LINDAWATI SETYANINGRUM

M.FARM., APT
• Merupakan Kromatografi cair
• Fase gerak adalah pelarut/campuran pelarut;
disebut sistem pengembang atau eluen
• Fase diam berupa lempeng tipis umumnya dari
silika gel yang ditebarkan pada permukaan
kaca/aluminium/plastik
• Pemisahan terjadi karena interaksi analit yang
larut di dalam fase gerak dengan fase diam pada
tekanan dan suhu ruang
• Termasuk Kromatografi Planar
 Low cost, and minimal amount of equipment is
needed
 Short analysis time
 Ease of sample preparation
 All spots can be visualized
 Sample cleanup is seldom necessary
 Adaptable to most pharmaceuticals
 Uses small quantities of solvents
 Reliable and quick
• Waktu analisis lebih cepat
• Fase diam tidak mengandung serabut  dapat
mengurangi pelebaran zona
• Diperlukan sampel lebih sedikit
• Lebih sensitif (10-100 kali lebih peka)
• Dapat digunakan pereaksi warna penampak
noda yang korosif

4
What you see is what you get

One Plate gives us all information

6
 TLC:
versatile Method

Forensic

Enviromental Food Industri

Kimia

Pharmaceutical Herbal
application Cosmetics

7
Keterbatasan KLT

Kromatografi Lapis Tipis

• Lebih sederhana, relatif murah
TLC • preparasi sampel sederhana
• Kelemahan:
Terbatas untuk senyawa non-volatil,
Daya pisah relatif rendah

8
Pemisahan
pada
Kromatografi
Lapis Tipis
1938: Ismailov & Shraiber
 Pemisahan ekstrak tanaman pada alumina yang ditebarkan pada
kaca obyek mikroskop (tebal lapisan 2 mm)
 Metanol diteteskan dari atas  Circular TLC (drop
chromatography)

1949: Meinhard & Hall  Surface Chromatography

 Menggunakan tepung sebagai pengikat lapis tipis
 Untuk pemisahan ion

1951: Kirchner et al.  Metode elusi “ascending”

1954: Reitsema  menggunakan lempeng lebih lebar

10
Perkembangan Kromatografi Lapis Tipis

• 1941: Martin & Synge  Kromatografi partisi

• 1952: James & Martin  Kromatografi gas

1956: Egon Stahl

• Memperkenalkan istilah Thin Layer
Chromatography
• Sebagai prosedur analisis, banyak digunakan
silika gel dengan pengikat CaSO4
Egon Stahl
1965an: Precoated TLC Plates
• Lahir Spectrodensitometric scanner 
analisis kuantitatif “in situ”

1973: HPTLC
(High Performance Thin Layer Chromatography)
11
Prosedur Analisis Pelat KLT

1. Preparasi sampel (Ekstraksi sampel)

2. Penotolan larutan sampel
3. Pengembangan/elusi dengan fase gerak
4. Visualisasi  di bawah lampu UV atau
Sinar tampak (visibel) setelah disemprot
dengan penampak noda.
5. Pengukuran dengan spektrodensitometer
dan Interpretasi hasil.
 Pipa kapiler
 Lempeng tipis (sebagai fase diam)
 Pelarut organik/Campuran pelarut
organik (sebagai fase gerak/sistem
pengembang)
 Bejana KLT (TLC Chamber)
 Lampu UV
 Spektrofoto-
densitometer
13
Solvent front
(drawn lightly in pencil)

origin
 Bejana KLT diisi fase
gerak
 Dibiarkan sampai
jenuh El
 Lempeng KLT us
dimasukkan ke dalam i
bejana KLT
 Elusi sampai batas
yang ditentukan

15
16
Kromatografi Lapis Tipis

Penotolan Elusi
Pengamatan di bawah sinar ultra violet
Rf of component A =
dA solvent front
dS
component B

Rf of component B =
dS
dB dB

dS
component A

dA
origin
The Rf value is a decimal
fraction, generally only
reported to two decimal
places
 Rf  X
Y
- - - - - - - - - - - -1- - - - - - - - - - - - - - - - - - -

