HASIL

Konstruksi plasmid dan transformasi kentang

Plasmid pBIrB mengandung gen BADH yang telah dikonstruksi, secara skematis
terlihat pada Gambar. 1. Tunas hijau yang diproduksi langsung dari permukaan irisan
microtuber setelah 4 minggu dikultur dalam medium selektif (Gambar.2). Akar terbentuk
sekitar 10 hari ketika tunas hijau dipindahkan ke media selektif untuk pertumbuhan akar
(Gambar 3). Plantlet dengan akar yang telah berkembang diperbanyak untuk analisis
molekuler lebih lanjut.

Gambar 1. Skema diagram dari ekspresi vektor pBIrB. Border kanan RB, Border kiri LB,
NOS-pro nopaline synthase promotor, NOS-pro ter nopaline synthase terminator, gen NPTII
neomycin phosphotransferase II, promotor induksi stress rd29A Arabidopsis thaliana, gen
BADH betaine aldehyde dehidrogenase, EcoRI, HindIII, BamHI, dan Sac1 sebagai situs
pengenal restriksi endonuklease.
Gambar. 2 Pembentukan tunas dari potongan mikrotuber transgenik asal kentang kultivar
Gannongshu 2 setelah 4 minggu di kultur di media selektif (media MS yang mengandung 1
mg l-1 IAA + 0,2 mg l-1 GA3+ 0,5 mg l-1 BA + 2 mg l-1 zeatin) yang dilengkapi dengan 75 mg
l-1 kanamisin dan 400 mg l-1 karbenisilin dan diinkubasi di bawah penyinaran dengan siklus
gelap 16 jam terang dan 8 jam pada 24°C.

Gambar. 3 Akar terbentuk pada hari ke-10 setelah tunas hijau dipindahkan ke media selektif
perakaran (media MS yang mengandung 50 mg l-1 kanamisin dan 200 mg l-1 karbenisilin). C
adalah tanaman kentang nontransgenik, 1-4 adalah tanaman kentang transgenik.

Analisis molekuler blotting

Analisis PCR menggunakan primer spesifik gen BADH menunjukkan bahwa tanaman
tanaman yang ditransformasikan diduga memiliki produk amplifikasi 853 bp yang tidak
dimiliki oleh tanaman kontrol. Hasil amplifikasi PCR dianalisis dengan analisis Southern blot,
yang menunjukkan bahwa gen BADH telah diintegrasikan ke dalam genom kentang
(Gambar.4). Ketika dianalisis menggunakan northern blot, ekspresi mRNA BADH dari daun
tanaman transgenik line 1 menunjukkan bahwa gen BADH diekspresikan lemah dalam
tanaman transgenik tanpa diberi stress sementara tidak ada transkrip dalam tanaman kontrol,
dan tingkat mRNA BADH meningkat terus seiring berjalannya waktu dengan jumlah
pemberian perlakuan NaCl dan PEG (Gambar 5). Tanaman transgenik line 2,3,dan 4
menunjukkan ekspresi serupa (data tidak ditampilkan).

Gambar. 4 analisis Southern blot DNA genom dari PCR-positif tanaman kentang. P adalah
kontrol positif, menunjukkan 1,56 kb penyisipan gen BADH diperoleh dari plasmid pBIrB
DNA yang telah dipotong dengan enzim BamHI, C adalah DNA genom dari tanaman kontrol
untransformasi, 1-4 adalah DNA genom dari tanaman yang telah bertransformasi. DNA
genom dipotong dengan SacI dan hibridisasi dengan probe penanda BADH dengan
digoksigenin.
Gambar. 5 Analisis Northern blot dari ekspresi gen BADH di tanaman kentang transgenik
line 1. Line C adalah tanaman kentang untransformasi, line 1 dan 2 adalah tanaman kentang
transgenik tanpa perlakuan, line 3 dan 4 adalah tanaman kentang transgenik yang diberi
perlakuan NaCl dan PEG selama 5 hari, line 5 dan 6 adalah tanaman kentang transgenik 3
hari setelah diberi perlakuan NaCl dan PEG selama 10 hari. Setiap line di elektroforesis 30
µg sampel RNA yang diwarnai dengan etidium bromida.

