ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI

Listeria monocytogenes DARI SUSU SAPI SEGAR

DI KABUPATEN ENREKANG SULAWESI SELATAN

KUSUMANDARI INDAH PRAHESTI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016
 PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Isolasi dan Identifikasi
Bakteri Listeria monocytogenes dari Susu Sapi Segar di Kabupaten Enrekang
Sulawesi Selatan adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing
dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun.
Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun
tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan
dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.

Bogor, November 2016

Kusumandari Indah Prahesti

NIM B253130011
 RINGKASAN

KUSUMANDARI INDAH PRAHESTI. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Listeria

monocytogenes dari Susu Sapi Segar di Kabupaten Enrekang Sulawesi Selatan.
Dibimbing oleh FACHRIYAN HASMI PASARIBU dan NI LUH PUTU IKA
MAYASARI.

Listeria monocytogenes merupakan salah satu bakteri patogen yang

mendapat perhatian dalam industri pangan dan kesehatan masyarakat. Bakteri ini
menginfeksi manusia melalui bahan pangan sehingga menimbulkan penyakit
listeriosis. Kajian epidemiologi pada sejumlah wabah listeriosis yang disebabkan
oleh L. monocytogenes memberikan indikasi bahwa susu dan produk susu
merupakan bahan pangan yang potensial terhadap kontaminasi dan transmisi L.
monocytogenes ke manusia. Kabupaten Enrekang merupakan salah satu wilayah
yang menjadi priotitas pengembangan peternakan sapi perah di Propinsi Sulawesi
Selatan. Pemerahan susu umumnya dilakukan secara manual oleh peternak, yang
memungkinkan terjadinya kontaminasi pada susu segar yang dihasilkan, namun
belum ada informasi terjadinya kontaminasi L. monocytogenes pada susu segar
yang dihasilkan. Oleh karena itu diperlukan penelitian tentang keberadaan L.
monocytogenes dan karakterisasi bakteri tersebut pada susu sapi segar di
Kabupaten Enrekang.
Sebanyak 107 contoh susu segar dikumpulkan dari lima kecamatan di
Kabupaten Enrekang dan digabungkan ke dalam 31 sampel pool untuk dilakukan
isolasi dan identifikasi bakteri. Tahap pengayaan dilakukan dalam media Listeria
Enrichment Broth (LEB) kemudian dilakukan kultur pada media Listeria Selective
Agar Base (LSA), dilanjutkan dengan uji biokimiawi. Isolat L. monocytogenes
yang diperoleh dikonfirmasi dengan metode polymerase chain reaction (PCR)
kemudian dilakukan pengurutan oligonukleotida. Identifikasi serotype dilakukan
dengan PCR multipleks.
Hasil penelitian menunjukkan keberadaan L. monocytogenes pada 21 isolat
sampel yang berhasil dikonfirmasi dengan PCR. Analisa pengurutan
oligonukleotida dari isolat L. monocytogenes yang diperoleh pada penelitian ini
menunjukkan persentase nilai kemiripan sebesar 99% dengan strain L.
monocytogenes yang terdapat pada basis data di GenBank. Identifikasi serotipe
menunjukkan bahwa keseluruhan 21 isolat tersebut termasuk dalam serogrup 2,
yaitu serotipe 1/2c dan 3c.

Kata kunci: Listeria monocytogenes, susu segar, isolasi dan identifikasi, serotipe,
PCR.
 SUMMARY

KUSUMANDARI INDAH PRAHESTI. Isolation and Identification of Listeria

monocytogenes from Raw Milk in Enrekang District South Sulawesi. Supervised
by FACHRIYAN HASMI PASARIBU and NI LUH PUTU IKA MAYASARI.

Listeria monocytogenes is a pathogenic bacteria which was concerned in

food industry and public health. This bacteria infects human through food, causing
listeriosis. Epidemiology study on listeriosis outbreaks indicated that milk and
milk products are potential for L. monocytogenes contamination and transmission
to human. Enrekang district is one of priority areas for dairy farm development in
South Sulawesi. Farming was done traditionally and the milking process was done
manually, which enable contamination to the milk. The aims of this study were to
isolate L. monocytogenes in raw milk in Enrekang District, South Sulawesi, to
analyze the molecular characterization of L. monocytogenes, and to determine the
bacteria serotypes.
A total of 107 raw milk samples were collected from five sub-districts in
Enrekang and pooled into 31 pool for further isolation and identification of the
bacteria. Enrichment cultures in Listeria Enrichment Broth (LEB) were done prior
to plating on Listeria Selective Agar Base (LSA) media and followed by
biochemical tests. Isolated L. monocytogenes were confirmed by polymerase
chain reaction (PCR) and the PCR products were sequenced. Multiplex PCR was
applied for molecular serotyping of the isolated L. monocytogenes.
Result showed that L. monocytogenes were found in 21 samples and were
confirmed by PCR. The DNA sequence analysis showed that the isolates found in
this study have 99% similiarity with L. monocytogenes strains in GenBank
database. Molecular serotyping showed that all 21 isolates belong to serogroup 2,
comprising serotype 1/2c and 3c.

Keywords: Listeria monocytogenes, fresh milk, isolation and identification,

serotyping, PCR.
 © Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB

Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
 ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI
Listeria monocytogenes DARI SUSU SAPI SEGAR
DI KABUPATEN ENREKANG SULAWESI SELATAN

KUSUMANDARI INDAH PRAHESTI

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Mikrobiologi Medik

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr Drh Agustin Indrawati, M Biomed
 PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan April 2015 ini adalah
tentang bakteri Listeria monocytogenes, dengan judul Isolasi dan Identifikasi
Bakteri Listeria monocytogenes dari Susu Sapi Segar di Kabupaten Enrekang
Sulawesi Selatan.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Prof Dr Drh Fachriyan Hasmi
Pasaribu dan Ibu Dr Drh Ni Luh Putu Ika Mayasari selaku pembimbing dalam
penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Penulis juga mengucapkan terima
kasih kepada ketua Lab Mikrobiologi dan Ketua Lab Bioteknologi Terpadu
Fakultas Peternakan Unhas, kepada laboran Lab Divisi Mikrobiologi Medik dan
laboran Lab Pendidikan dan Layanan FKH IPB. Selanjutnya kepada seluruh staf
dosen, pegawai, dan rekan–rekan mahasiswa Prodi Mikrobiologi Medik.
Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu, suami, ibu
mertua, serta seluruh keluarga, atas segala doa, dukungan, dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, November 2016

Kusumandari Indah Prahesti

 DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL vii

DAFTAR GAMBAR vii
DAFTAR LAMPIRAN vii
1 PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 1
Perumusan Masalah 2
Tujuan Penelitian 2
Hipotesis Penelitian 2
2 TINJAUAN PUSTAKA 3
Karakter Listeria monocytogenes 3
Patogenesis Listeria monocytogenes 5
Virulensi Listeria monocytogenes 7
Listera monocytogenes pada Bahan Pangan 8
Serotipe Listeria monocytogenes 9
3 METODE 10
Waktu dan Tempat 10
Pengambilan Contoh Susu Segar 10
Isolasi dan Identifikasi Listeria monocytogenes dari Susu Segar 11
Kultur pada Media Agar Darah dan Uji Biokimiawi 11
Ekstraksi DNA 11
Identifikasi Gen Hemolisin (hly) dan Gen Invasive Associated
Protein (iap) 12
Identifikasi Serotipe Listeria monocytogenes dengan Metode PCR 13
Pengurutan Oligonukleotida (Sekuensing) DNA 13
Pengurutan Oligonukleotida Parsial Gen hly dari Listeria
monocytogenes 13
Analisa Hasil Pengurutan Oligonukleotida 14
Analisa Data 14
4 HASIL DAN PEMBAHASAN 14
HASIL 14
Pengambilan Contoh Susu Segar 14
Isolasi dan Identifikasi Listeria monocytogenes dari Susu Segar 15
Kultur pada Media Agar dan Uji Biokimiawi 15
Kualitas DNA Bakteri Hasil Ekstraksi 17
Identifikasi Parsial Gen iap dan hly dari Listeria monocytogenes 17
Identifikasi Serotipe Isolat Listeria monocytogenes 20
Keberadaan Listeria monocytogenes pada Susu Sapi Segar di
Kabupaten Enrekang 22
Pengurutan Oligonukleotida Listeria monocytogenes 23
Pengurutan Oligonukleotida Parsial Gen hly dari
Listeria monocytogenes 23
 DAFTAR ISI (lanjutan)

PEMBAHASAN 25
5 KESIMPULAN DAN SARAN 27
Kesimpulan 27
Saran 27
DAFTAR PUSTAKA 28
LAMPIRAN 30
RIWAYAT HIDUP 38
 DAFTAR TABEL
1 Klasifikasi Listeria monocytogenes 3
2 Diferensiasi karakteristik Listeria spp. 4
3 Identifikasi spesies L. monocytogenes melalui prosedur PCR 5
4 Komposisi antigen somatik (O) dan antigen flagelar (H) pada serotipe L.
monocytogenes 9
5 Primer yang digunakan untuk identifikasi spesies L. monocytogenes 12
6 Primer yang digunakan untuk identifikasi serotipe L. monocytogenes 13
7 Lokasi dan jumlah contoh susu segar yang diambil dari 5 kecamatan di
Kabupaten Enrekang 14
8 Hasil uji biokimiawi dari isolat L. monocytogenes ATCC 7644 dan 24
isolat sampel diduga L. monocytogenes 16
9 Resume hasil identifikasi L. monocytogenes dengan metode kultur
konvensional dan PCR 20
10 Asal sampel dan jumlah isolat yang terdeteksi L. monocytogenes 22
11 Analisa kemiripan urutan oligonukleotida isolat sampel L.
monocytogenes dengan basis data GenBank 21

DAFTAR GAMBAR
1 Skema invasi intraseluler L. monocytogenes 7
2 Skema posisi primer iap dan HlyA pada Genom L. monocytogenes 12
3 Hasil kultur pada media LSA 15
4 Hasil pewarnaan Gram 16
5 Hasil elektroforesis produk PCR menggunakan primer iap 18
6 Hasil elektroforesis produk PCR menggunakan primer hlyA 19
7 Hasil elektroforesis produk PCR multipleks 21
8 Kondisi kandang tempat pengambilan sampel susu segar 23
9 Hasil persejajaran nukleotida isolat sampel dengan beberapa strain L.
monocytogenes yang terdapat pada basis data GenBank 22

DAFTAR LAMPIRAN
1 Hasil pengukuran kualitas DNA bakteri hasil ekstraksi 30
2 Hasil pengurutan oligonukleotida dari isolat kontrol positif L.
monocytogenes ATCC 7644 dan isolat sampel 18A, 18B, 20, 25A, dan
25B 31
3 Kromatogram isolat kontrol positif L. monocytogenes ATCC 7644 32
4 Kromatogram isolat sampel 18A 33
5 Kromatogram isolat sampel 18B 34
6 Kromatogram isolat sampel 20 35
7 Kromatogram isolat sampel 25A 36
8 Kromatogram isolat sampel 25B 37
 1 PENDAHULUAN

