CLINICAL SCIENCE SESSION (CSS)

*Kepaniteraan Klinik Senior / G1A218104 / Agustus 2019

**Pembimbing / dr. Ifo Faujiah S, M. Ked (Ped), Sp.A

Milk Oligosaccharides Inhibit Human Rotavirus Infectivity in MA104 Cells

Meika Amsi Munte, S.Ked *

dr. Ifo Faujiah S, M. Ked (Ped), Sp.A **

KEPANITERAAN KLINIK SENIOR

BAGIAN ILMU KESEHATAN ANAK
RUMAH SAKIT UMUM RADEN MATTAHER JAMBI
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS JAMBI
2019
 HALAMAN PENGESAHAN
CLINICAL SCIENCE SESSION (CSS)

MILK OLIGOSACCHARIDES INHIBIT HUMAN ROTAVIRUS

INFECTIVITY IN MA104 CELLS

Meika Amsi Munte, S.Ked

G1A218104

KEPANITERAAN KLINIK SENIOR

BAGIAN IlMU KESEHATAN ANAK

RUMAH SAKIT UMUM RADEN MATTAHER JAMBI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS JAMBI

2019

Jambi, Agustus 2019

Pembimbing:

dr. Ifo Faujiah S, M. Ked (Ped), Sp.A

 KATA PENGANTAR

Segala puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Tuhan yang Maha Esa
atas berkat dan rahmat-Nya penulis dapat menyelesaikan Clinical Science Session
(CSS) dengan judul “OLIGOSAKARIDA SUSU MENGHAMBAT INFEKSI
ROTAVIRUS PADA MANUSIA DALAM SEL MA10” sebagai kelengkapan
persyaratan dalam mengikuti Kepaniteraan Klinik Senior Bagian Ilmu Kesehatan
Anak Rumah Sakit Umum Raden Mattaher Jambi.
Tugas ini bertujuan agar penulis dapat memahami lebih dalam mengenai
teori-teori yang diberikan selama menjalani Kepaniteraan Klinik Senior di Bagian
Ilmu Kesehatan Anak Rumah Sakit Umum Raden Mattaher Jambi dan melihat
penerapannya secara langsung di lapangan.

Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada dr. Ifo
Faujiah S, M. Ked (Ped), Sp.A selaku preseptor yang telah meluangkan waktunya
untuk membimbing penulis yang telah memberikan masukan serta saran sehingga
terwujudnya laporan jurnal ini.

Penulis menyadari adanya keterbatasan dan kekurangan dalam penulisan,

sehingga diharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun dari semua pihak
yang membacanya. Semoga tugas ini dapat memberikan manfaat bagi
perkembangan ilmu pendidikan kedokteran dan kesehatan serta semua pihak yang
membutuhkan.

Jambi, Agustus 2019

Penulis
Oligosakarida Susu Menghambat Infeksi Rotavirus pada Manusia dalam Sel
MA104

Daniel R Laucirica,1 Vassilis Triantis,2 Ruud Schoemaker,2 Mary K

Estes,1 and Sasirekha Ramani1
1 Departemen Virologi Molekuler dan Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran
Baylor, Houston, TX; dan 2 FrieslandCampina, Amersfoort, Belanda

Abstrak
Latar belakang: Oligosakarida dalam ASI berperan sebagai reseptor umpan yang
dapat larut dan mencegah adhesi patogen pada usus bayi. Oligosakarida susu
mengurangi infektivitas strain rotavirus babi; Namun, efeknya pada rotavirus
manusia kurang dimengerti.
Tujuan: Dalam penelitian ini, kami menentukan efek oligosakarida susu spesifik
dan berlimpah pada infektivitas 2 strain rotavirus manusia yang dominan secara
global.
Metode: Empat susu oligosakarida — 2’-fucosyllactose (2’FL), 3’-sialilaktosa
(3’SL), 6’-sialilaktosa (6’SL), dan galacto-oligosakarida — diuji untuk
pengaruhnya terhadap infektifitas bakteri. human rotavirus G1P [8] dan G2P [4]
melalui uji fokus fluoresen pada sel epitel ginjal monyet hijau Afrika (sel MA104).
Oligosakarida ditambahkan pada titik waktu yang berbeda dalam tes infektivitas.
Infeksi tanpa adanya oligosakarida berperan sebagai kontrol.
Hasil: Bila dibandingkan dengan infeksi tanpa glisans, semua oligosakarida secara
substansial mengurangi infektivitas kedua jenis virus rota manusia secara in vitro;
Namun, perbedaan khusus pada efek virus diamati. Dibandingkan dengan infeksi
kontrol, pengurangan maksimum dalam infektivitas G1P [8] terlihat dengan 2’FL
ketika ditambahkan setelah timbulnya infeksi (pengurangan 62%, P <0,01),
sedangkan pengurangan maksimum dalam infektivitas G2P [4] terlihat dengan
campuran 3’SL + 6’SL bila ditambahkan selama infeksi (pengurangan 73%, P
<0,01). Campuran 3’SL + 6’SL pada rasio yang sama seperti yang ada dalam ASI
lebih kuat dalam mengurangi infektivitas G2P [4] (pengurangan 73%, P <0,01)
dibandingkan bila dibandingkan dengan 3’SL (pengurangan 47%) ) atau 6’SL
(pengurangan 40%) secara individual. Untuk semua oligosakarida pengurangan
infektivitas dimediasi oleh efek pada virus dan bukan pada sel.
Kesimpulan: Susu oligosakarida mengurangi infektivitas rotavirus manusia dalam
sel MA104, terutama melalui efek pada virus. Meskipun bayi yang diberi ASI
secara langsung dilindungi, penambahan oligosakarida spesifik untuk susu formula
bayi dapat memberikan manfaat ini untuk bayi yang diberi susu formula.
Kata kunci: oligosakarida susu manusia, reseptor umpan, rotavirus, infeksi, 2’-
fucosyllactose, sialoglycans

Pendahuluan
Oligosakarida susu manusia (HMO) adalah kelompok yang kompleks
secara struktural, glikans tak terkonjugasi yang ditemukan dalam ASI. Rata-rata,
ASI manusia mengandung 5-15 g oligosakarida / L, menjadikan HMO komponen
padat ketiga yang paling banyak dari ASI setelah lipid dan laktosa.1 Profil
oligosakarida dalam ASI beragam, dengan 200 struktur berbeda diidentifikasi
sampai saat ini.2 Pertama kali dideskripsikan sebagai substrat prebiotik untuk
mikrobiota usus bayi, HMO sekarang diakui memainkan banyak peran bermanfaat
dalam neonatus yang sedang berkembang. HMO memodulasi imunitas neonatal
dengan mengubah respon sel epitel dan imun inang dalam usus bayi dan bertindak
sebagai reseptor pemikat yang larut untuk memblokir perlekatan berbagai mikroba
patogen ke reseptor permukaan sel.1 Penelitian in vitro menunjukkan bahwa HMO
mencegah pengikatan dan infeksi sel oleh sejumlah patogen diare seperti
Escherichia coli, Vibrio cholerae, dan Salmonella fyris.3 Sebuah studi populasi pada
pasangan ibu-bayi menunjukkan bahwa konsentrasi fucosyloligosaccharides 2’-
linked yang lebih tinggi (2’FL) dalam ASI berhubungan dengan perlindungan
terhadap diare yang disebabkan oleh bakteri Campylo dan calicivirus.4
Penyakit diare adalah penyebab utama kematian kedua di dunia pada anak-
anak <5 tahun. Di antara agen penyebab diare pada kelompok usia ini, rotavirus
adalah penyebab utama gastroenteritis dehidrasi parah dan bertanggung jawab atas>
215.000 kematian setiap tahunnya.5 Vaksin terhadap rotavirus dilisensikan untuk
digunakan pada tahun 2006 dan telah efektif dalam mengurangi kejadian penyakit
rotavirus parah di negara maju.6 Namun, kemanjuran vaksin rotavirus jauh lebih
rendah di negara-negara berkembang, di mana sebagian besar kasus
gastroenteritis rotavirus parah terjadi.5,6 Studi epidemiologis telah menunjukkan
manfaat perlindungan dari menyusui terhadap gastroenteritis rotavirus parah,
dengan anak-anak yang tidak disusui menunjukkan peningkatan risiko dua kali lipat
dari diare yang disebabkan oleh rotavirus.7,8 Tingkat antigenemia rotavirus lebih
rendah pada bayi yang disusui daripada bayi yang tidak disusui. 9 Beberapa
komponen susu telah terbukti menghasilkan perlindungan terhadap infeksi
rotavirus. Antibodi ASI terhadap rotavirus berkorelasi dengan perlindungan
terhadap infeksi pada neonatus, dan anti-rotavirus IgA dari ASI manusia memiliki
efek menetralkan pada infektivitas rotavirus secara in vitro.10,11
Dalam sebuah kohort pasangan ibu-bayi di Meksiko, kadar lactadherin
protein globule lemak yang lebih tinggi dikaitkan dengan perlindungan terhadap
infeksi rotavirus simtomatik.12 Peran oligosakarida susu dalam perlindungan dari
infeksi rotavirus manusia kurang dipahami dengan baik. Bukti langsung untuk
pengikatan rotavirus ke HMO ditunjukkan melalui studi array glycan. Domain
pengikat glikat (VP8*) dari protein kapsid rotavirus VP4 menunjukkan pengikatan
pada berbagai HMO pada susunan gula shotgun yang dikembangkan melalui
penggunaan kumpulan sampel susu donor, dengan perbedaan spesifik-regangan
pada mitra pengikat.13 HMOs 3’-sialyllactose (3’SL) dan 6’-sialyllactose (6’SL)
menghambat infektivitas strain rotavirus babi OSU (Ohio State University) baik
secara in vitro maupun dalam model loop ileal babi; Namun, efek ini tidak diamati
ketika strain rotavirus manusia diuji.14 Durasi diare yang diinduksi rotavirus dengan
OSU juga berkurang pada anak babi yang diberi campuran galacto-oligosaccharides
rantai pendek (GOS) dan fructo-oligosaccharides rantai panjang; Namun, efek dari
senyawa ini pada strain rotavirus manusia tidak dinilai.15 Dalam penelitian ini, kami
menguji efek oligosakarida susu spesifik dan berlimpah pada infektivitas 2 strain
rotavirus manusia yang dominan secara global dalam sistem infektivitas in vitro.

