Asam Pterodontik Terisolasi dari Laggera pterodonta dalam

Menghambat Infeksi Virus Dengue Serotype 2

Abstrak
Demam berdarah adalah penyakit arbovirus paling penting di dunia dalam hal yang tertinggi
morbiditas dan mortalitas. Sayangnya, sejauh ini belum ada obat khusus. Dalam penelitian ini,
kami menyelidiki aktivitas anti-DENV-2 asam Pterodontik, diisolasi dari Laggera pterodonta.
Asam pterodontik ditemukan memiliki aktivitas yang kuat secara in vitro terhadap DENV-2
dengan sitotoksisitas rendah. Temuan ini menunjukkan bahwa asam Pterodontik memiliki
potensi untuk dikembangkan menjadi obat anti virus untuk pencegahan dan pengobatan DENV-2
infeksi virus.

Pendahuluan
Virus dengue (DENV) ditularkan di antara manusia dan terutama nyamuk Aedes aegypti [1].
Virus dengue (DENV) endemik di wilayah tropis dan sub-tropis di dunia Bhatt et al. [2].
Diperkirakan 390 juta orang terinfeksi setiap tahun, dari 96 juta kasus bersifat simptomatik tetapi
kurang dari 1% kasus fatal [2,3,5]. Sebagian besar infeksi yang tampak secara klinis
menghasilkan membatasi penyakit demam yang disebut 'demam berdarah'. Namun, minoritas
pasien berkembang dari demam berdarah dengue biasa menjadi syok dengue sindrom,
manifestasi yang lebih serius yang ditandai oleh vaskular kebocoran dan kegagalan sirkulasi [6].
Ada empat serotipe DENV (DENV1-DENV4), yang berbeda pada tingkat asam amino oleh 30-
35% [6]. Infeksi dengan satu serotipe menghasilkan antibodi itu dapat bereaksi silang dan
meningkatkan infeksi dengan serotipe lain dalam a infeksi sekunder [7]. Tidak ada pengobatan
khusus untuk demam berdarah demam, dan pengendalian vektor sebagian besar tidak efektif
untuk mencegah penyebaran geografis yang cepat dari penyakit ini [8-10]. Karena itu diperlukan
untuk mengembangkan obat antivirus yang inovatif.

Pengobatan Tiongkok Tradisional (TCM) banyak digunakan di Tiongkok untuk mengobati

penyakit virus. TCM dianggap aman, efektif dan multi-bertarget [11]. Banyak tanaman obat
menunjukkan antivirus aktivitas melalui mekanisme yang berbeda dan ini dapat mengarah pada
pengembangan obat antivirus baru [11]. Laggera pterodonta (DC.) Benth. (Compositae) adalah
ramuan abadi yang didistribusikan secara luas di Cina barat daya, terutama di provinsi Yunnan
[12]. Tertentu senyawa antivirus telah diisolasi dari L. pterodonta, termasuk flavonoid, yang
memiliki anti-inflamasi dan anti-apoptosis efeknya, selain tiga asam dicaffeoylquinic yang
ditampilkan aktivitas antivirus melawan virus herpes simplex ‐ 1, herpes simplex virus ‐ 2 dan
influenza A in vitro [11]. Fraksi seskuiterpen dari L. pterodonta memiliki efek virus anti-
influenza. Asam pterodontik adalah salah satu seskuiterpenoid utama dari L. pterodonta, yang
menunjukkan kegiatan anti-virus selektif untuk subtipe H1 influenza manusia A virus [12],
efeknya pada DENV-2 belum pernah dilaporkan sebelumnya. Di dalam studi, aktivitas antivirus
asam pterodontik dievaluasi menggunakan Uji reduksi efek sitopatik (CPE) dan RT-PCR.