Latar Belakang

Listeria monocytogenes merupakan salah satu bakteri patogen yang

mendapat perhatian dalam industri pangan dan kesehatan masyarakat. L.
monocytogenes terdapat secara luas ditanah, tumbuhan, air permukaan, serta
ditemukan pula pada silase, saluran pembuangan, dan limbah rumah potong, susu
sapi, dan feses hewan serta manusia. Bakteri ini menginfeksi manusia melalui
bahan pangan sehingga menimbulkan penyakit listeriosis. Kajian epidemiologi
pada sejumlah wabah listeriosis yang disebabkan oleh L. monocytogenes
memberikan indikasi bahwa susu dan produk susu merupakan bahan pangan yang
potensial terhadap kontaminasi dan transmisi L. monocytogenes ke manusia.
Sumber cemaran L. monocytogenes pada susu dan produknya dapat ditemukan
pada rantai pengolahan pangan, termasuk pada susu mentah yang baru diperah,
lingkungan, peralatan, alat pengemas, pengelolaan sampah, hingga higiene
karyawan yang terlibat (Lovett dan Twedt 2004). Sanjaya et al. (2007)
menyebutkan bahwa cemaran mikroba pada susu dapat terjadi pada ambing, alat
penampung susu, alat penyimpan susu, rantai transportasi, industri pengolahan,
sampai dengan konsumen. Hewan ternak yang terinfeksi oleh L. monocytogenes
akan melepaskan bakteri tersebut melalui susu, darah, dan fesesnya. Donnely
(2001) menyebutkan sapi dan domba yang terinfeksi oleh L. monocytogenes tanpa
disertai gejala klinis dapat melepaskan sel L. monocytogenes pada susu segar yang
dihasilkannya.
Pada manusia, kelompok beresiko tinggi terhadap listeriosis adalah wanita
hamil, bayi dalam kandungan, dan individu yang mengalami gangguan sistem
kekebalan (Garbutt 1997). Kasus kematian pada manusia akibat L. monocytogenes
dilaporkan terjadi di beberapa negara Eropa, antara lain di Irlandia pada tahun
2000 ditemukan satu kasus kematian pada manusia karena meningitis.Di Amerika
Serikat juga dilaporkan adanya 425 kasus kematian dari 1.850 kasus listeriosis
pada manusia. Diperkirakan setiap tahun terjadi 2500 kasus listeriosis pada
manusia di Amerika Serikat (FSAI 2005). Di Indonesia belum tersedia data
maupun laporan yang mencatat kejadian listeriosis pada manusia. Keberadaan L.
monocytogenes pada susu segar di Indonesia juga belum tercatat, data yang ada
sifatnya terbatas untuk penelitian. Yuliati dan Malaka (2013) telah melakukan
isolasi dan mengamati karakteristik pertumbuhan L. monocytogenes pada susu
segar dengan penyimpanan pada suhu 4oC. Isolat diperoleh dari susu segar yang
dikoleksi dari peternakan sapi perah di Makassar, Sulawesi Selatan. Penelitian
tersebut menunjukkan perbedaan pembentukan filamen dan pigmen secara
perlahan setelah dilakukan penyimpanan susu pada suhu 4 oC. Perbedaan
pembentukan filamen ini kemungkinan disebabkan oleh adanya perbedaan
serotipe bakteri tersebut. Sugiri et al. (2013) melakukan identifikasi serotipe L.
monocytogenes yang diisolasi dari daging ayam segar di pasar tradisional dan
supermarket di Bandung, Jawa Barat. Penelitian tersebut menunjukkan bahwa
seluruh isolat L. monocytogenes yang diisolasi termasuk dalam serogrup 1/2b, 3b,
dan 7. Serotipe spesies L. monocytogenes ditentukan oleh keberadaan protein
2

permukaan yang spesifik, yaitu antigen somatik (O) dengan 15 subtipe dan
antigen flagelar (H) dengan 4 subtipe. Serotipe spesifik Listeria ditentukan oleh
kombinasi spesifik antara antigen O dan antigen H, menghasilkan 12 serotipe L.
monocytogenes, yaitu 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, dan 7
(Seeliger dan Jones 1986). Penelitian telah membuktikan bahwa hanya serotipe
1/2a, 1/2b, dan 4b yang menjadi 98% penyebab terjadinya wabah listeriosis pada
manusia (Wiedmann et al. 1996, Jacquet et al. 2002).

Perumusan Masalah

Epidemiologi L. monocytogenes sangat penting bagi kesehatan manusia

berkaitan dengan terjadinya wabah listeriosis yang disebabkan kontaminasi
bakteri ini pada berbagai bahan pangan yang dikonsumsi manusia, termasuk
daging, susu dan produk susu. Kabupaten Enrekang merupakan salah satu wilayah
yang menjadi priotitas pengembangan peternakan sapi perah di Propinsi Sulawesi
Selatan dengan populasi sapi perah sebanyak 1200 ekor pada tahun 2014. Populasi
terbesar, yaitu sebanyak hampir 50% dari total populasi sapi perah terdapat di
Kecamatan Cendana. Usaha ternak dilakukan secara tradisional dan umumnya
pada skala kecil (3–8 ekor) dengan produktivitas harian 5–8 liter/ekor/hari.
Pemerahan susu umumnya dilakukan secara manual oleh peternak, yang
memungkinkan terjadinya kontaminasi pada susu segar yang dihasilkan, namun
belum ada informasi terjadinya kontaminasi L. monocytogenes pada susu segar
yang dihasilkan. Oleh karena itu diperlukan penelitian tentang keberadaan L.
monocytogenes dan karakterisasi bakteri tersebut pada susu sapi segar di
Kabupaten Enrekang.

Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah mengisolasi bakteri L. monocytogenes dari susu

sapi segar di Kabupaten Enrekang Sulawesi Selatan, melakukan karakterisasi
secara molekuler terhadap isolat yang diperoleh, dan menentukan serotipenya.

Hipotesis Penelitian

Hipotesis penelitian ini adalah bakteri L. monocytogenesdapat diisolasi

dari susu sapi segar di Kabupaten Enrekang, Sulawesi Selatan, secara genetik
memiliki kesamaan dengan beberapa strain L. monocytogenes yang terdapat pada
basis data di GenBank, dan memiliki serotipe yang sama dengan yang sudah
pernah ditemukan di Indonesia.
 3

2 TINJAUAN PUSTAKA

Karakter Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes merupakan bakteri batang Gram-positif,

berukuran diameter 0.5 μm dan panjang 1–2 μm, tidak membentuk spora, serta
bersifat fakultatif anaerob yang tumbuh pada suhu -4 sampai dengan 50 oC.
Bakteri ini bersifat katalase positif, oksidase negatif, H2S negatif, dan
menghasilkan β-hemolysin yang membentuk zona bening pada agar darah (Farber
dan Peterkin 1991, Gyles et al. 2010, Liu 2006). L. monocytogenes membentuk
reaksi Christie, Atkins, and Munch-Petersen (CAMP) dengan hemolisin dari
bakteri Staphylococcus aureus. Bakteri ini bersifat motil bila ditumbuhkan pada
suhu 20–25oC dengan adanya pertumbuhan flagela peritrikus. Flagela tersebut
tidak terbentuk bila bakteri ditumbuhkan pada suhu tubuh 35–37 oC (Gyles et al.
2010).
Genus Listeria termasuk dalam kelas Bacilli dan ordo Bacillales. Enam
spesies yang termasuk dalam genus Listeria adalah L. monocytogenes, L. innocua,
L. seeligeri, L. welshimeri, L. ivanovii, dan L. grayi. Dari keenam spesies tersebut,
L. monocytogenes dan L. ivanovii yang bersifat patogen. L. ivanovii menginfeksi
hewan namun jarang ditemukan pada manusia sedangkan L. monocytogenes
menginfeksi hewan dan manusia (Liu 2006). Klasifikasi L. monocytogenes
ditampilkan pada Tabel 1. L. monocytogenes terdapat secara luas ditanah,
tumbuhan, air permukaan, serta ditemukan pula pada silase, saluran pembuangan
dan limbah rumah potong, susu sapi, dan feses hewan serta manusia. L.
monocytogenes telah diisolasi dari sapi, kambing, dan unggas, namun jarang
ditemukan pada hewan liar (Farber dan Peterkin 1991).

Tabel 1 Klasifikasi L. monocytogenes

Kerajaan : Bacteria
Divisi : Firmicutes
Kelas : Bacilli
Ordo : Bacillales
Famili : Listeriaceae
Genus : Listeria
Spesies : Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes dapat dibedakan dari spesies Listeria lainnya

melalui uji Christie, Atkins, and Munch-Petersen (CAMP) dan reaksi fermentasi
karbohidrat. Pine et al. (1989) menyatakan bahwa L. monocytogenes dan L.
innocua memfermentasi glukosa, laktosa, dan rhamnosa pada kondisi anaerob; L.
grayi dan L. murrayi memfermentasi galaktosa; dan hanya spesies L.ivanovii dan
L. seeligeri yang memfermentasi xylosa. Diferensiasi karakteristik spesies Listeria
spp. ditunjukkan pada Tabel 2. Kemampuan menghemolisa darah merupakan
salah satu karakter L. monocytogenes yang dapat dibedakan dengan lima spesies
genus Listeria lainnya yaitu L. ivanovii, L. innocua, L. welshimeri, L. seeligeri dan
L. grayi. Hanya tiga spesies yang mempunyai kemampuan hemolitik, yaitu L.
monocytogenes, L. seeligeri dan L. ivanovii.
4

Tabel 2 Diferensiasi karakteristik Listeria spp.a

Spesies Listeria
Karakteristik L. L. L. L. L.
monocytogenes innocua ivanovii welshimeri seeligeri
β-hemolisis + – + – +
Uji CAMP
S. aureus + – – – +
R. equi – – + – –
Fermentasi
α-metil-D- + + – + –
mannoside
rhamnosa + vb – vb –
xylosa – – + + +
Virulensi pada + – – – –
mencit
a
Sumber: Farber dan Peterkin 1991
b
v: beragam

Identifikasi spesies L. monocytogenes telah banyak dilakukan melalui

pengujian molekuler. Liu (2006) menyebutkan metode molekuler yang paling
banyak digunakan untuk identifikasi L. monocytogenes adalah metode amplifikasi
asam nukleat yaitu Polymerase Chain Reaction (PCR). Metode PCR mampu
mengamplifikasi target spesifik sehingga memberikan hasil yang sangat spesifik,
sensitif, cepat, dan mudah untuk deteksi L. monocytogenes terhadap spesimen
yang diuji. Produk DNA yang sudah diamplifikasi dapat divisualisasi dengan
elektroforesis gel agarose dan UV transluminator, untuk kemudian dideteksi
menggunakan metode DNA stain, DNA sequencing, microarray analysis, dan
sebagainya. Tabel 3 menunjukkan gen–gen target yang digunakan untuk
identifikasi spesies L. monocytogenes yaitu gen 16S dan 23S rRNA, intergenic
spacer regions, hly, inlA, inlB, iap, dan gen-gen lainnya (Liu 2006).
 5

Tabel 3 Identifikasi spesies L. monocytogenes melalui prosedur PCRa

Spesies Gen Target Protein
Listeria gen 16S rRNA
monocytogenes gen 23S rRNA
16S/23S rRNA
intergenicregions
hly LLO
plcA PI-PLC
plcB PC-PLC
actA ActA
prfA Transcriptional regulator PrfA
inlA Internalin A
inlB Internalin B
iap Invassion associated protein
lma/dth18 LmA antigen/delayed-type
hypersensitivity protein
fbp Fibronectin-binding protein
flaA Flagellin A
pepC Aminopeptidase C
clpE ClpATPase
lmo0733 Putative transcriptional regulator
a
Sumber: Liu 2006