Metode
Sel dan virus
Infeksi rotavirus dilakukan pada sel epitel ginjal monyet hijau Afrika (sel
MA104), model mapan untuk studi rotavirus in vitro.16 Dua strain rotavirus
manusia, Wa dan DS1, masing-masing mewakili genotipe dominan global G1P [8]
dan G2P [4], diuji. Oligosakarida susu. Kemurnian tinggi (> 95%) oligosakarida
3’SL dan 6’SL (keduanya dari IsoSep), 2’FL, dan galacto-oligosaccharides
[(Vivinal GOS) yang terakhir 2 dari FrieslandCampina DOMO] diuji untuk efeknya
terhadap infektivitas rotavirus. Komponen Vivinal GOS telah dijelaskan
sebelumnya.17 Oligosakarida (konsentrasi 2,5 dan 5,0 mg / mL) dilarutkan dalam
DMEM bebas serum dan disaring dengan melewatkan larutan melalui filter 0,22
mm. DMEM bebas serum tanpa oligosakarida yang difilter melalui filter 0,22 mm
digunakan sebagai kontrol dalam setiap percobaan.

Tes infektivitas
Efek oligosakarida susu pada infektivitas rotavirus dinilai melalui uji fokus
fluoresen standar pada sel MA104.14,18 Pengenceran virus G1P [8] dan G2P [4] yang
menghasilkan, 100-200 unit pembentuk fokus / sumur diuji.

GAMBAR 1 Skema kondisi percobaan. Panah hitam dan abu-abu menunjukkan ada
dan tidak adanya oligosakarida 2’fucosyllactose, galacto-oligosaccharides,
3’sialyllactose, dan 6’sialyllactose di berbagai titik.

Oligosakarida pertama kali ditambahkan selama inokulasi virus dan selama

infeksi untuk menentukan efek pada infektivitas rotavirus (Gambar 1, kondisi 1).
Modifikasi protokol ini kemudian digunakan untuk menilai secara spesifik mode
aktivitas oligosakarida dan efek waktu penambahan oligosakarida pada infektivitas
virus (Gambar 1, kondisi 2-6 dan Gambar Tambahan 1).18-20 Dalam semua
percobaan, infektivitas dengan tidak adanya oligosakarida berfungsi sebagai
kontrol. Metode terperinci untuk pengujian infektivitas disediakan dalam metode
Tambahan.

Analisis data
Setiap kondisi percobaan diuji minimum 3 kali, dengan replikasi teknis
untuk setiap virus dan konsentrasi oligosakarida dimasukkan dalam setiap
pengujian. Sarana dan SD dari minimal 6 titik data diwakili untuk setiap kondisi
dalam tabel dan gambar. Untuk setiap percobaan, titer virus yang diukur dengan
tidak adanya oligosakarida dianggap 100% infektivitas, dan perubahan titer virus di
hadapan oligosakarida dinyatakan sebagai persentase infektivitas dibandingkan
dengan tanpa perawatan oligosakarida. Untuk setiap kondisi, persentase infektivitas
di hadapan setiap oligosakarida dibandingkan dengan persentase infektivitas tanpa
adanya oligosakarida. Dengan pengecualian data yang disajikan pada Tabel 1, di
mana efek kombinasi 3’SL + 6’SL dibandingkan dengan 3’SL dan 6’SL secara
individual, tidak ada perbandingan antara oligosakarida yang berbeda atau antara 2
konsentrasi oligosakarida yang sama telah dilakukan.
Semua analisis statistik dilakukan dengan menggunakan ANOVA dengan
uji post hoc Dunnett pada GraphPad Prism versi 6.0 untuk Windows (Perangkat
Lunak GraphPad). Nilai P yang disesuaikan dengan multiplisitas ditentukan dan
nilai P <0,01 dianggap signifikan secara statistik.

Hasil
Efek oligosakarida susu pada infektivitas virus. Dua konsentrasi masing-
masing oligosakarida diuji untuk menentukan efek pada infektivitas rotavirus
(Gambar 1, kondisi 1). Dibandingkan dengan infeksi yang dilakukan dengan tidak
adanya oligosakarida, penurunan signifikan dalam infektivitas G1P [8] (Gambar
2A) dan G2P [4] (Gambar 2B) diamati dengan semua 4 oligosakarida pada 5 mg /
mL. Pada konsentrasi oligosakarida yang lebih rendah (2,5 mg / mL), pengurangan
signifikan dalam infektivitas G1P [8] dan G2P [4] diamati dengan oligosakarida
sialylated 3’SL dan 6‘SL, tetapi tidak dengan GOS atau 2’FL. Secara keseluruhan,
kami mengamati penurunan 16-40% dalam infektivitas untuk G1P [8] dan
pengurangan 15-47% untuk G2P [4] dengan oligosakarida individu (Tambahan
Tabel 1).
3’SL dan 6’SL adalah HMO sialilasi paling banyak dan telah terbukti
mengurangi infektivitas rotavirus babi OSU in vitro.14 Untuk menentukan apakah
efek penghambatan 3’SL dan 6’SL dapat ditingkatkan dengan campuran
oligosakarbon ini, tes infektivitas dilakukan dengan kombinasi 3’SL + 6’SL pada
rasio yang sama dengan yang ada pada manusia. ASI (29%: 71%). Meskipun
campuran SL tidak lebih efektif
TABEL 1 Kombinasi dari 3’SL dan 6’SL meningkatkan pengurangan infektivitas
G2P [4] tetapi tidak infektivitas G1P [8] dibandingkan dengan masing-masing
glycan saja dalam sel MA1041
Infectivity, % of
no oligosaccharide control

Virus Concentration, 3’SL 6’SL 3’SL + 6’SL

mg/mL

G1P[8] 2.5 73 ± 12* 75 ± 7* 68 ± 13*

5.0 60 ± 9* 63 ± 7* 65 ± 14*
G2P[4] 2.5 54 ± 2*,# 66 ± 5*,# 32 ± 6*
5.0 53 ± 4*,# 60 ± 12*,# 27 ± 4*
Nilai rata-rata adalah 6 SD, n = 3. Infektivitas dengan tidak adanya oligosakarida
dianggap 100% (G1P [8]: 100% ± 8%, G2P [4]: 100% ± 16%). Data diekspresikan
relatif terhadap kontrol no-oligosaccharide. * Berbeda dari kontrol, P, 0,01; #
berbeda dari 3’SL + 6’SL, P, 0,01. MA104, sel epitel ginjal monyet hijau Afrika;
3’SL, 3’-sialyllactose; 6’SL, 6’-sialyllactose.
GAMBAR 2 Susu oligosakarida mengurangi infektivitas strain rotavirus manusia
dalam sel MA104. Efek oligosakarida susu (2’FL, GOS, 3’SL, dan 6’SL) pada
infektivitas 2 strain rotavirus manusia yang relevan secara klinis G1P [8] (A) dan
G2P [4] (B) diuji (lihat Gambar 1, kondisi 1 untuk pengaturan eksperimental). Data
berarti ± SD, dan n ≥ 3 percobaan independen. Infektivitas dengan tidak adanya
oligosakarida dianggap 100% (G1P [8]: 100% ± 8%, G2P [4]: 100% ± 16%) (garis
putus-putus hitam). Data diekspresikan relatif terhadap kontrol no-oligosaccharide.
* Berbeda dari kontrol, P, 0,01. GOS, galacto-oligosaccharide; MA104, sel epitel
ginjal monyet hijau Afrika; 2’FL, 2’-fucosyllactose; 3’SL, 3’-sialyllactose; 6’SL,
6’-sialyllactose. mengurangi infektivitas G1P [8] dari 3’SL dan 6’SL bila
digunakan secara terpisah, kombinasi dari glycans ini lebih kuat dalam mengurangi
infektivitas G2P [4] daripada reduksi yang diamati dengan glycans sialylated
individu (Tabel 1). Campuran SL juga secara signifikan mengurangi infektivitas
G2P [4] dibandingkan dengan GOS atau 2’FL (data tidak ditampilkan). Hasil ini
menunjukkan bahwa 3’SL dan 6’SL bisa lebih efektif dalam menghambat infeksi
rotavirus manusia dalam kombinasi, tetapi efek ini tergantung pada genotipe
rotavirus.
Mode aktivitas
Pengurangan infektivitas rotavirus dapat dimediasi oleh efek oligosakarida
susu pada sel MA104 atau langsung pada virus. Untuk menentukan apakah
oligosakarida memiliki efek langsung pada virus, G1P [8] dan G2P [4]
dipreinkubasi dengan oligosakarida pada suhu 37 ° C selama 2 jam sebelum infeksi
(Gambar 1, kondisi 2). Atau, sel MA104 diobati dengan oligosakarida susu
semalaman pada suhu 37 ° C (Gambar 1, kondisi 3). Sel-sel dipretreatment untuk
durasi yang lebih lama karena tidak ada perbedaan infektivitas yang diamati dengan
pretreatment sel selama 2 jam (data tidak ditunjukkan), dan inkubasi sel Caco-2
yang diperpanjang dengan adanya oligosakarbon susu telah dibuktikan untuk
mengubah ekspresi permukaan glikus sel dan mempengaruhi adhesi E. coli
enteropatogenik.18 Setelah pretreatment virus dengan oligosakarida, reduksi
substansial diamati untuk infektivitas G1P [8] di semua kecuali satu kondisi (2,5
mg / mL 2’FL), dengan kisaran 10-39% penurunan infeksi (Gambar 3A). Tabel
Tambahan 1). Pengurangan signifikan dalam infektivitas diamati di hadapan semua
oligosakarida pada kedua dosis untuk G2P [4], dengan kisaran pengurangan 38-
67% dalam
GAMBAR 3 Susu oligosakarida mengurangi infektivitas strain rotavirus manusia
melalui efek pada virus dan bukan sel MA104. Preinkubasi virus selama 2 jam
dengan adanya oligosakarida susu (2’FL, GOS, 3’SL, dan 6’SL) mengurangi
infektivitas strain rotavirus manusia G1P [8] (A) dan G2P [4] (B) (lihat Gambar 1,
kondisi 2 untuk pengaturan eksperimental), sedangkan preinkubasi sel dengan
adanya oligosakarida susu selama 24 jam tidak mengurangi infektivitas kedua galur
[G1P [8] (C) dan G2P [4] (D); lihat Gambar 1, kondisi 3 untuk pengaturan
eksperimental]. Data berarti ± SD, dan ≥ 3 percobaan independen. Infektivitas tanpa
adanya oligosakarida dianggap 100% (G1P [8]: 100% ± 10%, G2P [4]: 100%
± 9%). infektivitas di semua kondisi (Gambar 3B, Tabel Tambahan 1). Tidak ada
pengurangan infektivitas G1P [8] atau G2P [4] yang terlihat ketika sel-sel tersebut
diobati dengan oligosakarida (Gambar 3C, D). Selanjutnya, efek 5 mg / mL 2’FL
dan 3’SL + 6’SL pada pengikatan dan entri virus dinilai (Tambahan Gambar 1).
Tidak ada perbedaan yang signifikan dalam antigen virus yang terlihat dengan
ELISA setelah pengikatan campuran virus-oligosakarida ke sel pada suhu 4 ° C
selama 1 jam bila dibandingkan dengan pengobatan tanpa-glycan (data tidak
ditunjukkan). Ini sebagian mungkin merupakan hasil dari keterbatasan sensitivitas
ELISA di mana perbedaan dalam nilai kepadatan optik mungkin tidak diamati
ketika titer virus berbeda 50%. Pengurangan yang signifikan dalam pewarnaan
virus intraseluler diamati, bagaimanapun, dengan oligosakarida untuk G1P [8]
(Gambar Tambahan 2A) dan G2P [4] (Gambar Tambahan 2B) setelah pengikatan
pada suhu 4 ° C. Virus dibiarkan menginternalisasi pada suhu 37 ° C selama 1 jam
dan sel-sel diperbaiki sebelum menyelesaikan 1 putaran replikasi virus. Secara
keseluruhan, hasil kami menunjukkan bahwa oligosakarida susu mengurangi
infektivitas rotavirus manusia dengan bertindak terutama pada virus.
Sebanyak 2,5 mg / mL GOS, 2’FL, atau campuran 3’SL + 6’SL digunakan
untuk pretreatment virus selama 2 jam dan ditambahkan selama infeksi untuk
menentukan apakah pengurangan infektivitas lebih lanjut dapat dicapai, khususnya
untuk konsentrasi oligosakarida yang lebih rendah, jika virus dipretreatment dan
oligosakarida juga dipertahankan dalam medium selama infeksi (Gambar 1, kondisi
4). Keberadaan oligosakarida yang terus menerus tidak secara signifikan
meningkatkan reduksi untuk kedua strain dibandingkan dengan pretreatment saja
atau keberadaan glycan hanya selama infeksi. Satu-satunya pengecualian adalah
untuk G2P [4] dan 2’FL, di mana kehadiran yang terus-menerus dari glycan
menghasilkan penurunan 47% dalam infektivitas dibandingkan dengan
pengurangan 15% ketika 2’FL dimasukkan hanya selama infeksi (Tambahan Tabel
1).
Kami selanjutnya ingin menentukan apakah oligosakarida susu memiliki
efek pada infektivitas ketika ditambahkan setelah penyerapan virus pada sel
(Gambar 1, kondisi 5). Pengurangan besar dalam infektivitas diamati di hadapan
semua oligosakarida untuk infeksi G1P [8], dengan pengurangan mulai dari 29%
hingga 62% (Gambar 4A). Besarnya pengurangan lebih besar dengan 2’FL dan
campuran SL daripada apa yang terlihat dengan pretreatment virus dan / atau
keberadaan oligosakarida selama infeksi. Untuk strain G2P [4], pengurangan yang
signifikan hanya diamati dengan 2’FL (45%, P <0,01; Gambar 4B). Karena periode
infeksi 15-jam dapat mencakup 2 siklus replikasi rotavirus, ada kemungkinan
bahwa pengurangan infektivitas dimediasi oleh efek pada partikel virus yang baru
disintesis, daripada efek pada replikasi virus dalam sel. Memang, tidak ada efek
yang terlihat ketika infeksi dihentikan pada 6 jam (Gambar 1, kondisi 6), sesuai
dengan satu siklus replikasi, setelah infeksi sel selama 20 menit dan penambahan
oligosakarida (data tidak ditampilkan). Temuan ini mengkonfirmasi bahwa
oligosakarida susu dapat mengurangi infektivitas rotavirus manusia bahkan setelah
awal infeksi.