- - - - - - - - - - - - - 2- - - - - - - - - - - - - -
Y
X1 3
X2
hRf  Rf x100 X3
- - - -4- - - - - - - - - - - - - - - - - - -

migrationdistanceof zoneof interest

Rst  migration distance of standard
Jika Rf zat x = Rf zat pembading 
zat x mungkin sama dengan zat
pembanding

A B unknown

The Rf value is a decimal fraction, generally

only reported to two decimal places
22
23
24
 Size
Exclusion
Normal
Phase

IEC

Reversed Ion
Phase Exchange
 Silica gel
 Silica gel-F (Fluorescing indicator
added)
 Magnesium Silicate (Florisil)
 Polyamides
 Starch
 Alumina
 Silica
• silica gel (unmodified), silica gel bonded phase
 Non Silica
• Cellulosa, Aluminium oxide, Kieselguhr, Polyamide

 Anorganik
 Aluminium oxide, Kieselguhr (Diatomaceous Earth),
Magnesium silicate, silica gel
 Organik
 Cellulosa, Dextran gels, Cellulosa ion-exchange
powder, Ion-exchange resins, Polyamide.

27
 Classical silica plates (unmodified silica)
 For routine analysis
 High Performance Silica Plates (HPTLC)
 For fast and quantitative analysis of complex samples
 Ultra Thin Monolithic Silica Plate (UTLC)
 For ultra fast and very sensitif analysis of samples in
the nanoliter range
 Preparative Layer Plates (PLC)
 For enrichment and purification of analytes in mg
quantities
• Tersedia:
• Fase normal (Normal phase)
• Jika fase diam bersifat polar (contoh silika gel) dan
fase gerak pelarut organik/campuran pelarut yang
kurang polar dibandingkan fase diam
• Fase Terbalik (Reversed phase)
• Jika fase diam adalah silika gel termodifikasi (RP 18)
dan fase gerak adalah campuran air dengan pelarut
organik yang lebih polar daripada fase diam
Fase Diam KLT dan mekanisme
Pemisahan

a) Silica gel, alumina, kieselguhr  Adsorption

b) Cellulosa, silica gel (modified) Partition

c) Celulosa (ion exchanger), Resin ion exchanger ion

exchange

d) Sephadex type gels, biogels (Exclusion/Pemeation)

Fase Diam pada KLT

1. Silika gel

silikon dioksida, tiap atom silikon

dikelilingi empat atom oksigen,
bentuk tetrahedron. Pada
permukaan silika gel, pasangan
bulk (SiO2)x surface
elektron bebas dari atom oksigen
berikatan dengan hydrogen
 -
 Silica gel, also called silicic acid and + O OH
+
kieselgel Si Si
-
 The most common adsorbent used in O O
-
TLC
 A polymer based on Silica to oxygen
linkages with many -hydroxyl groups
extending from this matrix.
 More polar compounds will be more
attracted to silica gel than non-polar
compounds
 OH
OH
OH
OH
OH Si
Si O
Si O
Si O O
Si O O
O O
O O
O Si Si
O O
Si
Si O O O
Si O O
O
O O
O
Si
Si O
O
O O
O
Fase Diam Silika gel
• Silika gel G  Silika gel dengan perekat gypsum sebanyak 5-15%
• untuk analit yang berfluoresen atau analit yang berwarna setelah
diberi panampak noda

• Silika gel N atau H  Silika gel tanpa perekat

• lebih stabil dibandingkan silika gel dg perekat

• Silika gel F254  Silika dengan perekat dan indikator pendarfluor

• Untuk analit yang tidak berfluoresensi  noda analit di bawah
radiasi UV berwarna (karena menutup fluoresensi fase diam)
• Silika gel 60
• Ukuran pori-pori 60 Angstrom
• Silika gel untuk preparatif
 O OH OH OH OH