Patogenesis Listeria monocytogenes

Infeksi L. monocytogenes yang bersifat invasif menyebabkan penyakit

listeriosis. Terdapat dua bentuk gejala klinis yang diakibatkan oleh infeksi L.
monocytogenes yaitu listerial gastroenteritis/gastrointestinal illness (bentuk
saluran pencernaan) dan invasive listeriosis (bentuk invasif). Pada listerial
gastroenteritis, gejala klinis ditandai dengan mual, muntah, kram perut dan diare
yang akan tampak setelah tertelannya bakteri selama lebih dari 12 jam (Dalton et
al. 1997, Lovett dan Twedt 2004). Perubahan keasaman lambung akibat
penggunaan obat–obatan antasida dan cimetidine dapat meningkatkan kepekaan
terhadap infeksi Listeria. Manusia yang menelan sejumlah 1.000 sel L.
monocytogenes akan menimbulkan gejala klinis seperti flu (rasa tidak enak badan,
demam ringan) dan diare. Dilaporkan antara 1–10% manusia terinfeksi tanpa
menunjukkan gejala klinis, namun dapat melepaskan L. monocytogenes melalui
feses (Lovett dan Twedt 2004).
Umumnya, infeksi dimulai oleh tertelannya L. monocytogenes, melalui
makanan terkontaminasi, yang mampu bertahan terhadap enzim proteolitik dan
keasaman (pH 2.0) di dalam lambung, garam empedu, serta mekanisme
pertahanan non-spesifik. Gambar 1 menunjukkan proses terjadinya invasive
listeriosis, (a) bakteri menyerang mukosa saluran pencernaan dan melekat pada
sel usus dibantu oleh D-galaktosa yang ada pada permukaan sel bakteri. Bakteri
kemudian menginvasi makrofag (sel parenkim) dan (b) terperangkap dalam
vakuola yang disebut fagosom, (c) selanjutnya bakteri tersebut menghasilkan
toksin listeriolisin O (LLO), phosphatidylinositol-spesific phospholipase C (PIPLC),
dan phosphatidylcholine-spesific phospholipase C (PC-PLC) yang mempunyai
kemampuan sitolitik untuk merusak fagosom agar dapat masuk ke dalam
6

sitoplasma. Ketiga toksin tersebut juga mencegah pencernaan bakteri oleh enzim
hidrolitik yang dihasilkan oleh lisosom, (d) secara cepat bakteri berkembang biak
di dalam sitoplasma dan membentuk F-aktin, (e) bakteri akan menginvasi sel lain
dengan bantuan F-aktin, mengakibatkan kerusakan sel dan septikemia. Setelah
berhasil menginvasi sel lain, bakteri berada dalam vakuola dengan membran
ganda, dan (f) melanjutkan siklus hidupnya dengan terus menginvasi sel lain.
Lima hari hingga tiga minggu setelah tertelan, bakteri ini menyebar ke seluruh
tubuh dan mengakibatkan kerusakan pada sistem syaraf, jantung, mata, organ lain
dan fetus. Infeksi pada sistem syaraf dapat menimbulkan meningitis, ensefalitis
dan abses dengan tingkat fatalitas hingga 70%. Pada wanita hamil, bentuk ini
mengakibatkan aborsi dan kematian bayi saat dilahirkan dengan rata-rata tingkat
kematian sebesar 80% (Lovett dan Twedt 2004; Hamon et al. 2006).
Pada individu dengan kondisi respon imun sel T tidak cukup, bakteri L.
monocytogenes yang mencapai hati dan limpa akan segera bermultiplikasi di
dalam hepatosit dan sel makrofag, kemudian dibawa oleh darah menuju ke
berbagai organ termasuk otak dan uterus. Pada kedua organ tersebut, L.
monocytogenes mampu melakukan penetrasi terhadap blood-brain barrier dan
placental barrier (Doyle 1987). Beberapa kondisi individu yang dapat mengalami
gangguan respon sistem imun yaitu usia lanjut, wanita hamil, janin dan bayi baru
lahir, pasien gangguan ginjal, penderita diabetes mellitus, serta individu yang
menderita HIV-AIDS. Kemampuan L. monocytogenes untuk menimbulkan
septikemia tergantung beberapa faktor, seperti jumlah bakteri yang tertelan, status
kekebalan tubuh induk semang dan keganasan galur bakteri yang menginfeksi.
Dilaporkan bahwa tertelannya sejumlah 1000 CFU/g L. monocytogenes yang
mencemari pangan dapat mengakibatkan listeriosis (CAC 2007).
 7

Gambar 1 Skema invasi intraseluler L. monocytogenes (Hamon et al. 2006)

Virulensi Listeria monocytogenes

Beberapa faktor yang mempengaruhi patogenesis L. monocytogenes antara

lain kemampuan pertumbuhan intraseluler, kandungan senyawa besi, kemampuan
melawan sel fagosit, dan menghasilkan hemolisin. Toksin hemolisin yang
dihasilkan oleh L. monocytogenes disebut Listeriolisin O (LLO), dan merupakan
faktor virulensi yang utama. Sekresi hemolisin sangat penting dalam pertumbuhan
intraseluler dan pengenalan organisme ini oleh sel T (Farber dan Peterkin 1991).
Toksin Listeriolisin O (LLO), yang analog dengan toksin Streptolisin O
(SLO), pertama kali diisolasi dari supernatan dari kultur L. monocytogenes dan
menunjukkan struktur sebagai sulfhydryl (SH)-activated cytolysin. Hof dan Hefner
(1988) melaporkan bahwa hanya L. monocytogenes dan L. ivanovii yang
menghasilkan β-hemolisin. Strain L. innocua dan L. welshimeri, keduanya non-
hemolitik, bersifat non-virulen, sedangkan L. seeligeri bersifat hemolitik lemah
namun non-virulen. Semua strain L. monocytogenes memproduksi LLO (ukuran
60 kDa), strain L. ivanovii dan L. seeligeri juga memproduksi eksotoksin
dependent-thiol dengan jumlah sepersepuluh dari L. monocytogenes. Toksin
hemolisin tidak ditemukan pada strain L. innocua dan L. welshimeri.
8

Toksin hemolisin lain yang ditemukan pada beberapa strain L.

monocytogenes dan secara imunologi berbeda dari LLO pertama kali dilaporkan
oleh Parrisius et al. (1986). Dua tipe hemolisin teridentifikasi pada klon dari L.
monocytogenes yang dikonstruksi pada Escherichia coli. Hemolisin pertama
adalah suatu protein dengan ukuran 23kDa, kemungkinan sebagai faktor CAMP,
tidak mengalami reaksi silang dengan antilisteriolisin maupun antibodi anti-SLO.
Hemolisin kedua mengalami reaksi silang dengan anti-SLO. Vicente et al. (1985)
mengidentifikasi 12 rekombinan yang mengekspresikan aktivitas β-hemolitik
setelah kloning genom DNA L. monocytogenes pada sel E. coli. Kedua klon yang
menunjukkan aktivitas hemolitik dapat terdeteksi setelah dilakukan sonikasi pada
subkloning lanjutan. Pada filtrasi gel yang dilakukan setelah sonikasi,
menghasilkan dua puncak aktivitas hemolitik, yaitu protein dengan ukuran 22 kDa
dan 48 kDa, menunjukkan dua jenis hemolisin.
Pada penelitian yang dilakukan oleh Farber dan Peterkin (1991),
digunakan transposon mutagenesis untuk mengidentifikasi peranan hemolisin
sebagai faktor virulensi dari L. monocytogenes. Transposon mutagenesis
digunakan untuk menginaktivasi determinan genetik pembentukan hemolisin,
yaitu tiga non-hemolitik (Hly-) transkonjugan dan satu hemolitik (Hly+)
transkonjugan. Hly- menghasilkan protein 49 kDa yang non-virulen, sedangkan
Hly+ menghasilkan protein 58 kDa yang bersifat virulen dan hemolitik.

Listeria monocytogenes pada Bahan Pangan

Listeria monocytogenes dapat ditemukan pada lingkungan, seperti debu,

tanah, air laut dan tawar, tanaman, hewan liar dan domestik, makanan hewan
termasuk silase, limbah rumah potong hewan, selokan dan sedikit ditemukan pada
feses (Donnelly 2001; Garbutt 1997). L. monocytogenes juga ditemukan pada
buah-buahan, susu mentah, keju, daging, produk daging, hot dog yang tidak
dimasak, ikan, rennet, daging unggas, ayam masak yang disimpan pada suhu
dingin, ayam masak siap saji, susu pasteurisasi dan produk susu lainnya (Garbutt
1997).
Hewan ternak yang terinfeksi L. monocytogenes dapat melepaskan L.
monocytogenes melalui susu dan fesesnya. Donelly (2001), melaporkan adanya
pelepasan sel L. monocytogenes yang tinggi pada susu yang dihasilkan oleh sapi
dan domba terinfeksi tanpa disertai gejala klinis. Menurut Sanjaya et al. (2007),
cemaran mikroba pada susu dapat terjadi pada ambing, alat penampung susu, alat
penyimpan susu, transportasi, industri pengolahan dan konsumen. Sumber
cemaran L. monocytogenes pada susu dan produknya dapat ditemukan pada rantai
pengolahan, termasuk susu mentah, lingkungan, peralatan, alat pengemas,
pengelolaan sampah, pengendali hewan pengganggu hingga higiene karyawan
yang terlibat (Lovett dan Twedt 2004).
Listeria monocytogenes termasuk golongan bakteri fakultatif anaerobik
dan psikrotrofik yang tumbuh pada kisaran suhu 1–44 oC dengan pertumbuhan
optimal pada suhu 35–37 oC (Ray 2001). Bakteri ini mampu tumbuh dan
berkembang biak dalam pangan yang disimpan pada suhu 4 oC selama 12 minggu.
Oleh karena itu listeriosis selalu dihubungkan dengan konsumsi susu, daging atau
sayuran yang telah disimpan pada suhu refrigerator dalam waktu lama.
 9

Sel L. monocytogenes masih mampu tumbuh dalam susu yang telah

dipasteurisasi pada suhu 71 oC selama 15 detik, susu yang dipasteurisasi secara
komersial dengan High Temperature Short Time (HTST) serta dalam produk susu
seperti es krim, keju, yogurt dan susu skim (Johansson 1998; Piyasena et al. 1998).
Forsythe dan Hayes (1998) melaporkan bahwa sel L. monocytogenes masih dapat
ditemukan pada susu pasteurisasi dengan suhu 72 oC selama 15 detik di hari kedua
masa penyimpanan dalam suhu 4 oC. Pertumbuhan sel semakin meningkat setiap
hari hingga 2500 sel per ml pada hari kelima.

Serotipe Listeria monocytogenes

Spesies dari genus Listeria memiliki protein permukaan yang spesifik,

yaitu antigen somatik (O) dan antigen flagelar (H). Kedua jenis antigen
permukaan tersebut merupakan target pengujian serologis yang paling utama
dalam identifikasi strain dari L. monocytogenes. Telah diketahui bahwa terdapat
15 subtipe antigen O (I–XV) dan 4 subtipe antigen H (A–D) (Seeliger dan Jones
1986). Penentuan strain individual Listeria ditentukan dari kombinasi spesifik
antara antigen O dan antigen H (Tabel 4).

Tabel 4 Komposisi antigen somatik (O) dan antigen flagelar (H) pada serotipe
Listeria monocytogenesa
Serotipe Antigen O Antigen H
1/2 a I, II A, B
1/2 b I, II A, B, C
1/2 c I, II B, D
3a II, IV A, B
3b II, IV A, B, C
3c II, IV B, D
4a (V), VII, IX A, B, C
4b V, VI A, B, C
4c V, VII A, B, C
4d (V), VI, VIII A, B, C
4e V, VI, (VIII), (IX) A, B, C
7 XII, XIII A, B, C
a
Sumber: Seeliger dan Jones 1986

Pengujian serologis terhadap terjadinya aglutinasi antigen O dan H

menghasilkan 12 serotipe L. monocytogenes, yaitu 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a,
4b, 4c, 4d, 4e, dan 7. Metode serotyping selain berguna dalam diferensiasi spesies
Listeria, juga sangat diperlukan untuk menentukan subtipe dan kelompok klonal
dari L. monocytogenes (Liu 2006). Penelitian telah membuktikan bahwa hanya
serotipe 1/2a, 1/2b, dan 4b yang menjadi 98% penyebab terjadinya wabah
listeriosis pada manusia, serotipe 4a dan 4c jarang dikaitkan dengan terjadinya
wabah listeriosis (Wiedmann et al. 1996; Jacquet et al. 2002). Listeria
monocytogenes serotipe 4b paling banyak diisolasi dari kejadian wabah epidemik
listeriosis, sedangkan serotipe 1/2a dan 1/2b dikaitkan dengan terjadinya infeksi
sporadik (Wiedmann et al. 1996). Serotipe 1/2b dan 4a umumnya diisolasi dari
10

domba yang mengalami ensefalitis, sedangkan serotipe 1/2a paling banyak

menjadi penyebab septisemia dan aborsi (Low dan Donachie 1997).
Borucki dan Call (2003) melakukan identifikasi serotipe dari 122 strain L.
monocytogenes asal manusia, hewan, dan lingkungan dengan metode multipleks
dan mismatch amplification mutation assay (MAMA) PCR. Strain L.
monocytogenes dibagi menjadi 3 genetik lineage (atau divisi), divisi I terdiri atas
serotipe 1/2b, 3b, 4b, 4d, dan 4e; divisi II terdiri atas serotipe 1/2a, 1/2c, 3a, dan
3c; divisi III terdiri atas serotipe 4a dan 4c. Doumith et al. (2004)
mengembangkan metode PCR multipleks yang lebih sederhana untuk
mengidentifikasi serotipe L. monocytogenes dan berhasil memisahkan strain–
strain L. monocytogenes ke dalam empat serogrup, yaitu grup 1 terdiri dari
serotipe 1/2a dan 3a; grup 2 terdiri dari serotipe 1/2c dan 3c; grup 3 terdiri dari
serotipe 1/2b, 3b, dan 7; dan grup 4 terdiri dari serotipe 4b, 4d, dan 4e.