Diskusi
Pemblokiran perlekatan mikroba ke sel inang oleh oligo sakarida susu telah
dijelaskan untuk sejumlah patogen enterik. Campylobacter jejuni mengikat H-2
antigen histo-golongan darah kelompok (HBGA) yang diekspresikan pada
permukaan sel inang, dan pengikatan dan infeksi sel-sel inang dihambat oleh
oligosakarida terfosilasi yang menunjukkan kemiripan struktural dengan H-2
HBGA (22). Oligosakarida susu selama 24 jam tidak mengurangi infektivitas
keduanya
GAMBAR 4 Penambahan oligosakarida setelah penyerapan virus mengurangi
infektivitas strain rotavirus manusia dalam sel MA104. Penambahan oligosakarida
(2’FL, GOS, 3’SL, dan 6’SL) setelah penyerapan G1P [8] (A) dan G2P [4] (B)
selama 20 menit mengurangi infektivitas kedua strain (lihat Gambar 1, kondisi 5
untuk pengaturan eksperimental). Data berarti ± SD, dan ≥ 3 percobaan. Infektivitas
tanpa adanya oligosakarida dianggap 100% (G1P [8]: 100% ± 10%, G2P [4]: 100%
± 18%) (garis putus-putus hitam). Data diekspresikan relatif terhadap kontrol no-
oligosaccharide. * Berbeda dari kontrol, P, 0,01. GOS, galacto- oligosaccharide;
MA104, sel epitel ginjal monyet hijau Afrika; 2’FL, 2’- fucosyllactose; 3’SL, 3’-
sialyllactose; 6’SL, 6’-sialyllactose.
GOS secara efektif menghambat adhesi E. coli enteropatogenik pada sel
HEp-2 dan Caco-2.23 Pengikatan protein capsid norovirus dengan HBGA
didokumentasikan dengan baik. Penelitian telah menunjukkan pengikatan protein
kapsid norovirus dengan HMO; 2’FL dan 3’FL ditemukan menempati kantong
pengikatan HBGA pada kapsul norovirus, memberikan dasar struktural untuk
penghambatan virus.24,25 Penelitian ini menunjukkan efektivitas 4 oligosakarida
(2’FL, 3’SL, 6’SL, dan GOS) dalam secara substansial mengurangi infektivitas
rotavirus manusia yang lazim secara global, G1P [8] (Wa) dan G2P [4] (DS1) in
vitro. Meskipun tingkat reduksi tidak dapat secara langsung diekstrapolasi ke
pengaturan in vivo, penelitian ini memberikan bukti prinsip bahwa susu
oligosakarida dapat menghambat infektivitas strain rotavirus manusia yang relevan
secara klinis.
Temuan penelitian ini berbeda dari laporan sebelumnya di mana kumpulan
HMO atau oligosakarida tertentu tidak terbukti memiliki efek pada infektivitas g1P
[8] strain rotavirus manusia. Pengurangan signifikan dalam infektivitas diamati,
bagaimanapun, untuk G5P [7] strain rotavirus babi OSU di hadapan 3’SL, 6’SL,
dan dikumpulkan HMO, tetapi tidak di hadapan 2’FL (14). VP8 * strain rotavirus
babi OSU diketahui mengikat glikans sialilasi, tetapi mengikat HBGA yang tidak
tersialilasi belum dijelaskan. Meskipun HMO tidak mencegah timbulnya infeksi
rotavirus babi, mereka mengurangi durasi diare pada anak babi dengan memiliki
efek pada mikrobiota kolon dan modulasi respon sitokin yang disebabkan oleh
infeksi.15
Konsentrasi oligosakarida susu yang diuji dalam penelitian ini sebanding
dengan penelitian sebelumnya tentang rotavirus hewan.14; Namun, kadarnya lebih
tinggi dari konsentrasi fisiologis HMO individu yang ada dalam ASI.1 Perlu dicatat
bahwa dengan tidak adanya HMO asam lainnya, konsentrasi 3’SL + 6’SL yang diuji
dalam penelitian ini sesuai dengan jumlah total HMO asam yang ada dalam ASI
(10-20% dari total HMO).1 Selain itu, akun oligosakarida berfukosilasi untuk; 50%
dari total HMO.1 Oligosakrosa berfluosilasi paling banyak adalah 2’FL, yang
ditemukan pada konsentrasi # 4,5 mg / mL.26 Konsentrasi oligosakarida individu
diuji dalam tes infektivitas in vitro karena itu mirip dengan konsentrasi fraksi
oligosakarida asam hadir dalam ASI dan konsentrasi biologis 2’FL. Selain itu,
konsentrasi yang lebih tinggi mungkin diperlukan dalam pengujian in vitro di mana
oligosakarida ditambahkan pada satu titik selama infeksi bila dibandingkan dengan
kondisi fisiologis di mana seorang anak menerima beberapa makanan selama
periode 15 jam yang sama.
Penelitian ini menunjukkan bahwa baik oligosakarida sialylated dan
fucosylated dapat mengurangi infektivitas rotavirus manusia. Ini menarik dalam
konteks penelitian tentang reseptor permukaan sel untuk strain rotavirus manusia.
Secara klasik, banyak strain rotavirus manusia, termasuk G1P [8], diperkirakan
menggunakan residu asam sialic internal pada permukaan sel sebagai reseptor.
Namun, semakin banyak bukti menunjukkan bahwa HBGA adalah faktor
keterikatan penting untuk rotavirus manusia.27 Secara khusus, glikos berfososilasi,
termasuk H-tipe 1 dan Lewis b HBGA, sekarang diakui sebagai mitra pengikatan
potensial untuk strain G1P [8] dan G2P [4].28 Semua susu oligosakarida yang diuji
dalam penelitian ini dapat mengurangi infektivitas strain rotavirus manusia G1P [8]
dan G2P [4]. Dibandingkan dengan infeksi tanpa oligosakarida, penurunan
maksimum infektivitas G1P [8] diamati dengan 5 mg / mL 2’FL ketika ditambahkan
setelah timbulnya infeksi (pengurangan 62%), sedangkan pengurangan maksimum
G2P [4] infektivitas diamati dengan campuran 3’SL dan 6’SL (5 mg / mL) ketika
ditambahkan selama infeksi (pengurangan 73%). Meskipun kami mengamati
perbedaan strain spesifik dalam efek oligosakarida susu, semua glycan tampaknya
bekerja pada virus dan bukan pada sel. Oligosakarida susu telah terbukti
memengaruhi proliferasi, maturasi, dan karakteristik pertumbuhan sel epitel usus
manusia.29-32; Namun, penelitian pendahuluan kami menunjukkan bahwa aksi
oligosakarida pada sel tampaknya memiliki efek terbatas pada replikasi virus.
Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menjelaskan apakah pengurangan
infektivitas dimediasi oleh aktivitas reseptor umpan oligosakarida 'mencegah
pengikatan virus ke reseptor permukaan sel atau sebagai akibat dari efek pada
masuknya virus.
Meskipun oligosakarida tunggal tidak sepenuhnya memblokir infektivitas
rotavirus dalam garis sel epitel ginjal monyet MA104 yang diubah, ada
kemungkinan bahwa efek langsung dari oligosakarida pada virus, bersama-sama
dengan komponen lain dari imunitas usus dan pertahanan bawaan, akan
menghasilkan penghambatan infektivitas yang lebih besar. Kami telah
menunjukkan penggunaan kultur enteroid usus manusia sebagai model praklinis
baru untuk rotavirus.33 Menguji oligosakarida susu untuk pengaruhnya pada
infektivitas rotavirus dalam kultur enteroid usus manusia akan memungkinkan
evaluasi senyawa ini dalam sistem kultur manusia yang relevan secara fisiologis
dan untuk menjelaskan apakah, selain efek langsung pada virus, ada efek lebih
lanjut dari HMO pada host epitel usus yang memengaruhi infektivitas rotavirus.
Studi semacam itu akan penting untuk menerjemahkan temuan saat ini dari bangku
laboratorium ke populasi manusia.
 Meskipun penting bagi bayi yang sedang berkembang, HMO bukan
merupakan komponen dari formula bayi yang tersedia secara komersial. Efek
perlindungan oligosakarida susu diberikan kepada anak-anak yang disusui, tetapi
tidak semua anak disusui secara eksklusif, apakah karena alasan medis, keadaan,
atau pilihan pribadi ibu. Dalam kasus ini, susu formula bayi digunakan untuk
menambah atau mengganti ASI sebagai sarana gizi. Susu formula bayi sebagian
besar diproduksi dari susu sapi, dan oligosakarida dalam susu sapi jauh lebih sedikit
dan lebih kompleks daripada yang ada dalam ASI. Ada peningkatan minat dalam
penambahan HMO pada formula bayi dan untuk menentukan apakah suplementasi
dengan HMO spesifik memberikan manfaat yang sama dengan ASI. Dalam uji
klinis pengujian susu formula yang ditambah dengan 2’FL, bayi yang diberi susu
formula yang ditambah menunjukkan pertumbuhan dan pengambilan 2’FL yang
serupa dengan bayi yang disusui.26
Meskipun optimalisasi lebih lanjut dari konsentrasi efektif dan pengujian
dalam model preklinis dan studi pada manusia diperlukan, pengurangan infektivitas
rotavirus oleh oligosakarida susu memberikan insentif tambahan untuk
penambahan oligosakarida khusus untuk susu formula dan dapat memberikan
manfaat tambahan untuk bayi yang diberi susu formula.