Aktivitas BADH dan konduktivitas listrik relatif dari tanaman transgenik

Aktivitas BADH dari tanaman transgenik rendah ketika tanaman tidak mengalami
stres, tetapi meningkat setelah 3 hari setelah pemberian NaCl dan PEG. Aktivitas BADH
antara 10,8 dan 11,7 U dan sedikit bervariasi di antara tanaman transgenik yang berbeda
(Tabel1). Hasil serupa dengan yang diamati dalam analisis northern blot.
Konduktivitas listrik relatif dari tanaman transgenik setelah pemberian stress berupa
pemberian NaCl dan PEG sekitar 17,4-19,6%, lebih rendah dari tanaman kontrol (45,6%), hal
tersebut dikarenakan membran sel tanaman transgenik yang kurang terluka dibandingkan
tanaman kontrol di bawah kondisi stress NaCl dan PEG. Sebuah hubungan linear negatif
yang signifikan antara konduktivitas relatif listrik (y) dan aktivitas BADH (x), dapat diwakili
oleh fungsi dari y = -2,2083x + 43,329 (r = 0,9495), mengungkapkan bahwa aktivitas BADH
terkait secara positif dengan perlindungan permeabilitas membran sel (Gambar. 6).
Tabel 1 Aktivitas BADH dari tanaman kentang transgenik yang diberi stres dengan NaCl
dan PEG

C adalah tanaman kentang untransformasi, 1-4 adalah tanaman kentang transgenik. Nilai
mewakili mean ± standar error (SE) dari tiga ulangan. Mean dalam kolom diikuti oleh huruf
kecil yang berbeda secara signifikan dengan tingkat probabilitas 0,05, dengan uji Duncan
multiple range.

Gambar. 6 Hubungan antara aktivitas BADH dan konduktivitas listrik relatif kentang
transgenik. Nilai aktivitas BADH dan konduktivitas listrik relatif diperoleh dari tanaman
transgenik 3 hari setelah 10 hari pemberian perlakuan stress berupa NaCl dan PEG.
Toleransi garam dan kekeringan tanaman kentang transgenik
Pertumbuhan tanaman kentang transgenik normal dan lebih baik daripada tanaman
yang tidak ditransformasi di bawah tekanan NaCl dan PEG. Tinggi tanaman transgenik
0,4-0,9 cm lebih tinggi dan 17-29% lebih berat (berat segar per tanaman) dibandingkan
dengan tanaman kentang kontrol (Gambar.7. 8). Hasil ini menunjukkan bahwa gen
BADH dapat meningkatkan toleransi terhadap kekeringan dan salinitas pada tanaman
yang kekurangan betaine melalui rekayasa genetik.

Gambar. 7 Tinggi tanaman kentang transgenik 3 hari setelah 10 hari diberi perlakuan NaCl
dan PEG. Tanaman ditumbuhkan dalam vermikulit di 3 pot L di rumah kaca di bawah
cahaya alami. Data adalah mean ± standard error (SE) dari tiga ulangan. C adalah tanaman
kentang nontransgenik, 1-4 adalah tanaman kentang transgenik.
Gambar. 8 Berat segar per tanaman kentang transgenik 3 hari setelah 10 hari diberi NaCl
dan PEG. Tanaman ditumbuhkan dalam vermikulit di 3 pot L di rumah kaca di bawah cahaya
alami. Data adalah mean ± standard error (SE) dari tiga ulangan. C adalah tanaman kentang
nontransgenik, 1-4 adalah tanaman kentang transgenik.

DISKUSI

Kentang dianggap sebagai tanaman yang sensitif terhadap kekeringan dibandingkan

dengan tanaman lainnya berdasarkan percobaan lapangan (Salter dan Goode 1967; van
Loon1981). Kekeringan selalu mempengaruhi perkembangan dan pertumbuhan batang, akar
dan umbi kentang (Ojala et al.1990) dan juga mengurangi jumlah umbi-umbian dan hasil
kentang (Cavagnaro et al. 1971). Rekayasa genetika telah menghasilkan tanaman kentang
yang memiliki toleransi terhadap kekeringan dan salinitas. Goddijn et al. (1997) melakukan
percobaan biosintesis trehalosa pada kentang (Solanum tuberosum) dengan memperkenalkan
gen otsA dan otsB dari Escherichia coli, yang dikodekan oleh sintase trehalosa-6-fosfat dan
fosfatase trehalosa-6-fosfat secara berurutan. Jeong et al (2001), memperkenalkan gen
glyseraldehid-3-fosfat dehidrogenase ke dalam kentang melalui rekayasa genetik. Tanaman
kentang transgenik menunujukan beberapa tingkat toleransi terhadap salinitas.