3 METODE

Waktu dan Tempat

Penelitian dilaksanakan pada bulan April 2015 sampai dengan Maret 2016.
Pengambilan sampel susu segar dilakukan di Kabupaten Enrekang Propinsi
Sulawesi Selatan. Tahap isolasi dan identifikasi bakteri L. monocytogenes
dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Bioteknologi Terpadu
Fakultas Peternakan Universitas Hasanuddin, sedangkan tahap konfirmasi spesies
L. monocytogenes dan identifikasi serotipe dilakukan di Laboratorium Divisi
Mikrobiologi Medik Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan
Masyarakat Veteriner dan di Laboratorium Pendidikan dan Layanan, Fakultas
Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor.

Pengambilan Contoh Susu Segar

Jumlah populasi sapi perah betina produktif di Kabupaten Enrekang adalah

1020 ekor (BPS 2014). Contoh susu segar diambil dari 10% dari total populasi
sapi perah betina produktif, yaitu minimal 102 sampel. Pengambilan sampel
dilakukan secara aseptik sebanyak 100 ml susu segar per ekor sapi. Sampel
tersebut dimasukkan ke dalam botol kaca steril, diberi kode sampel, dan
ditempatkan di dalam kotak pendingin yang dilengkapi dengan ice pack untuk
pengangkutan ke laboratorium dan selanjutnya dilakukan penggabungan (pooling)
yang terdiri dari 3–5 sampel per pool. Penggabungan (pooling) dilakukan
berdasarkan kandang tempat pengambilan contoh susu yang lokasinya berdekatan.
Sebanyak 5 ml susu segar diambil dari tiap sampel individu dan dimasukkan ke
dalam tabung erlenmeyer steril. Sampel pool dengan volume 25 ml selanjutnya
digunakan untuk isolasi dan identifikasi bakteri.
 11

Isolasi dan Identifikasi Listeria monocytogenes dari Susu Segar

Kultur pada Media Agar dan Uji Biokimiawi

Tahap pengayaan dilakukan menggunakan media Buffered Listeria
Enrichment Broth (Buffered LEB, CM 0897, Oxoid, England). Sebanyak 25 ml
contoh susu segar ditambahkan ke dalam 225 ml LEB kemudian diinkubasi pada
suhu 30 oC selama 24 jam, 48 jam, dan 7 hari. Setelah inkubasi 24 jam, dilakukan
tahap isolasi dengan menumbuhkan sebanyak satu ose larutan tersebut pada media
Listeria Selective Agar Base (Oxford Agar, CM 0856, Oxoid, England) dengan
suplementasi Listeria Selective Supplement (Oxford formula, SR 0140). Inkubasi
pada media Listeria Selective Agar Base dilakukan pada suhu 35–37 oC selama
24–48 jam. Cara yang sama dilakukan setelah inkubasi pada media LEB selama
48 jam dan 7 hari apabila tidak ada pertumbuhan bakteri pada media LSA dari
biakan media LEB yang diinkubasi selama 24 jam.
Adanya pertumbuhan Listeria ditandai dengan koloni pada media Listeria
Selective Agar Base berukuran diameter 1 mm dengan halo berwarna coklat–
hitam. Sebanyak 3–5 koloni tersebut kemudian diuji lanjut dengan pewarnaan
Gram dan uji biokimiawi, yaitu uji fermentasi karbohidrat (rhamnosa, mannitol,
dan xylosa), uji motilitas pada media sulfide-indol-motilitas (SIM), uji katalase,
uji KOH 3%, dan uji hemolisa pada media agar darah. Strain L. monocytogenes
ATCC 7644 digunakan sebagai kontrol positif.

Ekstraksi DNA
DNA bakteri diekstraksi dengan menggunakan PrestoTM Mini gDNA
Bacteria Kit (Geneaid Biotech Ltd.). Sampel sebanyak 109 sel bakteri dimasukkan
ke dalam tabung mikrosentrifugasi ukuran 1.5 ml, kemudian disentrifugasi
14000–16000×g selama 1 menit dan supernatannya dibuang. Sebanyak 200 µl
Gram+ buffer (mengandung lisozim 4 mg/ml) ditambahkan ke dalam sampel
untuk meresuspensi pelet kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 30 menit.
Sebanyak 20 µl Proteinase K kemudian ditambahkan ke dalam tabung dan
diinkubasi pada suhu 60 oC selama 10 menit. Sebanyak 200 µl GB buffer
ditambahkan ke dalam tabung sampel kemudian dihomogenkan dengan vortex
selama 10 detik dan diinkubasi pada suhu 70 oC selama 10 menit untuk
memastikan lisat menjadi bening. Pada tahap ini, dilakukan pemanasan Elution
buffer (sebanyak 200 µl per sampel) hingga mencapai suhu 70 oC. Sebanyak 200
µl etanol absolut ditambahkan untuk menghilangkan endapan pada tabung.
Tabung GD column ditempatkan pada tabung koleksi ukuran 2 ml, selanjutnya
campuran sampel dipindahkan ke dalam GD column dan disentrifugasi 14000–
16000×g selama 2 menit. Tabung koleksi beserta cairan yang tersisa dibuang,
kemudian GD column ditempatkan pada tabung koleksi yang baru. Proses
pencucian dilakukan dengan menambahkan 400 µl W1 buffer ke dalam GD
column, disentrifugasi 14000 –16000×g selama 30 detik, kemudian cairan yang
tersisa dibuang dan GD column ditempatkan kembali pada tabung koleksi.
Sebanyak 600 µl Wash buffer ditambahkan ke dalam GD column, disentrifugasi
14000–16000×g selama 30 detik, kemudian cairan yang tersisa dibuang dan GD
column ditempatkan kembali pada tabung koleksi. Sentrifugasi 14000–16000×g
dilakukan selama 3 menit untuk mengeringkan matriks column. GD column
ditempatkan pada tabung mikro ukuran 1.5 ml dan ditambahkan 100 µl Elution
 12

buffer yang telah dipanaskan sebelumnya, selanjutnya didiamkan selama 3 menit

agar Elution buffer terabsorbsi seluruhnya. Tahap akhir dilakukan sentrifugasi
14000–16000×g selama 30 detik untuk memperoleh DNA hasil ekstraksi.
Konsentrasi dan kemurnian DNA yang diperoleh diukur dengan spektrofotometer
pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.

Identifikasi Gen Hemolisin (hly) dan Gen Invasive Associated Protein (iap)
Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk identifikasi spesies L.
monocytogenes dilakukan menggunakan primer yang spesifik untuk gen hemolisin
(hly) dan invasive associated protein (iap) (Swetha et al. 2012). Sekuens primer
yang digunakan ditampilkan pada Tabel 5.

Tabel 5 Primer yang digunakan untuk identifikasi spesies L. monocytogenesa

Ukuran Suhu
Gen
Primer Sekuens primer produk Annealing
Target
(bp) (oC)
iap iap For: 5'–ACAAGCTGCACCTGTTGCAG–3'
131 59
Rev: 5'–TGACAGCGTGTGTAGTAGCA–3'
For: 5'–GCAGTTGCAAGCGCTTGGAGTGAA–3'
hlyA hly 456 54
Rev: 5'–GCAACGTATCCTCCAGAGTGATCG–3'
a
Sumber: Swetha et al. 2012

Gambar 2 Skema posisi primer iap dan hlyA pada genom L. monocytogenes

Reaksi amplifikasi dilakukan menggunakan kit QIAGEN® HotStarTaq

Plus Mastermix sesuai dengan panduan perusahaan. Campuran reaksi amplifikasi
mengandung 1 µl template DNA bakteri, 10 µM µM masing–masing primer
sebanyak 1µl, 10 µl 2×QIAGEN HotStarTaq Plus Mastermix (mengandung 5U
taq polymerase, PCR buffer dengan 3 mM MgCl2, dan 400 µM dNTP), dan
RNAse free water dengan volume akhir 20 µl. Kondisi siklus PCR adalah sebagai
berikut: 95 oC selama 3 menit diikuti dengan 35 siklus dengan suhu 95 oC selama
1 menit, 54–59 oC (suhu annealing masing–masing primer seperti tercantum pada
tabel 8) selama 30 detik, 72 oC selama 1 menit, dan tahap akhir 72 oC selama 10
menit. Produk PCR divisualisasi menggunakan elektroforesis gel agarose 1.5%
yang mengandung etidium bromida 0.4 μg/ml dan diamati menggunakan UV
transluminator.
 13

Identifikasi Serotipe Listeria monocytogenes dengan Metode PCR

Sampel–sampel yang menunjukkan hasil positif sebagai bakteri L
monocytogenes selanjutnya diidentifikasi serotipenya dengan metode PCR
multipleks yang mengacu pada Doumith et al. (2004). Tabel 6 menampilkan
sekuens primer dan spesifisitas serotipenya yang digunakan dalam PCR
multipleks.

Tabel 6 Primer yang digunakan untuk identifikasi serotipe L. monocytogenesa

Primer Sekuen primer Ukuran Spesifisitas serotipe
produk (bp)
lmo0737 For: 5'–AGGGCTTCAAGGACTTACCC–3'
Rev: 5'–ACGATTTCTGCTTGCCATTC–3'
691 1/2a, 1/2c, 3a, 3c
lmo1118 For: 5'–AGGGGTCTTAAATCCTGGAA–3' 906 1/2c, 3c
Rev: 5'–CGGCTTGTTCGGCATACTTA–3'
ORF2819 For: 5'–AGCAAAATGCCAAAACTCGT–3' 471 1/2b, 3b, 4b, 4d, 4e
Rev: 5'–CATCACTAAAGCCTCCCATTG–3'
ORF2110 For: 5'–AGTGGACAATTGATTGGTGAA–3' 597 4b, 4d, 4e
Rev: 5'–CATCCATCCCTTACTTTGGAC–3'
a
Sumber: Doumith et al. 2004

Reaksi amplifikasi multipleks dilakukan menggunakan QIAGEN®

Multiplex PCR Kit sesuai dengan panduan perusahaan. Campuran reaksi
amplifikasi mengandung 1 µl template DNA bakteri, 10 µM masing–masing
primer sebanyak 0.4 µl, 10 µl 1×QIAGEN Multipleks PCR Mastermix, dan
RNAse free water dengan volume akhir 20 µl. Siklus PCR diawali dengan pre-
denaturasi pada suhu 95 oC selama 15 menit, diikuti dengan 35× (94 oC selama 30
detik, 57 oC selama 90 detik dan 72 oC selama 90 detik) dan ekstensi akhir pada 72
o
C selama 10 menit. Produk PCR multipleks divisualisasi menggunakan
elektroforesis gel agarose 1.5% yang mengandung etidium bromida 0.4 μg/ml dan
diamati menggunakan UV transluminator.