Ucapan Terima Kasih

Tanggung jawab penulis adalah sebagai berikut — DRL: merancang dan
melakukan percobaan dan menganalisis data; MKE dan SR: mengawasi proyek,
merancang eksperimen dan menganalisis data; VT dan RS: memberikan reagen dan
saran konseptual untuk merancang percobaan; DRL dan SR: menulis draf awal
naskah; dan semua penulis: memberikan ulasan kritis dan persetujuan akhir dari
naskah.
Daftar Pustaka
1. Bode L. Human milk oligosaccharides: every baby needs a sugar mama.
Glycobiology 2012; 22: 1147–62.
2. Ninonuevo MR, Park Y, Yin H, Zhang J, Ward RE, BH Clowers, German
JB, Freeman SL, Killeen K, Grimm R, et al. A strategy for notating the
human milk glycome. J Agric Food Chem 2006; 54: 7471–80.
3. Coppa GV, Zampini L, Galeazzi T, Facinelli B, Ferrante L, Capretti R,
Orazio G. Human milk oligosaccharides inhibit the adhesion to Caco-2 cells
of diarrheal pathogens: Escherichia coli, Vibrio cholerae, and Salmonella
fyris. Pediatr Res 2006; 59: 377–82.
4. Morrow AL, Ruiz-Palacios GM, Altaye M, Jiang X, Guerrero ML,
Meinzen-Derr JK, Farkas T, Chaturvedi P, Pickering LK, Newburg DS.
Human milk oligosaccharides are associated with protection against
diarrhea in breast-fed infants. J Pediatr 2004; 145: 297-303.
5. Tate JE, Burton AH, Boschi-Pinto C, Parashar UD; WHO-Coordinated
Global Rotavirus Surveillance Network. Global, regional, and national
estimates of rotavirus mortality in children <5 years of age, 2000–2013. Clin
Infect Dis 2016; 62 (Suppl 2): S96-105.
6. Jiang V, Jiang B, Tate J, Parashar UD, Patel MM. Performance of crime
vaccines in developed and developing countries. Hum Vaccin 2010; 6: 532–
42.
7. Plenge-Boig nig, Soto-Ramirez N, Karmaus W, Petersen G, Davis S, Forster
J. Breastfeeding protects against acute gastroenteritis due to rotavirus in
infants. Eur J Pediatr 2010; 169: 1471–6.
8. Kurugo Z, Geylani S, Karaca Y, Umay F, Erensoy S, Vardar F, Bak M,
Yaprak I, Ozkinay F, Ozkinay C. Rotavirus gastroenteritis among children
under five years of age in Izmir, Turkey. Turk J Pediatr 2003; 45: 290–4.
9. Das S, Sahoo GC, Das P, Singh UK, Jaiswal AK, Singh P, Kumar R, Kumar
R. Evaluating the impact of breastfeeding on rotavirus antigenemia and
disease severity in Indian children. PLoS One 2016; 11: e0146243.
10. Jayashree S, Bhan MK, Kumar R, Bhandari N, Sazawal S. Protection
against neonatal rotavirus infection by breast milk antibodies and trypsin
 inhibitors. J Med Virol 1988; 26: 333–8.
11. Asensi MT, Martinez-Costa C, Buesa J. Anti-rotavirus antibodies in human
milk: quantification and neutralizing activity. J Pediatric Gastroenterologist
Nutr 2006; 42: 560-7.
12. Newburg DS, Peterson JA, Ruiz-Palacios GM, Matson DO, Morrow AL,
Shults J, Guerrero ML, Chaturvedi P, Newburg SO, Scallan CD, et al. Role
of human-milk lactadherin in protection against symptomatic rotavirus
infection. Lancet 1998; 351: 1160-4.
13. Yu Y, Lasanajak Y, Song X, Hu L, Ramani S, Mickum ML, Ashline DJ,
Prasad BV, Estes MK, Reinhold VN, et al. Human milk contains novel
glycans that are potential decoy receptors for neonatal rotaviruses. Mol Cell
Proteomics 2014; 13: 2944–60.
14. Hester SN, Chen X, Li M, Monaco MH, Comstock SS, Kuhlenschmidt TB,
Kuhlenschmidt MS, Donovan SM. Human milk oligosaccharides inhibit
rotavirus infectivity in vitro and in acutely infected piglets. Br J Nutr 2013;
110: 1233–42.
15. Li M, Monaco MH, Wang M, Comstock SS, Kuhlenschmidt TB, Fahey GC
Jr., Miller MJ, Kuhlenschmidt MS, Donovan SM. Human milk
oligosaccharides shorten rotavirus-induced diarrhea and modulate piglet
mucosal immunity and colonic microbiota. ISME J 2014; 8: 1609-20.
16. Ciarlet M, Estes MK, Barone C, Ramig RF, Conner ME. Analysis of host
range restriction determinants in the rabbit model: comparison of
immunologic and heterologous rotavirus infections. J Virol 1998; 72: 2341–
51.
17. van Leeuwen SS, BJ Kuipers, Dijkhuizen L, Kamerling JP. Comparative
structural characterization of 7 commercial galacto-oligosaccharide (GOS)
products. Carbohydr Res 2016; 425: 48–58.
18. Ciarlet M, Crawford SE, Cheng E, Blutt SE, Rice DA, Bergelson JM, Estes
MK. VLA-2 (alpha2beta1) integrin promotes rotavirus entry into cells but
is not necessary for rotavirus attachment. J Virol 2002; 76: 1109-23.
19. Gutie´rrez M, Isa P, Sanchez-San Martin C, Prez-Vargas J, Espinosa R,
Arias CF, Lpez S. Different rotavirus strains enter MA104 cells through
 different endocytic pathways: the role of clathrin-mediated endocytosis. J
Virol 2010; 84: 9161-9.
20. Zrate S, Cuadras MA, Espinosa R, Romero P, Jurez KO, Camacho-Nuez M,
Arias CF, Lpez S. Interaction of rotaviruses with Hsc70 during cell entry is
mediated by VP5. J Virol 2003; 77: 7254–60.
21. Angeloni S, Ridet JL, Kusy N, Gao H, Crevoisier F, Guinchard S, Kochhar
S, Sigrist H, Sprenger N. Glycoprofiling with micro-arrays of
glycoconjugates and lectins. Glycobiology 2005; 15: 31–41.
22. Ruiz-Palacios GM, Cervantes LE, Ramos P, Chavez-Munguia B, Newburg
DS. Campylobacter jejuni binds intestinal H (O) antigen (Fuc alpha 1, 2 Gal
beta 1, 4GlcNAc), and fucosyloligosaccharides of human milk inhibit its
binding and infection. J Biol Chem 2003; 278: 14112-20.
23. Shoaf K, Mulvey GL, Armstrong GD, Hutkins RW. Prebiotic gal-
actooligosaccharides reduce adherence of enteropathogenic Escherichia coli
to tissue culture cells. Infect Immun 2006; 74: 6920–8.
24. Schroten H, Hanisch FG, Hansman GS. Human norovirus interactions with
GOS - blood group antigens and human milk oligosaccharides. J Virol 2016;
90: 5855-9.
25. Weichert S, Koromyslova A, Singh BK, Hansman S, Jennewein S, Schroten
H, Hansman GS. Structural basis for norovirus inhibition by human milk
oligosaccharides. J Virol 2016; 90: 4843–8.
26. Marriage BJ, Buck RH, Goehring KC, Oliver JS, Williams JA. Infants fed
a lower calorie formula with 2 # FL show growth and 2 # FL uptake like
breast-fed infants. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2015; 61: 649–58.
27. Hu L, Crawford SE, Czako R, Cortes-Penfield NW, Smith DF, Le Pendu J,
Estes MK, Prasad BV. Cell attachment VP8 protein * of a human rotavirus
specifically interacts with A-type histo-blood group antigens. Nature 2012;
485: 256-9.
28. Huang P, Xia M, Tan M, Zhong W, Wei C, Wang L, Morrow A, Jiang X.
Spike protein VP8 * of human rotavirus recognizes histo-blood group
antigens in a type-specific manner. J Virol 2012; 86: 4833–43.
29. Holscher HD, Davis SR, Tappenden KA. Human milk oligosaccharides
 influence the maturation of human intestinal Caco-2Bbe and HT-29 cell
lines. J Nutr 2014; 144: 586–91.
30. Kuntz S, Kunz C, Rudloff S. Oligosaccharides from human milk induce
growth arrest via G2 / M by influencing growth-related cell cycle genes in
intestinal epithelial cells. Br J Nutr 2009; 101: 1306-15.
31. Kuntz S, Rudloff S, Kunz C. Oligosaccharides from human milk influencing
growth-related characteristics of intestinally transformed and non-
transformed intestinal cells. Br J Nutr 2008; 99: 462–71.
32. Hester SN, Donovan SM. Individual and combined effects of nucleosides
and human milk oligosaccharides on proliferation, apoptosis and necrosis in
a human fetal intestinal cell line. Food Nutrition Sci 2012; 3: 1567–76.
33. Saxena K, Blutt SE, Ettayebi K, Zeng XL, Broughman JR, Crawford SE,
Karandikar UC, Sastri NP, Conner ME, Opekun AR, et al. Human intestinal
enteroids: a new model for the study of human rotavirus infection, host
restriction, and pathophysiology. J Virol 2015; 90: 43–56.
 TELAAH JURNAL
Oligosakarida Susu Menghambat Infeksi Rotavirus pada Manusia dalam Sel
MA104
A. PICO
Patient of problem
Penyakit diare adalah penyebab utama kematian kedua di dunia pada anak-
anak <5 tahun. Di antara agen penyebab diare pada kelompok usia ini, rotavirus
adalah penyebab utama gastroenteritis dehidrasi parah dan bertanggung jawab atas>
215.000 kematian setiap tahunnya. Vaksin terhadap rotavirus dilisensikan untuk
digunakan pada tahun 2006 dan telah efektif dalam mengurangi kejadian penyakit
rotavirus parah di negara maju. Namun, kemanjuran vaksin rotavirus jauh lebih
rendah di negara-negara berkembang, di mana sebagian besar kasus gastroenteritis
rotavirus parah terjadi. Studi epidemiologis bahwa anak-anak yang tidak disusui
menunjukkan peningkatan risiko dua kali lipat dari diare yang disebabkan oleh
rotavirus. Oligosakarida dalam ASI berperan sebagai reseptor umpan yang dapat
larut dan mencegah adhesi patogen pada usus bayi. Oligosakarida susu mengurangi
infektivitas strain rotavirus babi; Namun, efeknya pada rotavirus manusia kurang
dimengerti.