Al Al Al Al Al
O O O O O O

Acidic: -Al-OH
Neutral: -Al-OH + -Al-O-
Basic: -Al-O-
 F254 atau UV 254 menunjukkan bahwa lempeng KLT mengandung
indikator pendarfluor anorganik
 Berwarna hijau terang, kuning atau biru di bawah lampu UV 254
nm.
 Indikator yang sering digunakan:
• Uranyl acetate (yellow-green)
• Managanese zinc silicate; Zinc cadmium sulphide; Zinc silicate
(green);
• alkaline earth metal tungstates, tin strontium phosphate (blue)
 F366 atau UV 366 menunjukkan bahwa lempeng KLT mengandung
indikator pendarfluor organik
 Contoh: hydroxypyrene sulfonates; fluorescein; zat warna
rhodamine

36
FASE DIAM PADA KLT
2. Alumina

Alumina / Al2O3 adalah penjerap/fase diam anorganik yang

aktif kuat dg pH=9, alumina netral pH=7, alumina asam=4

digunaan untuk senyawa yang kurang polar, pemisahan

gula-gula atau asam amino yang bersifat hidrofilik kuat

3. Kieselgur

adalah fosil dari diatomea sejenis ganggang laut yaitu

asam silikat dan dipakai sebagai penjerap alami pada KLT.
FASE DIAM PADA KLT
4. Selulosa

Sama dengan pd kromatografi kertas, beda pada serat

selulosa pada KLT lebih pendek

Selulosa yang dipakai:

• Native fibrous cellulose dikenal sbg MN 300

• Microcrystalline cellulose dikenal sbg avicel

Selulosa dapat dipakai sebagai RPTLC

Selulosa dapat dipakai Cellulose ion exchanger dg cara esterifikasi

gugus hidroksil dengan gugus asam atau basa. Contoh
diethylaminoethyl-cellulose (DEAE-cellulose), carboxylmethyl-
cellulose (CM-cellulose)
FASE DIAM PADA KLT
4. Sepadex

merupakan cross-linked polymeric dextran gel. Sepadex gel

terdapat dalam 4 ukuran partikel :

coarse 100-300m

medium 50-150m

fine 20-80m

superfine 10-40m

digunakan utk size exclution chromatography.

40
 Manual
• Standard glass capillary of set volume
• 1-2 µL  ± 3-4 mm spot size
• Microsyringe (a flat-ended, preferably PTFE-coated needle)
 Semi automated: Nanomat, Linomat
 Automatic: Automatic TLC Sampler (ATS)
 Pelarut sampel yang digunakan dapat mempengaruhi
lebar ukuran noda
 Sebaiknya digunakan pelarut kurang polar tetapi dapat
melarutkan analit dengan baik
 Hindari penggunaan pelarut: air, dapar atau diol.
 Pelarut yang memiliki titik didih tinggi seperti 1-
butanol, toluene dan DMF sebaiknya dihindari karena
sulit menguap dari permukaan lempeng
 Volume penotolan:
• 1-5 µL (TLC) atau
• 50-250 nL (HPTLC)
• HPTLC: 50-200 ng per spot; 1-4 µg per 10mm band
• TLC: 0.1-2 µg per spot; 2-10 µg per 10mm band
 Bentuk: pita (band) atau noda (spot)
42
43
 Volume penotolan:
• 1-5 µL (TLC) atau
• 50-250 nL (HPTLC)
• HPTLC: 50-200 ng per spot; 1-4 µg per 10mm band
• TLC: 0.1-2 µg per spot; 2-10 µg per 10mm band

 Bentuk:
• pita (band) atau
• noda (spot)

44
45
Development techniques

 Isocratic, singledevelopment
 Gradient  wide polarity range
 Circular/anti circular
 Orthogonal (2D) complex matrix
 Multiple Development  complex matrix
 Forced Flow  increase separation
power
 Automatic  better reproducibility
Elusi :

 Pemilihan fase gerak tergantung:

• Sifat analit
 Polar
 Non polar
• Mekanisme pemisahan
 Adsorpsi
 Partisi
 Migrasi
analit tergantung dari pelarut
pengembang yang digunakan
• Pelarut disusun berdasarkan kekuatan elusi 
eluotropic series
48
 Teknik Non-destruktif
• Deteksi visibel (untuk senyawa berwarna)
• Deteksi UV
• Reaksi Reversibel (uap iodin, uap ammonia)
• Reaksi non reversibel (Fluorescein, Rhodhamin)
 Teknik Destruktif
• Asam sulfat (10-20% dalam metanol/air) 
dipanaskan 5-20 menit, 100-180oC

