MAKALAH
Oleh :
SEMARANG
2015
I. PENDAHULUAN
A. LATAR BELAKANG
Kromatografi ditemukan oleh Tswett pada tahun 1903. D.T. Day juga
menggunakan kromatografi untuk memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett
lah yang pertama diakui sebagai penemu. Dasar kromatografi lapisan tipis (KLT)
ditetapkan pada tahun 1938 oleh Izmailov dan Schreiber, dan kemudian disempurnakan
oleh Stahl pada tahun 1958. Hasil karya yang baik sekali dari Martin dan Synge pada
tahun 1941 (untuk ini mereka memenangkan Nobel) untuk pengembangan kromatografi
gas dan kromatografi kertas.Pada tahun 1952 Martin dan James mempublikasikan
makalah pertama mengenai kromatografi gas.Pada akhir tahun 1960 an, semakin
banyak usaha dilakukan untuk pengembangan kromatografi cair sebagai suatu teknik
mengimbangi kromatografi gas. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) telah
berhasil dikembangkan dari usaha ini. Kromatografi merupakan teknik yang mana solute
atau zat-zat terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini
melewati suatu kolom kromatografi.
B. RUMUSAN MASALAH
1. Apa saja bagian-bagian dari instrumen HPLC?
2. Bagaimana cara kerja dari instrumen HPLC?
II. PEMBAHASAN
A. BAGIAN-BAGIAN INSTRUMEN HPLC
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong
ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini
biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut.
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat
bercampur yan secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi
dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan
sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada
fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut.
Sementra untuk fase terbalik (fase diam kurang polar dari fase gerak), kemampuan
elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut. Fase gerak sebelum digunakan
harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil ini. Selain itu
adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan, sebab gas akan berkumpul
dengan komonen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan
analsis.
2. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat
sebagaimana syarat wadah pelarut yakni : pompa harus inert terhadap fas gerak. Bahan
yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja than karat, teflon, dan batu nilam.
Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan
mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan
preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan
kecepatan 20 mL/menit.
3. Injektor
Cuplikan harus dimasukan kedalam pangkal kolom (kepala kolom), diusahakan
agar sedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom. Ada dua ragam utama
aliran henti dan pelarut mengalir. Ada 3 macam system injector, yaitu:
a. Stop flow : aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, system
tertutup dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di
dalam cairan kecil dan resolusi tidak dipengaruhi.
b. Septum : septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang digunakan pada
kromatografi gas. Injector ini dapat digunakan pada kinerja sampa 60 – 70 atmosfir.
Tapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut kromatografi cair.
Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injector) dapat menyebabkan
penyumbatan.
c. Loop vaive : tipe injector ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih
besar dari 10µ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor
yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual). Pada posisi
load, sampel diisikan ke dalam loop pada kinerja atmosfir, bila valve difungsikan,
maka sampel akan masuk dalam kolom.
4. Kolom
Kolom merupakan jantung kromatograf. Keberhasilan atau kegagalan analisis
bergantung pada pilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Kolom dapat dibagi
menjadi kolom analitik dan kolom pengaman. Kolom kromatogram yang biasa
digunakan adalah jenis C-18 yang digunakan sebagai fase diam yang mampu
memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, dan tinggi.
Sedangkan kolom pengaman untuk menyaring kotoran dan menjenuhkan fase diam.
5. Detektor
Pertama, semua komponen dari HPLC dihubungkan terlebih dahulu ke power supply.
Pompa atau kompresor dinyalakan. Detektor dinyalakan, komputer dinyalakan, printer
juga dinyalakan karena untuk pengeprinan hasil langsung. Ditunggu hingga 15 menit
terlebih dahulu, lampu yang berwarna merah menyala pada saat dinyalakan, ketika sudah
menyala barulah berwarna hijau. Setelah komponen menyala, LC solution yang terdapat
dalam komputer dibuka, karena hanya ada 1 LC, maka klik LC nomor 1. Setelah itu akan
muncul bagian pengaturannya, cara pengaturannya yaitu klik metode, kemudian
instrumen, parameter seperti komposisi eluen, laju aliran, detektor, dan lamanya waktu
analisis diatur. Dalam pengaturan, diatur secara bertahap tidak boleh langsung sesuai
yang diingankan. Mode pa software LC solution terdapat 2 pilihan yaitu, pertama iso
kratik, iso kratik adalah pengaturan dimana eluen dari awal sampai akhir penggunaan
eluen akan sama. Kedua adalah gradien, yaitu ada tingkatan dimana eluen untuk elusinya
dirubah. Klik detektor uv pada panjang gelombang 254 nm, klik end time. Perhatikan
pembacaan detektor. Selain mengenalkan cara penghidupan HPLC, cara penginjeksian
sampel dilakukan. Penginjeksian sampel dimulai dengan syringe atau alat penginjeksian
dibersihkan terlebih dahulu, setelah bersih dicuci dengan pelarut yang akan digunakan,
klik single star, injeksi run lalu equation information. Terdapat dua pilihan dalam
penginjeksian yaitu automatic sample atau pengambilan sendiri sampel, atau menginjek
dengan sendirinya, dan yang kedua adalah injection volume (jumlah sampel yang ingin
diinjeksikan). Pada proses penginjeksian syringe dimasukkan pada bagian injeksi secara
tegak dan jangan sampai jarumnya bengkok. Kemudian tombol pada tempat injeksi
diputar kearah load, keluarkan cairan, yang terakhir putar ke arah injek, lalu keluarkan
jarum secara hati-hati.
III. PENUTUP
A. KESIMPULAN
Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat
untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan
fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam. Hal-hal yag perlu dketahui
adalah waktu retensi, panjang gelombang, dan berapa flownya.
DAFTAR PUSTAKA
Anonim, KCKT/HPLC.Bandung : UPI.2001. PDF file diakses pada tanggal 13 Oktober 2015
pukul 13.23