Intervention
4 susu oligosakarida — 2’-fucosyllactose (2’FL), 3’-sialilaktosa (3’SL), 6’-
sialilaktosa (6’SL), dan galacto-oligosakarida (GOS) — diuji untuk pengaruhnya
terhadap infektifitas bakteri. human rotavirus G1P [8] dan G2P [4] melalui uji fokus
fluoresen pada sel epitel ginjal monyet hijau Afrika (sel MA104). Oligosakarida
(konsentrasi 2,5 dan 5,0 mg / mL) dilarutkan dalam DMEM bebas serum dan
disaring dengan melewatkan larutan melalui filter 0,22 mm. Oligosakarida
ditambahkan pada titik waktu yang berbeda dalam tes infektivitas yaitu pertama
kali ditambahkan selama inokulasi virus dan selama infeksi untuk menentukan efek
pada infektivitas rotavirus. Infeksi tanpa adanya oligosakarida berperan sebagai
kontrol.
Comparison
Sebuah studi populasi pada pasangan ibu-bayi menunjukkan bahwa
konsentrasi fucosyloligosaccharides 2’-linked yang lebih tinggi (2’FL) dalam ASI
berhubungan dengan perlindungan terhadap diare yang disebabkan oleh bakteri
Campylo dan calicivirus sementara hasil penelitan ini menunjukkan 2’FL juga
dapat melindungi dari diare yang disebabkan oleh rotavirus. Temuan penelitian ini
berbeda dari laporan sebelumnya di mana kumpulan HMO atau oligosakarida
tertentu tidak terbukti memiliki efek pada infektivitas g1P [8] strain rotavirus
manusia. Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa aksi oligosakarida pada sel
tampaknya memiliki efek terbatas pada replikasi virus.

Outcome
 Penelitian ini menunjukkan bahwa bila dibandingkan dengan infeksi tanpa
glisans, semua oligosakarida (2 ‘FL, 3 ‘SL, 6 ‘SL, dan GOS) dalam secara
substansial mengurangi infektivitas kedua jenis virus rota manusia secara in
vitro.
 Dibandingkan dengan infeksi kontrol, pengurangan maksimum dalam
infektivitas G1P [8] terlihat dengan 2’FL ketika ditambahkan setelah
timbulnya infeksi (pengurangan 62%, P <0,01), sedangkan pengurangan
maksimum dalam infektivitas G2P [4] terlihat dengan campuran 3’SL +
6’SL bila ditambahkan selama infeksi (pengurangan 73%, P <0,01).
 Campuran 3’SL + 6 ‘SL pada rasio yang sama seperti yang ada dalam ASI
lebih kuat dalam mengurangi infektivitas G2P [4] (pengurangan 73%, P
<0,01) dibandingkan bila dibandingkan dengan 3’SL (pengurangan 47%) )
atau 6’SL (pengurangan 40%) secara individual.
 Untuk semua oligosakarida pengurangan infektivitas dimediasi oleh efek
pada virus dan bukan pada sel.

B. VIA
Validity
a. Metode Penelitian
Metode penelitian ini adalah eksperimental dengan studi kohort.
b. Waktu penelitian
 Penelitian ini dilakukan tahun 2017.
c. Subjek penelitian
Populasi pada penelitian ini adalah sel epitel ginjal monyet hijau Afrika (sel
MA104) dengan 2 strain rotavirus manusia yang dominan secara global Wa dan
DS1, masing-masing mewakili genotipe dominan global G1P [8] dan G2P [4].
d. Tujuan penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk menentukan efek oligosakarida susu spesifik dan
berlimpah pada infektivitas 2 strain rotavirus manusia yang dominan secara
global.
e. Analisa Statistik
Semua analisis statistik dilakukan dengan menggunakan ANOVA dengan uji
post hoc Dunnett pada GraphPad Prism versi 6.0 untuk Windows (Perangkat
Lunak GraphPad). Nilai P yang disesuaikan dengan multiplisitas ditentukan dan
nilai P <0,01 dianggap signifikan secara statistik.

Importance
Hasil penelitian ini penting karena memberi informasi bahwa semua susu
oligosakarida yang diuji dapat mengurangi infektivitas strain rotavirus manusia
G1P [8] dan G2P [4]. Oligosakarida susu telah terbukti memengaruhi proliferasi,
maturasi, dan karakteristik pertumbuhan sel epitel usus manusia. Meskipun bayi
yang diberi ASI secara langsung dilindungi, penambahan oligosakarida spesifik
untuk susu formula bayi dapat memberikan manfaat terutama bayi yang tidak
disusui secara eksklusif, apakah karena alasan medis, keadaan, atau pilihan pribadi
ibu.

Applicabality
Susu formula bayi sebagian besar diproduksi dari susu sapi, dan oligosakarida
dalam susu sapi jauh lebih sedikit dan lebih kompleks daripada yang ada dalam
ASI. Informasi dari jurnal ini dapat digunakan untuk memberikan insentif tambahan
untuk penambahan oligosakarida khusus untuk susu formula sehingga dapat
memberikan manfaat tambahan untuk bayi yang diberi susu formula. Mengingat
HMO bukan merupakan komponen dari formula bayi yang tersedia secara
komersial, penelitian bisa dilakukan di Pabrik pengolahan susu formula untuk anak.
 The Journal of Nutrition
Nutrition and Disease

See corresponding commentary on page 1605.

Milk Oligosaccharides Inhibit Human Rotavirus

Infectivity in MA104 Cells
Daniel R Laucirica,1 Vassilis Triantis,2 Ruud Schoemaker,2 Mary K Estes,1 and Sasirekha Ramani1
1
Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, Houston, TX; and 2FrieslandCampina, Amersfoort,

Downloaded from https://academic.oup.com/jn/article-abstract/147/9/1709/4743531 by guest on 04 August 2019

Netherlands

Abstract
Background: Oligosaccharides in milk act as soluble decoy receptors and prevent pathogen adhesion to the infant gut.
Milk oligosaccharides reduce infectivity of a porcine rotavirus strain; however, the effects on human rotaviruses are less
well understood.
Objective: In this study, we determined the effect of specific and abundant milk oligosaccharides on the infectivity of 2
globally dominant human rotavirus strains.
Methods: Four milk oligosaccharides—2#-fucosyllactose (2#FL), 3#-sialyllactose (3#SL), 6#-sialyllactose (6#SL), and
galacto-oligosaccharides—were tested for their effects on the infectivity of human rotaviruses G1P[8] and G2P[4] through
fluorescent focus assays on African green monkey kidney epithelial cells (MA104 cells). Oligosaccharides were added at
different time points in the infectivity assays. Infections in the absence of oligosaccharides served as controls.
Results: When compared with infections in the absence of glycans, all oligosaccharides substantially reduced the
infectivity of both human rotavirus strains in vitro; however, virus strain–specific differences in effects were observed.
Compared with control infections, the maximum reduction in G1P[8] infectivity was seen with 2#FL when added after the
onset of infection (62% reduction, P < 0.01), whereas the maximum reduction in G2P[4] infectivity was seen with the
mixture of 3#SL + 6#SL when added during infection (73% reduction, P < 0.01). The mixture of 3#SL + 6#SL at the same
ratio as is present in breast milk was more potent in reducing G2P[4] infectivity (73% reduction, P < 0.01) than when
compared with 3#SL (47% reduction) or 6#SL (40% reduction) individually. For all oligosaccharides the reduction in
infectivity was mediated by an effect on the virus and not on the cells.
Conclusions: Milk oligosaccharides reduce the infectivity of human rotaviruses in MA104 cells, primarily through an effect
on the virus. Although breastfed infants are directly protected, the addition of specific oligosaccharides to infant formula
may confer these benefits to formula-fed infants. J Nutr 2017;147:1709–14.