Pengurutan Oligonukleotida (Sekuensing) DNA

Pengurutan Oligonukleotida Parsial Gen hly dari Listeria monocytogenes

Produk-produk PCR yang menunjukkan hasil positif selanjutnya
disekuensing. Sekuensing DNA dilakukan menggunakan BigDye® Terminator
v3.1 cycle sequencing kit serta primer hlyA-forward. Tahap pertama diawali
dengan purifikasi produk PCR menggunakan Centricon®-100 columns. Sebanyak
2 ml air deionisasi dimasukkan ke dalam column, ditambahkan sampel produk
PCR, kemudian disentrifugasi 3000×g selama 10 menit. Wadah penampung
ampas dibuang dan vial dilekatkan. Column selanjutnya dibalik dan disentrifugasi
270×g selama 2 menit. Tahap kedua adalah cycle sequencing dengan campuran
reaksi 4 µl 2×Ready Reaction Premix, 2 µl 5×BigDye sequencing buffer, primer
dengan konsentrasi 3.2 pmol/µl, 3–10 ng template, dan air deionisasi sampai
volume 20 µl. Reaksi cycle sequencing dimulai dengan denaturasi awal pada suhu
96 ºC selama 1 menit, diikuti dengan 25 siklus pada suhu 96 oC selama 10 detik,
50 oC selama 5 detik, dan 60 oCselama 4 menit. Tahap ketiga adalah purifikasi
produk cycle sequencing menggunakan Centri-Sep™ spin columns. Diawali
dengan menambahkan 2 µl sodium dodecyl sulfate 2.2% kemudian dipanaskan
14

pada suhu 95 oC selama 5 menit. Campuran produk ekstensi kemudian

dimasukkan ke dalam spin column dan disentrifugasi 730×g selama 2 menit untuk
mengkoleksi sampel. Tahap keempat, sampel dimasukkan ke dalam mesin
sequencer untuk dibaca susunan oligonukleotidanya.

Analisa Hasil Pengurutan Oligonukleotida (Sekuensing) DNA

Hasil sekuensing DNA dianalisa dengan perangkat lunak BioEdit®
sequence alignment editor (Hall 1999). Parameter yang dianalisa adalah
menentukan kemiripan susunan oligonukleotida dari isolat sampel dengan
beberapa strain L. monocytogenes yang terdapat pada basis data di GenBank.

Analisa Data

Seluruh data yang diperoleh dari penelitian ini dianalisa secara deskriptif.

4 HASIL DAN PEMBAHASAN

HASIL

Pengambilan Contoh Susu Segar

Contoh susu segar diambil dari 107 ekor sapi secara acak dari lokasi
pemeliharaan sapi perah pada 5 kecamatan, yaitu Kecamatan Enrekang, Cendana,
Baraka, Anggeraja, dan Alla. Kelima kecamatan tersebut merupakan sentra
pemeliharaan sapi perah di Kabupaten Enrekang, Sulawesi Selatan. Sebanyak 107
contoh susu segar kemudian digabung menjadi 31 pool berdasarkan kandang
tempat pengambilan contoh susu yang lokasinya berdekatan. Tabel 7
menampilkan jumlah contoh susu segar yang diambil dari masing–masing
kecamatan.

Tabel 7 Lokasi dan jumlah contoh susu segar yang diambil dari 5 kecamatan di
Kabupaten Enrekang
Jumlah sampel
No. Kecamatan Jumlah pool Kode Sampel
(ekor)
1. Cendana 45 14 1–14
2. Anggeraja 24 7 15–19, 30–31
3. Baraka 11 3 20–22
4. Enrekang 21 5 23–27
5. Alla 6 2 28–29
Jumlah 107 31
 15

Isolasi dan Identifikasi Listeria monocytogenes dari Susu Segar

Kultur pada Media Agar dan Uji Biokimiawi

Kultur pada media Listeria Selective Agar (LSA) setelah dilakukan
pengayaan pada media Listeria Enrichment Broth (LEB) menunjukkan hasil
keseluruhan sampel 31 pool dapat tumbuh pada media selektif tersebut dan
sebagian besar kultur terdiri atas 2 koloni bakteri yang berbeda, yaitu koloni yang
membentuk halo berwarna coklat–hitam dan koloni yang tidak membentuk halo.
Kultur kontrol positif bakteri Listeria monocytogenes ATCC 7644 pada media
LSA menghasilkan koloni bakteri berukuran diameter 1 mm dengan halo
berwarna coklat–hitam (Gambar 3a).

a b
Gambar 3 Hasil kultur pada media LSA. Koloni yang diduga L. monocytogenes
membentuk halo berwarna coklat–hitam dan berukuran 1 mm. (a)
kultur isolat kontrol positif bakteri L. monocytogenes, (b) kultur isolat
sampel yang diduga L. monocytogenes

Pewarnaan Gram dari 31 koloni menunjukkan hasil sebanyak 24 koloni

yang berbentuk batang dan bersifat Gram positif. Gambar 4 menunjukkan hasil
pewarnaan Gram dari isolat kontrol positif dan isolat sampel diduga L.
monocytogenes. Sejumlah 24 koloni yang menunjukkan bakteri Gram positif dan
berbentuk batang, selanjutnya diuji lanjut dengan uji biokimiawi, yaitu uji
fermentasi karbohidrat (rhamnosa, mannitol, dan xylosa), uji motilitas pada media
sulfide-indol-motilitas (SIM), uji katalase, uji KOH 3%, dan uji hemolisa pada
media agar darah. Tabel 8 menunjukkan hasil uji biokimiawi dari isolat L.
monocytogenes ATCC 7644 dan 24 isolat sampel yang diduga L. monocytogenes.
Uji biokimiawi dari L. monocytogenes ATCC 7644 menunjukkan hasil
positif untuk uji motilitas, fermentasi rhamnosa, uji KOH, dan uji hemolisa, serta
hasil negatif untuk uji fermentasi xylosa, fermentasi mannitol, dan uji katalase.
Hasil uji biokimiawi terhadap 24 isolat sampel menunjukkan sebanyak 21 isolat
adalah L. monocytogenes. Dua puluh satu isolat tersebut menunjukkan hasil positif
untuk fermentasi rhamnosa dan uji katalase, serta hasil negatif untuk fermentasi
xylosa, fermentasi mannitol, dan uji KOH. Pada pengujian motilitas, terdapat 5
dari 21 isolat yang menunjukkan hasil negatif, sedangkan pada pengujian
hemolisa dengan media agar darah terdapat 9 dari 21 isolat yang menunjukkan
hasil negatif.
16

Gambar 4 Hasil pewarnaan Gram. Bakteri L. monocytogenes berrbentuk batang

dan bersifat Gram positif. (a) Isolat bakteri L. monocytogenes ATCC
7644 dan (b) isolat sampel yang diduga L. monocytogenes

Listeria monocytogenes diketahui bersifat motil bila ditumbuhkan pada

suhu 20–25 oC dengan adanya pertumbuhan flagella peritrikus (Gyles et al. 2010).
Pengujian motilitas dilakukan pada media semisolid dengan inkubasi pada suhu
22–30 oC karena gen flaA yang mengkode subunit flagellin mengalami down-
regulation pada temperatur yang lebih tinggi. Motilitas L. monocytogenes
ditunjukkan oleh pertumbuhan berbentuk payung pada media semisolid. Pada
pengujian motilitas, sering kali ditemukan isolat L. monocytogenes yang non motil,
sehingga hasil pengujian motilitas saja tidak cukup untuk menentukan isolat
tersebut adalah L. monocytogenes atau bukan (Gorski 2008). Struktur flagellar
berkontribusi terhadap virulensi patogen gastrointestinal, baik sebagai efektor
motilitas, sebagai adesin, atau sebagai suatu apparatus sekresi untuk faktor
virulensi. L. monocytogenes menggunakan flagella untuk meningkatkan efisiensi
invasi sel epitel (Bigot et al. 2005). Telah dilaporkan pula bahwa flagella L.
monocytogenes digunakan untuk motilitas, bukan sebagai adhesin, untuk
meningkatkan invasi sel inang (O’Neil dan Marquis 2006).
Kemampuan L. monocytogenes menghasilkan zona hemolisa pada media
agar darah disebabkan adanya toksin hemolisin yang disebut Listeriolisin O
(LLO). Listeriolisin O merupakan faktor virulensi yang utama.Sekresi hemolisin
sangat penting dalam pertumbuhan intraseluler dan pengenalan organisme ini oleh
sel T (Farber dan Peterkin 1991).
 17

Tabel 8 Hasil uji biokimiawi dari isolat L. monocytogenes ATCC 7644 dan 24
isolat sampel diduga L. monocytogenes
No. Sifat Uji biokimiawi
No. Bentuk
isolat Gram motilitas mannitol xylosa rhamnosa KOH katalase hemolisa
Kontrol
1 + – – + – + +
+ Lm batang positif
2 2B batang positif + – – + – + –
3 4A batang positif + – – + – + +
4 4B batang positif + – – + – + –
5 5B batang positif – – – + – + –
6 7A a
batang positif – – + + – + –
7 7B batang positif – – – + – + –
8 14A batang positif + – – + – + –
9 14B batang positif + – – + – + –
10 15B a
batang positif + + – + – + –
11 16B batang positif + – – + – + –
12 17 batang positif + – – + – + –
13 18A batang positif + – – + – + +
14 18B batang positif – – – + – + +
15 19Ba batang positif – – – – – + –
16 20 batang positif – – – + – + +
17 21B batang positif + – – + – + +
18 22B batang positif + – – + – + +
19 23B batang positif – – – + – + +
20 24A batang positif + – – + – + +
21 25A batang positif + – – + – + +
22 25B batang positif + – – + – + +
23 26B batang positif + – – + – + +
24 29B batang positif + – – + – + –
25 30B batang positif + – – + – + +

Kualitas DNA Bakteri Hasil Ekstraksi

Ekstraksi DNA bakteri dilakukan menggunakan PrestoTM Mini gDNA
Bacteria Kit (Geneaid Biotech Ltd.). Konsentrasi dan kemurnian DNA hasil
ekstraksi diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm dan
280 nm.Panjang gelombang 260 nm merupakan absorbansi maksimal untuk asam
nukleat, sedangkan panjang gelombang 280 nm merupakan absorbansi maksimal
untuk protein. Perbandingan nilai absorbansi 260 nm dengan 280 nm menjadi
ukuran kemurnian DNA, yaitu DNA dengan tingkat kemurnian yang baik bila
nilai rasio A260/A280 adalah 1.8–2.0 (Barbas et al. 2001). Isolat kontrol positif L.
monocytogenes ATCC 7644 dan 24 isolat sampel menghasilkan konsentrasi DNA
bakteri yang bervariasi. Konsentrasi tertinggi adalah isolat nomer 4B yaitu 241.2
ng/μl dan konsentrasi terendah adalah isolat 29B, yaitu 10.9 ng/μl. Tingkat
kemurnian DNA terendah pada isolat 4B dan 19B dengan nilai rasio A260/A280
18

sebesar 1.55, nilai tersebut mengindikasikan adanya kontaminasi oleh protein atau
fenol. Hasil pengukuran kualitas DNA bakteri hasil ekstraksi ditampilkan pada
Lampiran 1.

Identifikasi Parsial Gen iap dan hly dari Listeria monocytogenes

Amplifikasi DNA bakteri dilakukan terhadap isolat L. monocytogenes
ATCC 7644 dan 24 isolat sampel diduga L. monocytogenes. Reaksi PCR untuk
identifikasi spesies L. monocytogenes dilakukan menggunakan 2 pasang primer,
yaitu iap dan hlyA. Hasil elektroforesis gel agarose dari produk PCR
menggunakan primer iap secara umum menunjukkan pita yang lebih tipis daripada
hasil PCR dengan primer hlyA (Gambar 5 dan 6).
Keseluruhan hasil PCR dengan primer iap dan hlyA menunjukkan bahwa
21 isolat diidentifikasi sebagai L. monocytogenes. Hasil tersebut sesuai dengan
hasil identifikasi melalui metode kultur konvensional. Tabel 9 menunjukkan
resume hasil identifikasi L. monocytogenes pada 21 isolat sampel dengan metode
kultur konvensional dan konfirmasi dengan PCR menggunakan 2 pasang primer.