Bahan dan metode

Bahan Tanaman dan Persiapan Asam Pterodontik
Seluruh ramuan Laggera pterodonta, herbal tradisional obat dengan nama Cina Chou Ling Dan,
dikumpulkan dari provinsi Yunnan di Cina. Spesimen herbarium adalah disahkan oleh Profesor
Rongping Zhang dan disimpan di Sekolah Tinggi Ilmu Farmasi, Universitas Kedokteran
Kunming. Bahan tanaman bubuk (1 kg) diekstraksi dengan metanol menggunakan proses
perkolasi, diikuti dengan mengumpulkan elusi 40 L dan vakum-berkonsentrasi untuk
menghasilkan ekstrak metanol 135 g. Itu ekstrak dihentikan dalam H2 O (800 mL) dan
mengalami cairan– partisi cair dengan menambahkan petroleum eter. Residu (48 g) dari lapisan
petroleum eter dikenai silika gel CC (petroleum ether – EtOAc, 10: 1) untuk mendapatkan fraksi
A (38 g). Fraksi A (8 g) adalah dikenakan silika gel CC dengan elusi oleh gradien minyak bumi
ether – EtOAc (1: 0; 20: 1; 10: 1; 5: 1; 2: 1) untuk menghasilkan pecahan 1–12 berdasarkan pada
analisis TLC. Fr.1 (3,8 g) adalah elusi minyak bumi dan elusi utama Fraksi A. Fr.1 selanjutnya
dikenai silika gel CC (petroleum ether – CHCl3, dari 100: 0 hingga 95: 5) untuk mendapatkan
lima fraksi (I – V) untuk analisis TLC, Fr.III selanjutnya dimurnikan dengan gel CC untuk
membeli senyawa (34,7 mg) dengan kemurnian lebih tinggi dari 95%, yang diidentifikasi sebagai
asam pterodontik (Gambar 1).
Sel dan Virus
Sel C6 / 36 ditanam di RPMI-1640 dan MEM (1: 2) dengan 10% Fetal Bovine Serum (FBS)
(Zhejiang Tianhang Biotechnology) Co, Ltd), dan penisilin / streptomisin (P / S), pada 28 ℃ ± 2
℃.

Uji Penghambatan Efek Sitopatik (CPE)

Sel C6 / 36 (200 μl / well) diunggulkan dalam 96-well plate dan tumbuh sampai sel monolayers
terbentuk. Supernatan itu kembali dipindahkan dan 3μl DENV-2 diinokulasi ke sel monolayer
pada 37 ︒C selama 2 jam. Sel yang terinfeksi dikultur di hadapan pterodon- asam tic (5 μg / ml)
dalam media pemeliharaan. Setiap obat diuji di sumur rangkap tiga. Setelah 72 jam inkubasi
pada 37 ◦C dalam 5% CO2 di- mosphere, efek sitopatik (CPE) diamati dengan mikroskop.

Reverse Transcription-Quantitative Polymerase Chain Uji Reaksi (RT-qPCR)

Sel C6 / 36 (200 μl / well) diunggulkan dalam 96-well plate dan tumbuh sampai sel monolayers
terbentuk. Supernatan itu dihapus dan 3μl DENV-2 diinokulasi ke sel monolayer pada 37˚C
selama 2 jam. Sel yang terinfeksi dikultur di hadapan asam pterodontik (5μg / ml) dalam medium
perawatan. Setiap obat itu diuji dalam rangkap tiga sumur. Setelah 72 jam inkubasi pada 37 ◦ C
dalam 5% CO2 atmosfer, untuk ekstraksi RNA dari kultur sel, RNA adalah diperoleh dari 140
μL supernatan. RNA virus diekstraksi menggunakan QIAamp® Viral RNA Mini Kit (Qiagen).
Total RNA (7μl) terbalik ditranskripsi menjadi cDNA menggunakan RevertAid First Strand Kit
Sintesis cDNA (Fermentas). qPCR dilakukan dengan kondisi thermocycling berikut: 95˚C
selama 3 menit, diikuti oleh 39 siklus 95˚C selama 10 detik, 55˚C selama 20 detik dan 72˚C
selama 30 detik. Itu Primer RT-qPCR: Forward primer, GCAGGGATACTGAAGAGATGGG;
Membalikkan primer, TGGTTCTCCGTTACGTGTGG. Ukuran RT- Produk PCR adalah 186
bp.

Analisis statistik
Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan SPSS untuk Windows (versi 15.0). Dalam
semua kasus, probabilitas p <0,05 dalam dua sisi Tes dianggap signifikan secara statistik.

Sitotoksisitas Asam Pterodontik

Asam pterodontik diperiksa untuk kemampuan sitotoksiknya di kultur sel C6 / 36 konfluen.
Tidak ada efek sitotoksik yang signifikan diamati pada 5 ug / ml (Tabel 1). Efek sitopatogenik
(CPE) ‘-’: CPE 0%;
‘+ ： CPE 25%;
‘++’ ： CPE50%;
‘+++’ ： CPE75%;
‘++++’ ： CPE 100%
Tabel 1: Sitotoksisitas asam Pterodontik dalam sel C6 / 36 yang terkonsentrasi budaya tanpa
DENV-2.
Sel C6 / 36 diunggulkan dalam 96-well plate, 3μl dari DENV-2 diinokulasi ke sel C6 / 36,
Perubahan patologis sel C6 / 36 setelah infeksi DENV-2 diamati dengan mikroskop (Gambar 2).
Perubahan sel C6 / 36 setelah infeksi DENV-2, C6 / 36 normal sel; 2. Sel C6 / 36 setelah infeksi
DENV-2.

Hasil
Perubahan Patologis Sel C6 / 36 setelah DENV-2 Infeksi
Tabel 2: Aktivitas antivirus asam Pterodontic (CPE).