Keywords: human milk oligosaccharides, decoy receptors, rotavirus, infection, 2#-fucosyllactose, sialoglycans

Introduction
Human milk oligosaccharides (HMOs) are a group of structur-
ally complex, unconjugated glycans that are found in human milk.
Supported by FrieslandCampina. DRL, MKE, and SR are supported in part by NIH
grant R01AI105101.
Author disclosures: DRL, MKE, and SR, no conflicts of interest. VT and RS are
full-time employees of the study’s sponsor.
Supplemental Figures 1 and 2, Supplemental Methods, and Supplemental Table
1 are available from the ‘‘Online Supporting Material’’ link in the online posting of
the article and from the same link in the online table of contents at http://jn.
nutrition.org.
Address correspondence to SR (e-mail: ramani@bcm.edu).
Abbreviations used: GOS, galacto-oligosaccharide; HMO, human milk oligosac-
charide; MA104 cells, African green monkey kidney epithelial cells; OSU, Ohio
State University; 2#FL, 2#-fucosyllactose; 3#SL, 3#-sialyllactose; 6#SL, 6#-sialyllactose.
ã 2017 American Society for Nutrition.
On average, human breast milk contains 5–15 g oligosaccharides/L,
making HMOs the third most abundant solid component of breast
milk after lipids and lactose (1). The profile of oligosaccharides in
human milk is diverse, with ;200 different structures identified
to date (2). First described as prebiotic substrates for the infant gut
microbiota, HMOs are now recognized to play numerous beneficial
roles in the developing neonate. HMOs modulate neonatal immunity
by altering host epithelial and immune cell responses in the infant gut
and acting as soluble decoy receptors to block the attachment of
various microbial pathogens to cell-surface receptors (1). In vitro
studies have shown that HMOs prevent binding and infection of
cells by a number of diarrheal pathogens such as Escherichia
coli, Vibrio cholerae, and Salmonella fyris (3). A population
study on mother-infant pairs showed that higher concentrations

Manuscript received December 13, 2016. Initial review completed January 25, 2017. Revision accepted May 30, 2017. 1709
First published online June 21, 2017; doi: https://doi.org/10.3945/jn.116.246090.
of 2#-linked fucosyloligosaccharides (2#FL) in human milk are
associated with protection against diarrhea caused by Campylo-
bacter and calicivirus (4).
Diarrheal disease is the second leading cause of death
worldwide in children <5 y old. Among the causative agents of
diarrhea in this age group, rotavirus is the leading cause of severe
dehydrating gastroenteritis and is responsible for >215,000 deaths
annually (5). Vaccines against rotavirus were licensed for use in
2006 and have been effective in reducing the incidence of severe
rotavirus disease in developed countries (6). The efficacy of
rotavirus vaccines, however, is far lower in developing countries,
where most cases of severe rotavirus gastroenteritis occur (5, 6).
Epidemiologic studies have demonstrated the protective benefits of
breastfeeding against severe rotavirus gastroenteritis, with chil-
dren who are not breastfed showing a 2-fold increased risk of
rotavirus-induced diarrhea (7, 8). Rotavirus antigenemia rates are
lower in breastfed infants than in infants who are not breastfed (9).
Several milk components have been shown to elicit protection
against rotavirus infections. Maternal milk antibodies against
rotavirus correlate with protection against infection in neonates,
and anti-rotavirus IgA from human breast milk has a neutralizing
effect on rotavirus infectivity in vitro (10, 11). In a cohort of
mother-infant pairs in Mexico, higher levels of fat globule protein
lactadherin were associated with protection against symptomatic
rotavirus infection (12). The role of milk oligosaccharides in
protection from human rotavirus infections is less well understood.
Direct evidence for the binding of rotavirus to HMOs was shown
through glycan array studies. The glycan-binding domain (VP8*)
of rotavirus capsid protein VP4 demonstrated binding to various
HMOs on a shotgun glycan array developed through use of a pool
of donor milk samples, with strain-specific differences in binding
partners (13). HMOs 3#-sialyllactose (3#SL) and 6#-sialyllactose
FIGURE 1 Schematic of experimental conditions. Black and gray arrows indicate the presence and absence of oligosaccharides
2#fucosyllactose, galacto-oligosaccharides, 3#sialyllactose, and 6#sialyllactose at various points.
1710 Laucirica et al.
(6#SL) inhibited the infectivity of porcine rotavirus strain OSU
(Ohio State University) both in vitro and in a piglet ileal loop
model; however, this effect was not observed when a human
rotavirus strain was tested (14). The duration of rotavirus- induced
diarrhea with OSU also was reduced in piglets fed a mixture of
short-chain galacto-oligosaccharides (GOSs) and long-chain
fructo-oligosaccharides; however, the effect of these compounds
on human rotavirus strains was not assessed (15). In the present
study, we tested the effect of specific and abundant milk
oligosaccharides on the infectivity of 2 globally dominant human
rotavirus strains in an in vitro infectivity system.
Methods
Downloaded from https://academic.oup.com/jn/article-abstract/147/9/1709/4743531 by guest on 04 August 2019
Cells and viruses. Rotavirus infections were carried out on African
green monkey kidney epithelial cells (MA104 cells), a well-established
model for rotavirus studies in vitro (16). Two human rotavirus strains, Wa
and DS1, representing the globally dominant genotypes G1P[8] and
G2P[4], respectively, were tested.
Milk oligosaccharides. The high purity (>95%) oligosaccharides 3#SL and
6#SL (both from IsoSep), 2#FL, and galacto-oligosaccharides [(Vivinal GOS)
the latter 2 from FrieslandCampina DOMO] were tested for their effect on
rotavirus infectivity. The components of Vivinal GOS have been described
previously (17). The oligosaccharides (concentrations of 2.5 and 5.0 mg/mL)
were dissolved in serum-free DMEM and filtered by passing the solution
through a 0.22-mm filter. Serum-free DMEM without oligosaccharides filtered
through a 0.22-mm filter was used as a control in each experiment.
Infectivity assays. The effect of milk oligosaccharides on rotavirus
infectivity was assessed through standard fluorescent focus assays on
MA104 cells (14, 18). The dilutions of G1P[8] and G2P[4] viruses that
yielded ;100–200 focus-forming units/well were tested. Oligosaccharides
were first added during virus inoculation and during the course of infection to
determine the effects on rotavirus infectivity (Figure 1, condition 1).
Modifications of this protocol were then used to assess specifically the
mode of oligosaccharide activity and effect of timing of oligosaccharide
addition on virus infectivity (Figure 1, conditions 2–6 and Supplemental
Figure 1) (18–20). In all of the experiments, infectivity in the absence of
oligosaccharides served as the control. Detailed methods for the infectivity
assays are provided in the Supplemental Methods.

Data analysis. Each experimental condition was tested a minimum of

3 times, with technical replicates for each virus and oligosaccharide
concentration included within each assay. The means and SDs from a
minimum of 6 data points are represented for each condition in the tables and
figures. For each experiment, virus titer measured in the absence of
oligosaccharides was considered to be 100% infectivity, and changes in virus
titer in the presence of oligosaccharides were expressed as percentage of

Downloaded from https://academic.oup.com/jn/article-abstract/147/9/1709/4743531 by guest on 04 August 2019

infectivity compared with no oligosaccharide treatment. For each condition, the
percentage of infectivity in the presence of each oligosaccharide was compared
with the percentage of infectivity in the absence of oligosaccha- rides. With the
exception of the data presented in Table 1, where the effect of the combination
of 3#SL + 6#SL was compared with 3#SL and 6#SL individually, no
comparisons between different oligosaccharides or between 2 concentrations
of the same oligosaccharide were carried out. All of the statistical analyses were
performed with use of ANOVA with Dunnett’s post hoc test on GraphPad
Prism version 6.0 for Windows (GraphPad Software). Multiplicity-adjusted P
values were determined and P values <0.01 were considered to be statistically
significant.

FIGURE 2 Milk oligosaccharides reduce the infectivity of human

Results rotavirus strains in MA104 cells. The effect of milk oligosaccharides (2#FL,
GOS, 3#SL, and 6#SL) on the infectivity of 2 clinically relevant human
Effects of milk oligosaccharides on virus infectivity. Two rotavirus strains G1P[8] (A) and G2P[4] (B) was tested (see Figure 1,
concentrations of each oligosaccharide were tested to determine condition 1 for experimental setup). Data are means 6 SDs, n $3
the effect on rotavirus infectivity (Figure 1, condition 1). Compared independent experiments. Infectivity in the absence of oligosaccha-
with infections carried out in the absence of oligosaccharides, rides was considered to be 100% (G1P[8]: 100% 6 8%, G2P[4]:
significant reductions in the infectivity of G1P[8] (Figure 2A) and 100% 6 16%) (black dotted line). Data are expressed relative to the
G2P[4] (Figure 2B) were observed with all 4 oligosaccharides at 5 no-oligosaccharide control. *Different from control, P , 0.01. GOS,
mg/mL. At lower oligosaccharide concentrations (2.5 mg/mL), galacto-oligosaccharide; MA104, African green monkey kidney epithelial
cells; 2#FL, 2#-fucosyllactose; 3#SL, 3#-sialyllactose; 6#SL, 6#-sialyllactose.
significant reductions in infectivity of G1P[8] and G2P[4] were
observed with the sialylated oligosaccharides 3#SL and 6#SL, but reducing the infectivity of G1P[8] than 3#SL and 6#SL when used
not with GOSs or 2#FL. Overall, we observed a 16–40% reduction separately, the combination of these glycans was more potent at
in infectivity for G1P[8] and a 15–47% reduction for G2P[4] with reducing G2P[4] infectivity than the reduction observed with the
individual oligosaccharides (Supplemental Table 1). individual sialylated glycans (Table 1). The SL mixture also
3#SL and 6#SL are the most abundant sialylated HMOs and significantly reduced G2P[4] infectivity compared with GOSs or
have been shown to reduce the infectivity of porcine rotavirus OSU 2#FL (data not shown). These results indicate that 3#SL and 6#SL
in vitro (14). To determine whether the inhibitory effects of 3#SL could be more effective at inhibiting human rotavirus infection in
and 6#SL could be enhanced with a mixture of these oligosaccha- combination, but this effect is dependent on the rotavirus genotype.
rides, infectivity assays were carried out with a combination
of 3#SL + 6#SL at a ratio similar to that in human breast milk Mode of activity. The reduction in rotavirus infectivity can be
(29%:71%). Although the SL mixture was not more effective at mediated by the effect of milk oligosaccharides on MA104 cells or
directly on the virus. To determine whether the oligosaccharides
TABLE 1 Combination of 3#SL and 6#SL enhances reduction of have a direct effect on the virus, G1P[8] and G2P[4] were
G2P[4] infectivity but not G1P[8] infectivity compared with each preincubated with the oligosaccharides at 37°C for 2 h before
glycan alone in MA104 cells1 infection (Figure 1, condition 2). Alternatively, MA104 cells were
Infectivity, % of
treated with milk oligosaccharides overnight at 37°C (Figure 1,
no oligosaccharide control
condition 3). The cells were pretreated for a longer duration
because no differences in infectivity were observed with the
Virus Concentration, mg/mL 3#SL 6#SL 3#SL + 6#SL
pretreatment of cells for 2 h (data not shown), and extended
G1P[8] 2.5 73 6 12* 75 6 7* 68 6 13* incubation of Caco-2 cells in the presence of milk oligosaccha-
5.0 60 6 9* 63 6 7* 65 6 14* rides has been demonstrated to alter cell surface glycan expression
G2P[4] 2.5 54 6 2*,# 66 6 5*,# 32 6 6* and affect adhesion of enteropathogenic E. coli (21). Following
5.0 53 6 4*,# 60 6 12*,# 27 6 4* pretreatment of virus with oligosaccharides, substantial reduc-
tions were observed for G1P[8] infectivity in all but one condition
1
Values are means 6 SDs, n = 3. Infectivity in the absence of oligosaccharides was (2.5 mg/mL 2#FL), with a range of 10–39% reduction in infec-
considered to be 100% (G1P[8]: 100% 6 8%, G2P[4]: 100% 6 16%). Data are
expressed relative to the no-oligosaccharide control. *Different from control, P , 0.01;
tivity (Figure 3A, Supplemental Table 1). Significant reduction in
#
different from 3#SL + 6#SL, P , 0.01. MA104, African green monkey kidney epithelial infectivity was observed in the presence of all oligosaccharides at
cells; 3#SL, 3#-sialyllactose; 6#SL, 6#-sialyllactose. both doses for G2P[4], with a range of 38–67% reduction in