Tabel 9 Resume hasil identifikasi L. monocytogenes dengan metode kultur

konvensional dan PCR
Metode kultur Metode PCR
No. No. isolat
konvensional iap hlyA
1. L. monocytogenes + + +
ATCC 7644
2. 2B + + +
3. 4A + + +
4. 4B + + +
5. 5B + + +
6. 7A ̶ ̶ ̶
7. 7B + + +
8. 14A + + +
9. 14B + + +
10. 15B ̶ ̶ ̶
11. 16B + + +
12. 17 + + +
13. 18A + + +
14. 18B + + +
15. 19B ̶ ̶ ̶
16. 20 + + +
17. 21B + + +
18. 22B + + +
19. 23B + + +
20. 24A + + +
21. 25A + + +
22. 25B + + +
23. 26B + + +
24. 29B + + +
25. 30B + + +
 19

Gambar 5 Hasil elektroforesis produk PCR menggunakan primer iap. Sebanyak

21 isolat sampel menunjukkan hasil positif dengan primer iap. M1:
DNA marker 100 bp; K+: L. monocytogenes ATCC 7644; NTC: no
template control.
20

Gambar 6 Hasil elektroforesis produk PCR menggunakan primer hlyA. Sebanyak

21 isolat sampel menunjukkan hasil positif dengan primer hlyA. M2:
DNA marker 1000 bp; K+: L. monocytogenes ATCC 7644; NTC: no
template control.

Primer iap didesain dari gen iap yang mengkode invasive associated
protein (p60). Gen iap terdapat pada seluruh spesies Listeria sehingga bisa
digunakan untuk membedakan masing–masing spesies Listeria. Gen tersebut
memiliki homologi sekuens antara regio 5' sampai dengan 3' dan variasi pada
regio tengah sehingga dapat digunakan untuk membedakan L. monocytogenes dari
spesies Listeria lainnya (Bubert et al. 1991). Primer hlyA didesain dari gen hly
yang mengkode Listeriolisin O (LLO). Selama proses infeksi, LLO membantu
 21

bakteri L. monocytogenes untuk meloloskan diri dari fagosom. Strain L.

monocytogenes yang kehilangan fungsi LLO menjadi bersifat nonvirulen. Sifat
sitotoksik dari LLO ditandai dengan terjadinya lisis sel darah merah pada media
agar darah (yaitu β-hemolisis) dan menjadi indikasi adanya aktivitas gen virulensi
(Gorski 2008).

Identifikasi Serotipe Isolat Listeria monocytogenes

Identifikasi serotipe isolat L. monocytogenes dilakukan dengan metode
PCR multipleks menurut Doumith et al. (2004). Gambar 7 menunjukkan hasil
elektroforesis gel agarose dari produk PCR multipleks.

Gambar 7 Hasil elektroforesis produk PCR multipleks. Seluruh isolat termasuk

dalam serogrup 2, yaitu serotipe 1/2c dan 3c. M: DNA marker 1000
bp; NTC: no template control.
22

Gen penanda yang digunakan untuk pengujian PCR multipleks adalah

lmo0737 dan lmo1118 yang diidentifikasi pada sekuen L. monocytogenes strain
EGDe, serta ORF2819 dan ORF2110 yang diidentifikasi pada sekuen parsial dari
L. monocytogenes strain CLIP 80459 serovar 4b. Metode PCR multipleks tersebut
memisahkan strain–strain L. monocytogenes ke dalam empat grup serotipe, yaitu
grup 1 terdiri dari serotipe 1/2a dan 3a; grup 2 terdiri dari serotipe 1/2c dan 3c;
grup 3 terdiri dari serotipe 1/2b, 3b, dan 7; dan grup 4 terdiri dari serotipe 4b, 4d,
dan 4e (Doumith et al. 2004). Hasil elektroforesis produk PCR multipleks
menunjukkan seluruh 21 isolat L. monocytogenes memberikan hasil positif dengan
primer lmo0737 dan primer lmo1118, sehingga termasuk dalam serogrup 2, yaitu
serotipe 1/2c dan 3c.

Keberadaan Listeria monocytogenes pada Susu Sapi Segar

di Kabupaten Enrekang

Sampel susu segar pada penelitian ini diperoleh dari lima kecamatan yang
merupakan sentra pemeliharaan sapi perah di Kabupaten Enrekang. Sebanyak 107
sampel susu segar yang diperoleh kemudian digabung menjadi 31 sampel pool.
Tahap isolasi dan identifikasi dengan metode kultur konvensional dan konfirmasi
dengan PCR mendeteksi keberadaan bakteri L. monocytogenes pada 21 dari 31
isolat. Tabel 10 menampilkan asal sampel dan jumlah isolat yang terdeteksi L.
monocytogenes.

Tabel 10 Asal sampel dan jumlah isolat yang terdeteksi L. monocytogenes

Jumlah isolat Jumlah isolat terdeteksi
No. Kecamatan
sampel L. monocytogenes
1. Cendana 14 7
2. Anggeraja 7 5
3. Baraka 3 3
4. Enrekang 5 5
5. Alla 2 1
Jumlah 31 21

Proses pengambilan sampel susu segar untuk penelitian ini telah dilakukan
secara aseptik, yaitu dimulai dengan membersihkan ambing sebelum melakukan
pemerahan dan selanjutnya sampel susu segar langsung ditampung dalam botol
kaca steril. Keberadaan bakteri L. monocytogenes yang ditemukan pada sampel
susu segar pada penelitian ini diduga berasal dari sapi yang terinfeksi L.
monocytogenes namun tidak menunjukkan gejala klinis. Hewan ternak yang
terinfeksi L. monocytogenes dapat melepaskan bakteri tersebut melalui feses dan
susu. Pada ruminansia, infeksi L. monocytogenes diketahui dapat menyebabkan
ensefalitis dan infeksi uterus. Infeksi uterus ditandai dengan terjadinya aborsi dan
atau septikemia pada fetus. Bentuk ensefalitis pada hewan yang mengalami
listeriosis ditandai dengan gejala gangguan saraf, misalnya hipersalivasi dan
paralisis unilateral pada wajah (Low dan Donachie 1997) .
 23

Gambar 8 Kondisi kandang tempat pengambilan sampel susu segar. Kandang

yang kotor memungkinkan transmisi L. monocytogenes dari
lingkungan ke hewan ternak. (a) kandang sapi tanpa saluran urin dan
feses yang memadai, (b) tempat pakan dan air minum, (c) tempat
penyimpanan hijauan.

Usaha ternak di Kabupaten Enrekang masih dilaksanakan secara

tradisional. Pemeliharaan sapi umumnya dilakukan sendiri oleh pemilik ternak
tanpa bantuan tenaga kerja tambahan. Proses pemerahan susu juga masih
dilakukan secara manual, yaitu susu segar ditampung dalam wadah berupa ember
ataupun wadah penampung dari kaleng, untuk langsung diolah menjadi produk
lain. Pengamatan yang dilakukan pada lokasi pengambilan sampel untuk
penelitian ini menunjukkan kondisi kandang yang umumnya kurang bersih.
Saluran pembuangan feces dan urin ternak masih buruk, demikian pula dengan
tempat penyimpanan pakan ternak dan air minum (Gambar 8). Kondisi kandang
tersebut dapat menjadi sumber transmisi L. monocytogenes ke hewan ternak.

Pengurutan Oligonukleotida Listeria monocytogenes

Pengurutan Oligonukleotida Parsial Gen hly dari Listeria monocytogenes

Pengurutan oligonukleotida dilakukan terhadap produk PCR dari isolat
kontrol positif L. monocytogenes ATCC 7644, isolat sampel 18A, 18B, 20, 25A,
dan 25B. Hasil analisa kemiripan urutan oligonukelotida gen hly dari isolat sampel
L. monocytogenes yang diperoleh pada penelitian ini menunjukkan persentase
nilai kemiripan sebesar 99% dengan beberapa strain L. monocytogenes yang
terdapat pada basis data di GenBank (Tabel 11).
24

Tabel 11 Analisa kemiripan urutan oligonukleotida isolat sampel L.

monocytogenes dengan basis data GenBank
Persentase
Kode akses
No. Strain L. monocytogenes kemiripan dengan
Genbank
isolat sampel
1. 2015 TE24968, complete genome CP014790.1 99%
2. EGDe, complete genome HG421741.1 99%
3. L2676, complete genome CP007685.1 99%
4. L2626, complete genome CP007684.1 99%
5. J2-031, complete genome CP006593.1 99%
6. 2015 TE19005-1355, complete genome CP014261.1 99%
7. WSLC 1001, complete genome CP007160.1 99%
8. Lm 3163, complete genome CP013722.1 99%
9. L1846, complete genome CP007688.1 99%
10. FSL R2-561, complete genome CP002003.1 99%

Hasil pengurutan oligonukleotida parsial gen hly memperlihatkan deretan

basa nukleotida sepanjang 395 basa, yaitu mulai basa ke-868 sampai dengan basa
ke-1262 dari gen hly. Urutan oligonukleotida parsial gen hly dari isolat yang
diperoleh pada penelitian ini menunjukkan urutan oligonukleotida yang sama
dengan beberapa strain L. monocytogenes yang terdapat pada basis data GenBank,
antara lain strain L2676, EGD, 2015 TE19005-1355, dan 2015 TE24968 (Gambar
9).
 25

Gambar 9 Hasil persejajaran nukleotida isolat sampel dengan beberapa strain L.

monocytogenes yang terdapat pada basis data GenBank.
gb|CP007685.1, L. monocytogenes strain L2676; gi|543859294, L.
monocytogenes strain EGD; gb|CP014261.1, L. monocytogenes strain
2015 TE19005-1355; gb|CP014790.1, L. monocytogenes strain 2015
TE24968
26

PEMBAHASAN

Bakteri L. monocytogenes yang tumbuh pada media laboratorium atau

pada bahan pangan memerlukan faktor–faktor intrinsik dan ekstrinsik media
bakteri tersebut. Kondisi yang diperlukan oleh L. monocytogenes dalam
pertumbuhannya adalah pH antara 4.39–9.4, suhu -1.5–45 ⁰C, aw minimum 0.90
dan nutrisi esensial seperti asam amino (isoleusin, leusin, glutamate, valin,
methionin, arginin, sistein, histidin, dan triptofan) serta biotin, riboflavin, dan
thiamin (Lovett et al. 1990, Donnelly 2001). Media pengayaan Buffered Listeria
Enrichment Broth (LEB) yang digunakan dalam penelitian ini merupakan media
tumbuh yang baik bagi L. monocytogenes dengan kandungan soya broth, yeast
extract, potassium dihydrogen orthophosphate, dan disodium hydrogen
orhthophosphate dengan pH 7.3+0.2. Media Listeria Selective Agar digunakan
untuk menghambat pertumbuhan bakteri selain Listeria. Tahap isolasi dengan
metode kultur konvensional dan uji biokimiawi menghasilkan sebanyak 21 isolat
dinyatakan sebagai L. monocytogenes yang selanjutnya dilakukan konfirmasi
spesies dengan metode PCR.
Reaksi PCR untuk identifikasi spesies L. monocytogenes dilakukan
menggunakan dua pasang primer, yaitu iap dan hlyA. Primer iap didesain dari gen
iap yang mengkode invasive associated protein (p60), sedangkan primer hlyA
didesain dari gen hly yang mengkode Listeriolisin O (LLO). Reaksi PCR
menunjukkan bahwa 21 isolat diidentifikasi sebagai L. monocytogenes, hasil
tersebut sesuai dengan hasil identifikasi melalui metode kultur konvensional.
Beberapa penelitian menunjukkan bahwa deteksi L. monocytogenes dalam bahan
pangan dengan metode PCR baru bisa menunjukkan hasil yang sama dengan
metode konvensional bila jumlah minimal bakteri di dalam bahan pangan tersebut
adalah 100 sel/gram. Konsentrasi bakteri yang lebih rendah bisa dideteksi dengan
melakukan kombinasi metode kultur pengayaan dan PCR. Bila pada bahan
makanan yang diuji terdapat konsentrasi sel bakteri mati yang tinggi, dapat
terdeteksi melalui uji PCR sehingga dilakukan kultur pengayaan sebelum PCR
untuk menambah jumlah sel yang masih hidup saja (Josephson et al. 1993,
Manzano et al. 1996). Karakterisasi molekular melalui analisa hasil pengurutan
oligonukleotida dari isolat sampel L. monocytogenes yang diperoleh dalam
penelitian ini menunukkan terdapat kesamaan sebesar 99% dengan strain–strain
L.monocytogenes yang terdapat pada basis data GenBank.
Kejadian listeriosis pada manusia di Indonesia belum pernah dilaporkan,
demikian pula penelitian tentang keberadaan L. monocytogenes pada susu segar
masih sangat terbatas. Yuliati dan Malaka (2013) mengamati pertumbuhan L.
monocytogenes pada susu dengan penyimpanan pada suhu 4 oC dan menduga
adanya perbedaan serotipe bakteri tersebut, namun tidak melakukan penelitian
lanjutan untuk identifikasi serotipe. Identifikasi serotipe isolat L. monocytogenes
yang diperoleh pada penelitian ini dilakukan dengan metode PCR multipleks dan
menunjukkan hasil bahwa keseluruhan 21 isolat termasuk dalam serogrup 2, yaitu
serotipe 1/2c dan 3c. Sugiri et al. (2013) melakukan identifikasi serotipe L.
monocytogenes yang diisolasi dari daging ayam segar di pasar tradisional dan
supermarket di Bandung, Jawa Barat. Penelitian tersebut juga menggunakan
metode PCR multipleks menurut Doumith et al. (2004), namun memberikan hasil
 27