49
 Post-chromatographic visualisation
 Menyemprot/mencelupkan lempeng
setelah elusi dengan/dalam pereaksi

50
 Pereaksi untuk senyawa golongan basa
 Peraksi van Urk  sulfonamida
 besi III klorida  fenol
 raksa I nitrat  barbiturat
 Kalium permanganat asam  ikatan rangkap alifatik
 Pereaksi furfural, senyawa netral

 Pereaksi untuk senyawa golongan basa

 ninihidrin, amina
 FPN, fenotiazin warna merah kecoklatan, dibenzazepin warna biru
 Dragendorff alkaloida
 Iodoplatina asam, amina
 Pereaksi Marquis, alkaloida fenolik
52
(1) pengukuran langsung
– visual
– Spektrofotodensitometer

(2) noda dikerok  analit dilarutkan

dgn solven  ukur dgn
spektrofotometer
Ha
la
m
 Pengukuran kadar zona kromatogram
KLT tanpa merusak noda
 Instrumen saat ini terhubung dengan PC
yang dilengkapi software dengan
reprodusibilitas dan akurasi yang tinggi
(1% SD)

54
 Prinsip: Pengukuran cahaya radiasi elektromagnetik
pada panjang gelombang tertentu (umumnya
UV/Visibel 190-800 nm)  Oleh karena itu disebut
Spektrodensitometer atau spektrofotodensitometer.

 Scanning dilakukan secara cepat hingga 100 mm/detik

 Scanning dapat diprogram sedemikian rupa bahkan
pada berbagai panjang gelombang (multiple
wavelength)
 Scanning menghasilkan kromatogram yang serupa
dengan kromatogram HPLC.

55
 Spektra UV-Vis dapat direkam dengan
kecepatan tinggi, disimpan dan
dibandingkan dengan spektra library
untuk identifikasi analit.
 Dapat dilakukan uji kemurnian zona KLT
pada awal, puncak dan bagian akhir
puncak. Jika spektra identik  puncak
bersifat murni

56
[mv]

[nm]
 Mampu melakukan pengukuran:
 Reflectance  paling banyak digunakan
 Fluorescence quenching
 Fluorescene

Untuk zat-zat yang berfluoresensi atau

berfluoresensi setelah direaksikan
dengan pereaksi  sensitivitas 10-100
kali lebih besar
58
 Digunakan 3 jenis lampu
 Deuterieum (D2)  190-800 nm
 Halogen-Tungsten  350-800 nm
 Mercury  254 -578 nm)  Fluoresensi

 Mode Scanning
 Single beam, single wavelength
 Double beam using a beam splitter dual
wavelength
 Double beam combined into single beam

59
 Spektrofotometer
 Spektrofoto-
• Sampel: larutan densitometer
• Berlaku hukum Beer- • Sampel: lapisan padat

Lambert • Berlaku Hukum

Kubelka-Munk
• Absorbans
berbanding lurus
dengan konsentrasi
pada rentang
tertentu

60
 Diperlukan zat pembanding autentik
 Atas dasar waktu retensi atau harga Rf
 Waktu retensi atau Rf bersifat karakteristik,
bukan spesifik
 Waktu retensi sampel = waktu retensi zat standar
 bukan berarti sampel 100% identik dengan
pembanding
 Jika tR atau Rf tidak sama  Sampel 100% tidak
identik.
 Untuk konfirmasi 
 lakukan teknik “spiking”,
 penggunaan fase gerak yang berbeda;
 Overlay spectra sampel dan baku pembanding
 Berdasarkan perbandingan peak area
atau peak height analit dengan baku
pembanding pada lempeng KLT yang
sama

Mode Kalibrasi:
- Single calibration
- Multi level calibration
 Regresi Linier  jika rentang sempit
 Regresi non linier  jika rentang kalibrasi
relatif lebar
 Regresi
Polinomial  Jika rentang
konsentrasi sangat lebar
 Regresi
Michaelis-Menten: Jika rentang
konsentrasi sangat lebar dan jumlah sampel
yang banyak

64
Peak area

Y = bx + a

Konsentrasi
66