Milk oligosaccharides inhibit rotavirus infection 1711


FIGURE 3 Milk oligosaccharides reduce the infectivity of human
rotavirus strains through an effect on the virus and not MA104 cells.
Preincubation of virus for 2 h in the presence of milk oligosaccharides
(2#FL, GOS, 3#SL, and 6#SL) reduces the infectivity of human rotavirus
strains G1P[8] (A) and G2P[4] (B) (see Figure 1, condition 2 for
experimental setup), whereas preincubation of cells in the presence of
milk oligosaccharides for 24 h does not reduce the infectivity of both
strains [G1P[8] (C) and G2P[4] (D); see Figure 1, condition 3 for
experimental setup]. Data are means 6 SDs, n $3 independent
experiments. Infectivity in the absence of oligosaccharides was consid-
ered to be 100% (G1P[8]:100% 6 10%, G2P[4]: 100% 6 9%). (black
infectivity across all conditions (Figure 3B, Supplemental Table 1).
No reduction in G1P[8] or G2P[4] infectivity was seen when the
cells were pretreated with any of the oligosaccharides (Figure 3C, D).
Furthermore, the effect of 5 mg/mL 2#FL and 3#SL + 6#SL on virus
binding and entry was assessed (Supplemental Figure 1). No
significant difference in virus antigen was seen with ELISA
following binding of the virus-oligosaccharide mixture to cells at
4°C for 1 h when compared with no-glycan treatment (data not
shown). This in part may be the result of the limitations in the
sensitivity of ELISA wherein differences in optical density values
may not be observed when virus titers differ by 50%. A significant
reduction in intracellular virus staining was observed, however, with
both oligosaccharides for G1P[8] (Supplemental Figure 2A) and
G2P[4] (Supplemental Figure 2B) following binding at 4°C. The
viruses were allowed to internalize at 37°C for 1 h and the cells were
Downloaded from https://academic.oup.com/jn/article-abstract/147/9/1709/4743531 by guest on 04 August 2019
fixed before completing 1 round of virus replication. Overall, our
results suggest that milk oligosaccharides reduce human rotavirus
infectivity by acting primarily on the virus.
A total of 2.5 mg/mL GOS, 2#FL, or the mixture 3#SL + 6#SL
were used for pretreatment of the virus for 2 h and added during
infection to determine whether a further reduction in infectivity
could be achieved, particularly for lower oligosaccharide con-
centrations, if viruses were pretreated and oligosaccharides also
maintained in the medium during the course of infection (Figure
1, condition 4). The continued presence of oligosaccharides did
not significantly enhance reduction for either strain compared
with pretreatment alone or the presence of glycan only during
infection. The only exception was for G2P[4] and 2#FL, in which
the continued presence of the glycan resulted in a 47% reduction
in infectivity as compared with a 15% reduction when 2#FL was
included only during infection (Supplemental Table 1).
We next wanted to determine whether milk oligosaccharides have
an effect on infectivity when added after virus absorption on cells
(Figure 1, condition 5). A substantial reduction in infectivity was
observed in the presence of all oligosaccharides for G1P[8] infectiv- ity,
with reduction ranging from 29% to 62% (Figure 4A). The magnitude
of reduction was greater with 2#FL and the SL mixture than what was
seen with the pretreatment of virus and/or presence of oligosaccharides
during infection. For the G2P[4] strain, a significant reduction was
observed only with 2#FL (45%, P < 0.01; Figure 4B). Because the 15-
h infection period may encompass 2 cycles of rotavirus replication, it
is possible that the reduction in infectivity was mediated by an effect
on newly synthesized virus particles, rather than an effect on virus
replication within cells. Indeed, no effect was seen when the infection
was stopped at 6 h (Figure 1, condition 6), corresponding to one
replication cycle, following the infection of cells for 20 min and the
addition of oligosaccharides (data not shown). These findings confirm
that milk oligosaccharides can reduce human rotavirus infectivity even
after the initial onset of infection.
Discussion
Blocking of microbial attachment to host cells by milk oligo-
saccharides has been described for a number of enteric patho-
gens. Campylobacter jejuni binds H type 2 histo-blood group
antigen (HBGA) expressed on host cell surfaces, and the binding
and infection of host cells was inhibited by fucosylated oligosac-
charides that show structural similarity to H type 2 HBGA (22).
dotted line). Data are expressed relative to the no-oligosaccharide control.
*Different from control, P , 0.01. GOS, galacto-oligosaccharide; MA104,
African green monkey kidney epithelial cells; 2#FL, 2#-fucosyllactose;
3#SL, 3#-sialyllactose; 6#SL, 6#-sialyllactose.
1712 Laucirica et al.

FIGURE 4 Addition of oligosaccharides after virus absorption re-
duces the infectivity of human rotavirus strains in MA104 cells. Addition
of oligosaccharides (2#FL, GOS, 3#SL, and 6#SL) after absorption of G1P
[8] (A) and G2P[4] (B) for 20 min reduces infectivity of both strains (see
Figure 1, condition 5 for experimental setup). Data are means 6 SDs,
n $3 experiments. Infectivity in the absence of oligosaccharides was
considered to be 100% (G1P[8]: 100% 6 10%, G2P[4]: 100% 6 18%)
(black dotted line). Data are expressed relative to the no-oligosaccharide
control. *Different from control, P , 0.01. GOS, galacto-oligosaccharide;
MA104, African green monkey kidney epithelial cells; 2#FL, 2#-
fucosyllactose; 3#SL, 3#-sialyllactose; 6#SL, 6#-sialyllactose.
GOSs effectively inhibit the adhesion of enteropathogenic E. coli to
both HEp-2 and Caco-2 cells (23). The binding of norovirus capsid
protein to HBGA is well documented. Studies have demonstrated the
binding of norovirus capsid protein to HMOs; 2#FL and 3#FL were
found to occupy HBGA binding pockets on the norovirus capsid,
providing a structural basis for virus inhibition (24, 25). The present
study demonstrates the effectiveness of 4 oligosaccharides (2#FL,
3#SL, 6#SL, and GOS) in substantially reducing the infectivity of
globally prevalent human rotaviruses G1P[8] (Wa) and G2P[4] (DS1)
in vitro. Although the levels of reduction cannot be directly
extrapolated to in vivo settings, this study provides a proof of
principle that milk oligosaccharides can inhibit the infectivity of
clinically relevant human rotavirus strains.
The findings of this study differ from a previous report in which
pooled HMOs or specific oligosaccharides were not shown to have
an effect on the infectivity of a G1P[8] human rotavirus strain. A
significant reduction in infectivity was observed, however, for a
G5P[7] porcine rotavirus strain OSU in the presence of 3#SL, 6#SL,
and pooled HMOs, but not in the presence of 2#FL (14). The VP8*
of porcine rotavirus strain OSU is known to bind sialylated glycans,
but binding to nonsialylated HBGA has not been described.
Although HMOs did not prevent the onset of porcine rotavirus
infection, they did reduce the duration of diarrhea in piglets by
having an effect on colonic microbiota and the modulation of
cytokine responses induced by infection (15).
The concentrations of milk oligosaccharides tested in this study
are comparable to previous studies on animal rotaviruses (14);
however, the levels are higher than the physiological concentra-
tions of individual HMOs present in breast milk (1). It should be
noted that in the absence of other acidic HMOs, the concentration
of 3#SL + 6#SL tested in the present study match the total amount
of acidic HMOs present in breast milk (10–20% of total HMOs)
(1). Furthermore, fucosylated oligosaccharides account for ;50%
of total HMOs (1). The most abundant fucosylated oligosaccha-
ride is 2#FL, which is found at concentrations #4.5 mg/mL (26).
The concentrations of individual oligosaccharides tested in the in
vitro infectivity assays are therefore similar to the concentration of
the acidic oligosaccharide fraction present in breast milk and
the biological concentration of 2#FL. In addition, higher
concentrations may be required in in vitro assays in which the
oligosaccharides are added at a single point during infection when
compared with physiological conditions in which a child receives
Downloaded from https://academic.oup.com/jn/article-abstract/147/9/1709/4743531 by guest on 04 August 2019
multiple feeds during the same 15-h period.
The present study demonstrates that both sialylated and
fucosylated oligosaccharides can reduce the infectivity of human
rotaviruses. This is interesting in the context of studies on cell-
surface receptors for human rotavirus strains. Classically, many
human rotavirus strains, including G1P[8], were thought to use
internal sialic acid residues on cell surfaces as receptors. A
growing body of evidence suggests, however, that HBGAs are
important attachment factors for human rotaviruses (27).
Specifically, fucosylated glycans, including H-type 1 and Lewis b
HBGA, are now recognized as potential binding partners for both
G1P[8] and G2P[4] strains (28). All of the milk oligosac- charides
tested in the present study could reduce the infectivity of human
rotavirus strains G1P[8] and G2P[4]. Compared with infections
in the absence of oligosaccharides, the maximum reduction in
G1P[8] infectivity was observed with 5 mg/mL 2#FL when added
after the onset of infection (62% reduction), whereas the maximum
reduction in G2P[4] infectivity was observed with the mixture of
3#SL and 6#SL (5 mg/mL) when added during infection (73%
reduction). Although we observed strain-specific differences in the
effect of milk oligosaccharides, all glycans appear to act on the virus
rather than on the cells. Milk oligosaccharides have been shown to
affect the proliferation, maturation, and growth characteristics of
human intestinal epithelial cells (29–32); however, our preliminary
studies suggest that the action of the oligosaccharides on cells
appears to have a limited effect on virus replication. Further studies
are required to elucidate whether the reduction in infectivity is
mediated by decoy receptor activity of the oligosaccharides’
preventing the binding of the virus to cell surface receptors or as the
result of an effect on virus entry.
Although single oligosaccharides did not completely block
rotavirus infectivity in the transformed monkey kidney epithelial
cell line MA104, it is possible that the direct effects of oligosac-
charides on the virus, together with other components of intes-
tinal immunity and innate defenses, would result in greater
inhibition of infectivity. We have demonstrated the use of human
intestinal enteroid cultures as new preclinical models for
rotaviruses (33). Testing milk oligosaccharides for their effect on
rotavirus infectivity in human intestinal enteroid cultures will
allow the evaluation of these compounds in a physiologically
relevant human culture system and to elucidate whether, in
addition to direct effects on the virus, there are further effects of
HMOs on the host intestinal epithelium that affect rotavirus
infectivity. Such studies will be important to translate the present
findings from the laboratory bench to the human population.
Despite their importance to the developing infant, HMOs are not
a component of any commercially available infant formula. The
protective effects of milk oligosaccharides are conferred to children
who are breastfed, but not all children are breastfed exclusively,
Milk oligosaccharides inhibit rotavirus infection 1713