yang berbeda, yaitu seluruh isolat L. monocytogenes yang diisolasi termasuk

dalam serogrup 3, yang terdiri dari serotipe 1/2b, 3b, dan 7.
Penentuan serotipe L. monocytogenes memiliki implikasi klinis, yaitu
diketahui bahwa serotipe 4b menyebabkan listeriosis endemik pada manusia
sedangkan serotipe 1/2a, 1/2b, dan 1/2c menjadi penyebab listeriosis sporadik.
Penelitian yang dilakukan oleh Goulet et al. (2006) di Perancis menyebutkan
bahwa serotipe 4b, 1/2a, 1/2b, dan 1/2c yang paling banyak diisolasi dari kasus
klinis listeriosis pada manusia, dari jumlah tersebut serotipe 4b menjadi penyebab
49% kasus penyakit endemik foodborne yang dikaitkan dengan Listeria. Pada
studi yang dilakukan oleh Barbour et al. (2001), L. monocytogenes serotipe 4b,
1/2a, 1/2b, dan 1/2c menunjukkan infektivitas yang tinggi setelah inokulasi
intragastrik pada hewan mencit. Pada penelitian tersebut diketahui pula bahwa
seluruh serotipe dari L. monocytogenes, kecuali serotipe 4a, mampu menyebabkan
kematian mencit.

5 KESIMPULAN DAN SARAN

Kesimpulan

Bakteri L. monocytogenes dapat diisolasi dari contoh susu sapi segar yang
diperoleh dari Kabupaten Enrekang, Sulawesi Selatan. Isolasi dan identifikasi
yang dilakukan dengan metode kultur konvensional dan PCR menunjukkan hasil
yang sama, yaitu sebanyak 21 isolat diidentifikasi sebagai L. monocytogenes.
Hasil analisa kemiripan urutan oligonukelotida dari isolat sampel L.
monocytogenes yang diperoleh pada penelitian ini menunjukkan persentase nilai
kemiripan sebesar 99% dengan beberapa strain L. monocytogenes yang terdapat
pada basis data di GenBank. Identifikasi serotipe menunjukkan bahwa
keseluruhan 21 isolat tersebut termasuk dalam serotipe 1/2c dan 3c, hasil tersebut
berbeda dengan yang sudah pernah ditemukan di Indonesia.

Saran

Keberadaan L. monocytogenes pada susu segar di Kabupaten Enrekang

menjadi indikasi perlunya dilakukan pengujian terhadap adanya cemaran bakteri
tersebut pada susu sapi segar di wilayah lainnya. Penelitian lanjutan yang juga
diperlukan adalah karakterisasi virulensi strain L. monocytogenes melalui deteksi
gen yang berkaitan dengan sifat virulensi. Selain itu, juga perlu dilakukan analisis
resiko keberadaan L. monocytogenes terhadap keamanan pangan mengingat
pentingnya bakteri ini dalam industri pangan dan kesehatan masyarakat.
Identifikasi bakteri, penentuan serotipe dan virulensi, serta analisis resiko dari L.
monocytogenes merupakan informasi penting berkaitan dengan epidemiologi L.
monocytogenes.
28

DAFTAR PUSTAKA

Barbas CF, Burton DR, Scott JK, Silverman GJ. 2001. Quantification of DNA and
RNA, CSH Protocol. New York (US): Cold Spring Harbour.
Barbour AH, Rampling A, Hormaeche CE. 2001. Variation in the infectivity of
Listeria monocytogenes isolates following intragastric inoculation of mice.
Infect Immun 69(7): 4657–4660.
Bigot A, Pagniez H, Botton E et al. 2005. Role of FliF and FliI of Listeria
monocytogenes inflagellar assembly and pathogenicity. Infect Immun 73:5530–
5539.
Borucki MK, Call DR. 2003. Listeria monocytogenes serotype identification by
PCR. J Clin Microbiol 41:5537–5540.
[BPS] Badan Pusat Statistik (ID). 2014. Kabupaten Enrekang dalam Angka.
Kabupaten Enrekang (ID): BPS Kabupaten Enrekang.
Bubert A, Kholer S, Goebel W. 1991. The homologous and heterologous regions
within the iap gene allow Genus– and Species–specific identification of
Listeria spp. by polymerase chain reaction. Appl Environ Microbiol 58: 2625–
2632.
[CAC] Codex Almentarius Commission (US). 2007. Guidelines on The
Application of General Principles of Food Hygiene to The Control of Listeria
monocytogenes in Foods [Internet]. Codex Alimentarius. [diunduh 2014
Januari 17]. Tersedia pada: http://www.codexalimentarius.org/standards/list-of-
standards/.
Dalton CB, Austin CC, Sobel J, Hayes PS, Bibb WF, Graves LM, Swaminathan B,
Proctor ME, Griffin PM. 1997. An outbreak of gastroenteritis and fever due to
Listeria monocytogenes in milk. N Engl J Med 336: 100–105.
Donnelly CW. 2001. Listeria monocytogenes. Di dalam: Hui YH, Pierson MD,
Gorham JR, editor. Foodborne Disease Handbook 2nd Edition. New York
(US): Marcel Dekker Inc. hlm 213–245.
Doumith M, Buchrieser C, Glaser P, Jacquet C, Martin P. 2004. Differentiation of
major Listeria monocytogenes serovars by multiplex PCR. J Clin Microbiol
42(8): 3819–3822.
Doumith M, Cazalet C, Simoes N, Frangeul L, Jacquet C, Kunst F, Martin P,
Cossart P, Glaser P, Buchrieser C. 2003. New aspects regarding evolution and
virulence of Listeria monocytogenes revealed by comparative genomics and
DNA arrays. Infect Immun 72(2): 1072–1083
Doyle MP, Glass KA, Bee ry JT, Garcia GA, Pollard DJ, Schultz RD. 1987.
Survival of Listeria monocytogenes in milk during high temperature, short time
pasteurization. App Enviro Microbiol 53: 1433–1438.
Farber JM, Peterkin PI. 1991. Listeria monocytogenes, a food-borne pathogen.
Microbiol Reviews 55(3): 476–511
Forsythe SJ, Hayes PS. 1998. Food Hygiene, Microbiology and HACCP3rd
Edition. Gaithersburg, Maryland (US): Aspen Publisher, Inc.
[FSAI] Food Safey Authority of Ireland (IE). 2005. The Control and Management
of Listeria monocytogenes Contamination of Food. Dublin (IE): FSAI.
Garbutt J. 1997. Essentials of Food Microbiology. Great Britain (GB): The Bath
Press.
 29

Gorski L. 2008. Handbook of Listeria monocytogenes. Liu D, editor. New York

(US): CRC Press.
Goulet V, hedberg C, Le Monnier A, de Valk H. 2006. Increasing incidence of
listeriosis in France and other European countries. Emerg Infect Dis 14(5):
734–740
Gyles CL, Prescott JF, Songer G, Thoen CO. 2010. Pathogenesis of Bacterial
Infections in Animals 4th edition. New Jersey (US): Wiley-Blackwell.
Hamon M, Bierne H, Cossart P. 2006. Listeria monocytogenes: a multifaceted
model. Nature Rev Microbiol 4: 423–434.
Hall TA. 1999. Bioedit: a user-friendly biological sequence alignment editor and
analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl Acids Symp Ser 41: 95–98.
Jacquet C, Gouin E, Jeannel D, Cossart P, Rocourt J. 2002. Expression of ActA,
Ami, IniB, and listeriolysin O in Listeria monocytogenes of human and food
origin. Appl Environ Microbiol 62: 1461–1466.
Johansson T. 1998. Enhanced detection and enumeration of Listeria
monocytogenes from foodstuffs and food processing environments. Int J Food
Microbiol 40: 77–85.
Josephson KL, Gerba CP, Pepper IL. 1993. Polymerase chain reaction detection
of nonviable bacterial pathogens. Appl Environ Microbiol 59: 3513–3515.
Liu D. 2006. Identification, subtyping, and virulence determination of Listeria
monocytogenes, an important foodborne pathogen. J Med Microbiol 55: 645–
659.
Lovett J, Wesley IV, Vandermaaten MJ, Bradshaw JG, Francis DW, Crawford RG,
Donnelly CW, Messer JW. 1990. High–temperature short–time pasteurization
inactivates Listeria monocytogenes. J Food Protect 53(9): 734–738.
Lovett J, Twedt RM. 2004. Scientific Status Summary, Bacteria Associated with
Foodborne Diseases. Chicago (US): Institute of Food Technology.
Low JC, Donachie W. 1997. A review of Listeria monocytogenes and listeriosis.
Vet J 153: 9–29.
Manzano M, Cocolin L, Ferroni P, Cantoni C, Comi G. 1996. A simple and fast
PCR protocol to detect Listeria monocytogenes from meat. J Sci Food Agric
74: 25–30.
O’Neil HS, Marquis H. 2006. Listeria monocytogenes flagella are used for
motility, not as adhesins, to increase host cell invasion. Infect Immun 74:6675–
6681.
Parrisius J, Bhakdi S, Roth M, Tranum-Jensen J, Goebel W, Seelinger HPR. 1986.
Production of listeriolysin by beta–hemolytic strains of Listeria monocytogenes.
Infect Immun 51: 314–319.
Pine L, Malcolm GB, Brooks JB, Daneshvar MI. 1989. Physiological studies on
the growth and utilization of sugars by Listeria species. Can J Microbiol 35:
245–254.
Piyasena P, Liou S, McKellar RC. 1998. Predictive modeling of inactivation of
Listeria spp. in bovine milk during high-temperature short-time pasteurization.
Int J Food Microbiol 39: 167–173.
Ray B. 2001. Fundamental Food Microbiology 2nd edition. New York (US): CRC
Press.
30

