta menyediakan reagen master mix
tersebut dalam konsentrasi 2X, tentukan komposisi dan volume larutan yang diperlukan untuk
membuat 25 μL reaksi PCR berdasarkan tabel campuran reaksi yang direkomendasi !
Jelaskan pula kegunaan masing-masing komponen yang menyusun GoTaq® Green Master Mix!
Komponen dari Konsentrasi akhir yang disarankan Konsentrasi akhir yang
digunakan
Go Taq Green Master Mix 2X 1X 1X
Primer forward 10 µM 0,1 – 1 µM 0,5 µM
Primer reverse 10 µM 0,1 – 1 µM 0,5 µM
DNA template < 250 ng 200 ng
Nuclease free water (NFW) - -