whether because of medical reasons, circumstances, or mothers’
personal choice. In these cases, infant formula is used to supplement
or replace human milk as a means of nutrition. Infant formulas are
produced largely from bovine milk, and oligosaccharides in bovine
milk are far less abundant and complex than those in human milk.
There is growing interest in the addition of HMOs to infant formula
and to determine whether supplementation with specific HMOs
confers similar benefits to those of human breast milk. In clinical
trials testing milk formula supplemented with 2#FL, infants fed the
supplemented formula showed growth and 2#FL uptake that were
similar to breastfed infants (26). Although further optimization of
effective concentrations and testing in preclinical models and human
studies is required, the reduction of rotavirus infectivity by milk
oligosaccharides provides an added incentive for the addition of
specific oligosaccharides to infant formula and could confer
additional benefits to formula-fed infants.
Acknowledgments
The authors’ responsibilities were as follows—DRL: designed and
performed the experiments and analyzed the data; MKE and SR:
supervised the project, designed the experiments and analyzed the
data; VT and RS: provided the reagents and conceptual advice for
designing the experiments; DRL and SR: wrote the initial draft of the
manuscript; and all authors: provided critical review and final
approval of the manuscript.
References
1. Bode L. Human milk oligosaccharides: every baby needs a sugar mama.
Glycobiology 2012;22:1147–62.
2. Ninonuevo MR, Park Y, Yin H, Zhang J, Ward RE, Clowers BH,
German JB, Freeman SL, Killeen K, Grimm R, et al. A strategy for an-
notating the human milk glycome. J Agric Food Chem 2006;54:7471–80.
3. Coppa GV, Zampini L, Galeazzi T, Facinelli B, Ferrante L, Capretti R,
Orazio G. Human milk oligosaccharides inhibit the adhesion to Caco-2
cells of diarrheal pathogens: Escherichia coli, Vibrio cholerae, and
Salmonella fyris. Pediatr Res 2006;59:377–82.
4. Morrow AL, Ruiz-Palacios GM, Altaye M, Jiang X, Guerrero ML,
Meinzen-Derr JK, Farkas T, Chaturvedi P, Pickering LK, Newburg DS.
Human milk oligosaccharides are associated with protection against
diarrhea in breast-fed infants. J Pediatr 2004;145:297–303.
5. Tate JE, Burton AH, Boschi-Pinto C, Parashar UD; WHO-Coordinated
Global Rotavirus Surveillance Network. Global, regional, and national
estimates of rotavirus mortality in children <5 years of age, 2000–2013.
Clin Infect Dis 2016;62(Suppl 2):S96–105.
6. Jiang V, Jiang B, Tate J, Parashar UD, Patel MM. Performance of ro-
tavirus vaccines in developed and developing countries. Hum Vaccin
2010;6:532–42.
7. Plenge-Bönig A, Soto-Ramirez N, Karmaus W, Petersen G, Davis S,
Forster J. Breastfeeding protects against acute gastroenteritis due to
rotavirus in infants. Eur J Pediatr 2010;169:1471–6.
8. Kurugöl Z, Geylani S, Karaca Y, Umay F, Erensoy S, Vardar F, Bak M,
Yaprak I, Ozkinay F, Ozkinay C. Rotavirus gastroenteritis among children
under five years of age in Izmir, Turkey. Turk J Pediatr 2003;45:290–4.
9. Das S, Sahoo GC, Das P, Singh UK, Jaiswal AK, Singh P, Kumar R, Kumar
R. Evaluating the impact of breastfeeding on rotavirus antigenemia and
disease severity in Indian children. PLoS One 2016;11:e0146243.
10. Jayashree S, Bhan MK, Kumar R, Bhandari N, Sazawal S. Protection
against neonatal rotavirus infection by breast milk antibodies and
trypsin inhibitors. J Med Virol 1988;26:333–8.
11. Asensi MT, Martinez-Costa C, Buesa J. Anti-rotavirus antibodies in
human milk: quantification and neutralizing activity. J Pediatr Gastro-
enterol Nutr 2006;42:560–7.
12. Newburg DS, Peterson JA, Ruiz-Palacios GM, Matson DO, Morrow AL,
Shults J, Guerrero ML, Chaturvedi P, Newburg SO, Scallan CD, et al. Role
of human-milk lactadherin in protection against symptomatic rotavirus
infection. Lancet 1998;351:1160–4.
1714 Laucirica et al.
13. Yu Y, Lasanajak Y, Song X, Hu L, Ramani S, Mickum ML, Ashline DJ,
Prasad BV, Estes MK, Reinhold VN, et al. Human milk contains novel
glycans that are potential decoy receptors for neonatal rotaviruses. Mol
Cell Proteomics 2014;13:2944–60.
14. Hester SN, Chen X, Li M, Monaco MH, Comstock SS, Kuhlenschmidt TB,
Kuhlenschmidt MS, Donovan SM. Human milk oligosaccharides inhibit
rotavirus infectivity in vitro and in acutely infected piglets. Br J Nutr
2013;110:1233–42.
15. Li M, Monaco MH, Wang M, Comstock SS, Kuhlenschmidt TB, Fahey
GC Jr., Miller MJ, Kuhlenschmidt MS, Donovan SM. Human milk
oligosaccharides shorten rotavirus-induced diarrhea and modulate piglet
mucosal immunity and colonic microbiota. ISME J 2014;8:1609–20.
16. Ciarlet M, Estes MK, Barone C, Ramig RF, Conner ME. Analysis of host
range restriction determinants in the rabbit model: comparison of ho-
mologous and heterologous rotavirus infections. J Virol 1998;72:2341–51.
17. van Leeuwen SS, Kuipers BJ, Dijkhuizen L, Kamerling JP. Comparative
structural characterization of 7 commercial galacto-oligosaccharide
Downloaded from https://academic.oup.com/jn/article-abstract/147/9/1709/4743531 by guest on 04 August 2019
(GOS) products. Carbohydr Res 2016;425:48–58.
18. Ciarlet M, Crawford SE, Cheng E, Blutt SE, Rice DA, Bergelson JM,
Estes MK. VLA-2 (alpha2beta1) integrin promotes rotavirus entry into
cells but is not necessary for rotavirus attachment. J Virol 2002;76: 1109–
23.
19. Gutiérrez M, Isa P, Sanchez-San Martin C, Prez-Vargas J, Espinosa R,
Arias CF, Lpez S. Different rotavirus strains enter MA104 cells through
different endocytic pathways: the role of clathrin-mediated endocytosis. J
Virol 2010;84:9161–9.
20. Zrate S, Cuadras MA, Espinosa R, Romero P, Jurez KO, Camacho-
Nuez M, Arias CF, Lpez S. Interaction of rotaviruses with Hsc70 during
cell entry is mediated by VP5. J Virol 2003;77:7254–60.
21. Angeloni S, Ridet JL, Kusy N, Gao H, Crevoisier F, Guinchard S, Kochhar
S, Sigrist H, Sprenger N. Glycoprofiling with micro-arrays of
glycoconjugates and lectins. Glycobiology 2005;15:31–41.
22. Ruiz-Palacios GM, Cervantes LE, Ramos P, Chavez-Munguia B,
Newburg DS. Campylobacter jejuni binds intestinal H(O) antigen (Fuc
alpha 1, 2Gal beta 1, 4GlcNAc), and fucosyloligosaccharides of human
milk inhibit its binding and infection. J Biol Chem 2003;278:14112–20.
23. Shoaf K, Mulvey GL, Armstrong GD, Hutkins RW. Prebiotic gal-
actooligosaccharides reduce adherence of enteropathogenic Escherichia
coli to tissue culture cells. Infect Immun 2006;74:6920–8.
24. Schroten H, Hanisch FG, Hansman GS. Human norovirus interactions
with GOS -blood group antigens and human milk oligosaccharides. J
Virol 2016;90:5855–9.
25. Weichert S, Koromyslova A, Singh BK, Hansman S, Jennewein S,
Schroten H, Hansman GS. Structural basis for norovirus inhibition by
human milk oligosaccharides. J Virol 2016;90:4843–8.
26. Marriage BJ, Buck RH, Goehring KC, Oliver JS, Williams JA. Infants
fed a lower calorie formula with 2#FL show growth and 2#FL uptake
like breast-fed infants. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2015;61:649–58.
27. Hu L, Crawford SE, Czako R, Cortes-Penfield NW, Smith DF, Le Pendu J,
Estes MK, Prasad BV. Cell attachment protein VP8* of a human rotavirus
specifically interacts with A-type histo-blood group antigen. Nature
2012;485:256–9.
28. Huang P, Xia M, Tan M, Zhong W, Wei C, Wang L, Morrow A, Jiang
X. Spike protein VP8* of human rotavirus recognizes histo-blood group
antigens in a type-specific manner. J Virol 2012;86:4833–43.
29. Holscher HD, Davis SR, Tappenden KA. Human milk oligosaccharides
influence maturation of human intestinal Caco-2Bbe and HT-29 cell
lines. J Nutr 2014;144:586–91.
30. Kuntz S, Kunz C, Rudloff S. Oligosaccharides from human milk induce
growth arrest via G2/M by influencing growth-related cell cycle genes in
intestinal epithelial cells. Br J Nutr 2009;101:1306–15.
31. Kuntz S, Rudloff S, Kunz C. Oligosaccharides from human milk influ-
ence growth-related characteristics of intestinally transformed and non-
transformed intestinal cells. Br J Nutr 2008;99:462–71.
32. Hester SN, Donovan SM. Individual and combined effects of nucleo- tides
and human milk oligosaccharides on proliferation, apoptosis and necrosis
in a human fetal intestinal cell line. Food Nutr Sci 2012;3: 1567–76.
33. Saxena K, Blutt SE, Ettayebi K, Zeng XL, Broughman JR, Crawford SE,
Karandikar UC, Sastri NP, Conner ME, Opekun AR, et al. Human intestinal
enteroids: a new model to study human rotavirus infection, host restriction, and
pathophysiology. J Virol 2015;90:43–56.