Sanjaya AW, Sudarwanto M, Soedjoedono RR, Purnawarman T, Lukman DW,

Latif H. 2007. Higiene Pangan. Bagian Kesehatan Masyarakat Veteriner
Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesmavet. Bogor (ID): FKH IPB.
Seeliger HPR, Jones D. 1986. Listeria. Di dalam: Sneath PHA, Nair NS, Sharpe
NE, Holt JG, Editor. Bergey’s Mannual of Systematic Bacteriology Volume 2.
Baltimore (US): Williams and Wilkins. hlm1235–1245.
Sugiri YD, Kleer J, Golz G, Meeyam T, Chaisowwong W, Alter T. 2013.
Prevalence and antimicrobial susceptibility of Listeria monocytogenes in fresh
poultry products in Bandung, Indonesia [Internet]. [diunduh 2014 Mei 30].
Tersedia pada: http://disnak.jabarprov.go.id/files_arsip/Chicken_Listeria_
Prevalence_Bandung_YONI.pdf
Swetha CS, Rao TM, Krishnaiah N, Kumar V. 2012. Detection of Listeria
monocytogenes in fish samples by PCR assay. Annals Biol Res 3(4):1880–1884.
Vincente MF, Baquero F, Perez-Diaz JC. 1985. Cloning and expression of the
Listeria monocytogenes haemolysin in Escherichia coli. FEMS Microbiol 30:
77–79.
Wiedmann M, Bruce JL, Knorr D, Bodis M, Cole EM, McDowell CI,
McDonough PL, Batt CA. 1996. Ribotype diversity of Listeria monocytogenes
strain associated with outbreaks of listeriosis in ruminants. J Clin Microbiol 34:
1086–1090.
Yuliati NY, Malaka R. 2013. Karakteristik pertumbuhan Listeria
monocytogenesdalam susu selama penyimpanan refrigerator sebagai dasar
dalam pencegahan infeksi asal pangan. Di dalam: Lestari TD, Tasripin DS,
Suryaningsih L, Nurlina L, Baliarti E, Abustam E, Sjofjan O, Tanuwiria H,
Rusmana D, Harlia E, Rahayu S, editor. Peningkatan Produktivitas
Sumberdaya Peternakan. Seminar Nasional Peternakan Berkelanjutan 5;2013
November 12; Bandung, Indonesia. Bandung (ID): Fakultas Peternakan
Universitas Padjajaran. hlm 576–585.
 31

LAMPIRAN

Lampiran 1 Hasil pengukuran kualitas DNA bakteri hasil ekstraksi

Konsentrasi DNA
No. No. isolat A 260 nm A 280 nm A260/A280
(ng/μl)
1. Kontrol + 1.647 0.900 1.83 82.3
2. 2B 0.582 0.344 1.69 29.1
3. 4A 2.056 1.051 1.96 102.8
4. 4B 4.823 3.119 1.55 241.2
5. 5B 2.252 1.195 1.88 112.6
6. 7A 0.009 0.007 2.34 45.26
7. 7B 3.003 1.654 1.82 150.2
8. 14A 1.267 0.627 2.02 63.3
9. 14B 1.443 0.787 1.83 72.1
10. 15B 0.118 0.053 1.92 59.1
11. 16B 1.450 0.786 1.85 72.5
12. 17 3.657 1.810 2.02 182.8
13. 18A 1.012 0.501 2.02 50.6
14. 18B 2.653 1.361 1.95 132.7
15. 19B 0.370 0.150 1.55 185.1
16. 20 3.255 1.727 1.88 162.7
17. 21B 2.427 1.284 1.89 121.3
18. 22B 0.453 0.245 1.85 22.6
19. 23B 0.938 0.492 1.91 46.9
20. 24A 0.824 0.445 1.85 41.2
21. 25A 1.181 0.645 1.83 59.0
22. 25B 0.842 0.446 1.89 42.1
23. 26B 1.775 0.928 1.89 87.7
24. 29B 0.219 0.107 2.04 10.9
25. 30B 0.655 0.347 1.89 32.8
26. Kontrol + 3.277 1.795 1.83 163.8
32

Lampiran 2 Hasil pengurutan oligonukleotida dari isolat kontrol positif L.

monocytogenes ATCC 7644 dan isolat sampel 18A, 18B, 20, 25A,
dan 25B
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
5 15 25 35 45 55
2161190_K_ --GTTATCTC TGCA-ATATC TCA-GTGTGG CGTATGGCCG TCAAGTTTAT TTGAAATTAT
2161193_18 -AGGTATCTC TGCATATATC TCA-GTGTGG CGTATGGCCG TCAAGTTTAT TTGAAATTAT
2161195_18 -GAGTATCTC TGCA-ATATC TCA-GTGTGG CGTATGGCCG TCAAGTTTAT TTGAAATTAT
2161198_20 --GCGATCTC TGCATATATC TCA-GTGTGG CGTATGGCCG TCAAGTTTAT TTGAAATTAT
2161201_25 ---CAATCTC TGCATATATC TCA-GTGTGG CGTATGGCCG TCAAGTTTAT TTGAAATTAT
2161203_25 GCCCCATCTC TGCATATATC TCAAGTGTGG CGTATGGCCG TCAAGTTTAT TTGAAATTAT
Clustal Co ***** **** ***** *** ****** ********** ********** **********

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

65 75 85 95 105 115
2161190_K_ CAACTAATTC CCATAGTACT AAAGTAAAAG CTGCTTTTGA TGCTGCCGTA AGCGGAAAAT
2161193_18 CAACTAATTC CCATAGTACT AAAGTAAAAG CTGCTTTTGA TGCTGCCGTA AGCGGAAAAT
2161195_18 CAACTAATTC CCATAGTACT AAAGTAAAAG CTGCTTTTGA TGCTGCCGTA AGCGGAAAAT
2161198_20 CAACTAATTC CCATAGTACT AAAGTAAAAG CTGCTTTTGA TGCTGCCGTA AGCGGAAAAT
2161201_25 CAACTAATTC CCATAGTACT AAAGTAAAAG CTGCTTTTGA TGCTGCCGTA AGCGGAAAAT
2161203_25 CAACTAATTC CCATAGTACT AAAGTAAAAG CTGCTTTTGA TGCTGCCGTA AGCGGAAAAT
Clustal Co ********** ********** ********** ********** ********** **********

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

125 135 145 155 165 175
2161190_K_ CTGTCTCAGG TGATGTAGAA CTAACAAATA TCATCAAAAA TTCTTCCTTC AAAGCCGTAA
2161193_18 CTGTCTCAGG TGATGTAGAA CTAACAAATA TCATCAAAAA TTCTTCCTTC AAAGCCGTAA
2161195_18 CTGTCTCAGG TGATGTAGAA CTAACAAATA TCATCAAAAA TTCTTCCTTC AAAGCCGTAA
2161198_20 CTGTCTCAGG TGATGTAGAA CTAACAAATA TCATCAAAAA TTCTTCCTTC AAAGCCGTAA
2161201_25 CTGTCTCAGG TGATGTAGAA CTAACAAATA TCATCAAAAA TTCTTCCTTC AAAGCCGTAA
2161203_25 CTGTCTCAGG TGATGTAGAA CTAACAAATA TCATCAAAAA TTCTTCCTTC AAAGCCGTAA
Clustal Co ********** ********** ********** ********** ********** **********

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

185 195 205 215 225 235
2161190_K_ TTTACGGAGG TTCCGCAAAA GATGAAGTTC AAATCATCGA CGGCAACCTC GGAGACTTAC
2161193_18 TTTACGGAGG TTCCGCAAAA GATGAAGTTC AAATCATCGA CGGCAACCTC GGAGACTTAC
2161195_18 TTTACGGAGG TTCCGCAAAA GATGAAGTTC AAATCATCGA CGGCAACCTC GGAGACTTAC
2161198_20 TTTACGGAGG TTCCGCAAAA GATGAAGTTC AAATCATCGA CGGCAACCTC GGAGACTTAC
2161201_25 TTTACGGAGG TTCCGCAAAA GATGAAGTTC AAATCATCGA CGGCAACCTC GGAGACTTAC
2161203_25 TTTACGGAGG TTCCGCAAAA GATGAAGTTC AAATCATCGA CGGCAACCTC GGAGACTTAC
Clustal Co ********** ********** ********** ********** ********** **********

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

245 255 265 275 285 295
2161190_K_ GCGATATTTT GAAAAAAGGC GCTACTTTTA ATCGAGAAAC ACCAGGAGTT CCCATTGCTT
2161193_18 GCGATATTTT GAAAAAAGGC GCTACTTTTA ATCGAGAAAC ACCAGGAGTT CCCATTGCTT
2161195_18 GCGATATTTT GAAAAAAGGC GCTACTTTTA ATCGAGAAAC ACCAGGAGTT CCCATTGCTT
2161198_20 GCGATATTTT GAAAAAAGGC GCTACTTTTA ATCGAGAAAC ACCAGGAGTT CCCATTGCTT
2161201_25 GCGATATTTT GAAAAAAGGC GCTACTTTTA ATCGAGAAAC ACCAGGAGTT CCCATTGCTT
2161203_25 GCGATATTTT GAAAAAAGGC GCTACTTTTA ATCGAGAAAC ACCAGGAGTT CCCATTGCTT
Clustal Co ********** ********** ********** ********** ********** **********

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

305 315 325 335 345 355
2161190_K_ ATACAACAAA CTTCCTAAAA GACAATGAAT TAGCTGTTAT TAAAAACAAC TCAGAATATA
2161193_18 ATACAACAAA CTTCCTAAAA GACAATGAAT TAGCTGTTAT TAAAAACAAC TCAGAATATA
2161195_18 ATACAACAAA CTTCCTAAAA GACAATGAAT TAGCTGTTAT TAAAAACAAC TCAGAATATA
2161198_20 ATACAACAAA CTTCCTAAAA GACAATGAAT TAGCTGTTAT TAAAAACAAC TCAGAATATA
2161201_25 ATACAACAAA CTTCCTAAAA GACAATGAAT TAGCTGTTAT TAAAAACAAC TCAGAATATA
2161203_25 ATACAACAAA CTTCCTAAAA GACAATGAAT TAGCTGTTAT TAAAAACAAC TCAGAATATA
Clustal Co ********** ********** ********** ********** ********** **********

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

365 375 385 395 405 415
2161190_K_ TTGAAACAAC TTCAAAAGCT TATACAGATG GAAAAATTAA CATCGATCAC TCTGGAG-AT
2161193_18 TTGAAACAAC TTCAAAAGCT TATACAGATG GAAAAATTAA CATCGATCAC TCTGGAGGAT
2161195_18 TTGAAACAAC TTCAAAAGCT TATACAGATG GAAAAATTAA CATCGATCAC TCTGGAGGAT
2161198_20 TTGAAACAAC TTCAAAAGCT TATACAGATG GAAAAATTAA CATCGATCAC TCTGGAGAAT
2161201_25 TTGAAACAAC TTCAAAAGCT TATACAGATG GAAAAATTAA CATCGATCAC TCTGGAGAAT
2161203_25 TTGAAACAAC TTCAAAAGCT TATACAGATG GAAAAATTAA CATCGATCAC TCTGGAGAAT
Clustal Co ********** ********** ********** ********** ********** ******* **

....|...
425
2161190_K_ ACGTTGCA
2161193_18 ACGTTGC-
2161195_18 ACGTTGCA
2161198_20 ACGTTGCA
2161201_25 ACGTTGC-
2161203_25 ACGTTGCA
Clustal Co *******
 33

Lampiran 3 Kromatogram isolat kontrol positif L. monocytogenes ATCC 7644

34

Lampiran 4 Kromatogram isolat sampel 18A

 35

Lampiran 5 Kromatogram isolat sampel 18B

36

Lampiran 6 Kromatogram isolat sampel 20

 37

Lampiran 7 Kromatogram isolat sampel 25A

38

Lampiran 8 Kromatogram isolat sampel 25B

 39

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Ujungpandang pada tanggal 15 Februari 1984 sebagai

anak kedua dari pasangan Bapak Totok Prawitosari dan Ibu Suprapti. Pada tahun
2011, penulis menikah dengan Rohan Nurhadi dan dikaruniai seorang putra yang
lahir pada tahun 2012.
Penulis menempuh pendidikan sekolah dasar hingga menengah atas di kota
Makassar. Tahun 2001, penulis menempuh pendidikan S1 Kedokteran Hewan di
Fakultas Kedokteran Hewan IPB, selanjutnya menyelesaikan Pendidikan Profesi
Dokter Hewan pada tahun 2007. Sejak tahun 2010 sampai dengan saat ini, penulis
bekerja sebagai staf dosen di Fakultas Peternakan Universitas Hasanuddin,
Makassar.
Penulis melanjutkan pendidikan magister pada tahun 2013 di Program Studi
Mikrobiologi Medik, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.Tugas akhir
dalam pendidikan magister diselesaikan dengan menyusun karya ilmiah yang
berjudul Isolasi dan Identifikasi Bakteri Listeria monocytogenes dari Susu
Sapi Segar di Kabupaten Enrekang Sulawesi Selatan.