GB adalah osmoprotektan yang ditemukan di beberapa organisme, termasuk

tumbuhan tingkat tinggi. Banyak spesies tanaman yang mengakumulasi senyawa betaine
sebagai respon dalam menanggapi kekeringan dan salinitas. Akumulasi GB telah lama
menjadi target penelitian yang bertujuan untuk tanaman rekayasa genetik yang resisten
terhadap stres (Le Rudulier et al.1984). Tanaman kentang tidak mampu mensintesis betaine.
Oleh karena itu, dilakukan percobaan untuk meningkatkan tingkat toleransi kekeringan dan
salinitas kentang transgenik dengan memperkenalkan gen BADH terkait dengan sintesis GB
ke dalam kentang.

Dalam percobaan sebelumnya, cDNA yang dikodekan oleh gen BADH diisolasi dari
bayam (Spinacia oleracea L.) (Zhang et al, 2004) dan promotor pemicu stres rd29A diisolasi
dari Arabidopsis thaliana (Zhang et al. 2005). Dalam penelitian ini, kami membentuk vektor
rekombinan pBIrB yang mengandung gen BADH di bawah kendali promotor rd29A, dan
disisipkan ke tanaman kentang transgenik. Untuk menyelidiki toleransi kekeringan dan
salinitas pada tanaman kentang transgenik BADH, empat buah kentang transgenik
independen diseleksi melalui identifikasi molekuler.Pada kedua pengamatan, yaitu analisis
blot utara dan uji aktivitas BADH menunjukkan bahwa gen BADH diinduksi oleh NaCl dan
tekanan PEG setelah gen BADH diinduksikan dan dikontrol oleh promotor rd29A. Ketika
tanaman yang ditanam di dalam pot terkena NaCl dan tekanan PEG, semua tanaman
transgenik menunjukkan tingkat toleransi kekeringan yang tinggi dan salinitas dibandingkan
dengan tanaman kontrol. Percobaan ini mirip dengan hasil penelitian yang diuraikan oleh
Ahmad et al. (2008). Mereka memperoleh tanaman kentang transgenik dengan peningkatan
toleransi dari NaCl dan cekaman kekeringan pada tanaman dengan memperkenalkan gen
oksidase kolin bakteri (codA) untuk mensintesis GB dibawah kendali promotor pemicu
tekanan SWPA2. Hasil ini menunjukkan bahwa rekayasa sintesis GB, terutama melalui
penggunaan promotor induksi tekanan seperti SWPA2 dan rd29A, adalah cara yang efektif
untuk meningkatkan tingkat toleransi tekanan ke tanaman kentang. Namun, pekerjaan ini
dilakukan dengan menggunakan gen BADH dari bayam, yang lebih disukai untuk biosafety
transgenik dibandingkan gen codA dari bakteri.
GB merupakan senyawa amfoter yang memiliki pH netral dan tidak beracun.
Meskipun peran sebenarnya dari GB sebagai osmotolerance tanaman dikatakan
kontroversial, GB diduga mampu melindungi tanaman dengan bertindak sebagai osmolit
yang mempertahankan keseimbangan air antara sel tumbuhan dan lingkungan, dan dengan
menstabilkan makromolekul, aktivitas enzim, dan membran dalam kondisi stres (Sakamoto
dan Murata 2002; Chen dan Murata 2008). Hasil penelitian menunjukkan bahwa tanaman
kentang transgenik yang diperoleh meningkatkan toleransi terhadap kekeringan dan cekaman
salinitas melalui stabilisasi membran, karena tanaman transgenik menunjukkan konduktivitas
listrik relatif lebih rendah dibandingkan tanaman kontrol di bawah pengaruh NaCl dan
tekanan PEG. Pada penelitian ini juga dibuktikan bahwa tanaman transgenik yang dihasilkan
memiliki peningkatan pada tinggi tanaman dan bobot bersih tanaman dibawah pengaruh
tekanan dibandingkan tanaman kontrol (Gambar 7, 8). Demikian pula, tanaman kentang
transgenik dengan gen codA untuk sintesis GB menunjukkan peningkatan bobot segar dan
kering tanaman dan hasil umbi pada percobaan di dalam pot tanaman (Ahmad et al.2008),
dan tanaman tomat transgenik dengan gen codA menunjukkan bunga membesar dan buah-
buahan yang matang lebih berat (Park et al. 2007).

KESIMPULAN

Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa gen BADH dapat digunakan untuk
meningkatkan toleransi kekeringan dan cekaman salinitas pada tanaman yang kekurangan
senyawa betaine melalui rekayasa genetika. Penelitian lebih lanjut diharapkan akan
menentukan dampak dari pengenalan gen BADH ke tanaman kentang untuk agronomi dan
umbi yang dihasilkan.