Penghambatan mRNA DENV-2

Efek asam Pterodontik pada mRNA DENV-2 ditentukan. Laju penghambatan amplifikasi
DENV-2 = （1-2- △ Ct） × 100%. Laju penghambatan amplifikasi DENV-2 dalam Pterodontik
sel yang diolah asam setelah 72 jam adalah 44,26%. Hasil penelitian mengungkapkan bahwa
DENV-2 mRNA berkurang secara signifikan dalam perawatan asam Pterodontik sel setelah 72
jam (Tabel 3).

Aktivitas Antiviral Asam Pterodontik

Untuk mengevaluasi aktivitas antivirus asam Pterodontik, sel C6 / 36 terinfeksi virus DENV-2
dan asam Pterodontic ditambahkan pada 5μg / ml. Setelah pengobatan selama 72 jam, efek
antivirus dari Ptero asam dontic dievaluasi. Efek sitopatogenik (CPE) dari Pterodon- Asam tic
adalah ++ (50%), CPE oseltamivir adalah ++ ~ +++ (50% ~ 75%). Asam pterodontik
menunjukkan efek antivirus pada DENV-2 (Tabel 2).

Tabel 3: Tingkat penghambatan amplifikasi DENV-2.

DENV-2 dan DENV-4 tampaknya lebih jarang dikaitkan dengan penyakit parah selama infeksi
primer daripada DENV-1 dan DENV-3. Faktor host dapat berkontribusi signifikan terhadap
penyakit demam berdarah kerasnya. Ada peningkatan kejadian DBD / DSS dengan
bertambahnya usia. Sebagai interval antara primer dan sekunder infeksi meningkat, tampaknya
ada peningkatan keparahan infeksi sekunder Murphy et al. [16]

Pembahasan
Masing-masing dari empat serotipe DENV (DENV-1, DENV-2, DENV-3, dan DENV-4) mampu
menyebabkan spektrum penuh dari manajemen klinis jika infeksi berikut, termasuk infeksi tanpa
gejala, demam berdarah (DF), dan penyakit yang paling parah, demam berdarah ic fever / dengue
shock syndrome (DHF / DSS). Tidak ada perawatan khusus ada untuk demam berdarah, dan
pengendalian vektor sebagian besar tidak efektif untuk mencegah penyebaran geografis yang
cepat dari penyakit ini. karan et al. [13] Meskipun ada vaksin yang tersedia secara komersial,
kemanjurannya buruk dan tidak ada terapi alternatif Lim et Al. [14]. Dalam penelitian ini, asam
Pterodontik diisolasi dari Lag gera pterodonta dievaluasi, tidak ada efek sitotoksik yang
signifikan diamati pada 5 ug / ml. Asam pterodontik menunjukkan efek antivirus pada DENV-2.
MRNA DENV-2 berkurang secara signifikan dalam Pterodon- sel yang diolah asam tic setelah
72 jam. Ada empat serotipe DENV, kekebalan terhadap satu serotipe tidak selalu melindungi
terhadap fection dengan serotipe lain. Infeksi sekuensial sering terjadi pada Negara-negara
endemik DENV, tempat keempat serotipe sering beredar pada saat yang sama atau mengganti
satu sama lain secara siklus. Merugikan hasil klinis lebih sering terjadi selama sekunder atau
berulang infeksi Culshaw et al. [6].

Laggera pterodonta didistribusikan secara luas di Barat Daya Cina, khususnya di Provinsi
Yunnan Gu et al. [17,18]. Banyak sekali konstituen kimia seperti turunan eudesmane, sesquit-
glukosida erpenoid, flavon, steroid, kumarin, triterpen asam fenolat telah diisolasi terutama dari
etanol ekstrak L.pterodonta Shi et al. [19] Pekerjaan sebelumnya mengungkapkan itu
sesquiterpen adalah komponen utama dari tanaman Gu et al. [17] L.pterodonta secara tradisional
digunakan sebagai etnomedisia karena anti-inflamasi, aktivitas antibakteri dan anti-leukemia
aktivitas Xiao et al. [18-20], minyak atsiri mengurangi batuk, berkurang dahak Gu dkk. [6], ini
efektif dan aman untuk anak-anak dengan akut bronchiolitis Shang et al. [21], telah digunakan
selama beberapa abad untuk memperbaiki hepatitis di Cina Wu et al. [22]

Ekstrak petroleum eter L.pterodonta menunjukkan signifikan efek penghambatan pada

transformasi limfosit. Liu et al. [24]. Chrysosplenetin dan penduletin, dua flavonol yang
dimetilasi diisolasi dari daun L.pterodonta, ditemukan kuat aktivitas in vitro terhadap enterovirus
71 (EV71) dengan sitotoksisitas rendah Zhu et al. [2]. C8 adalah komponen aktif yang diisolasi
dari Laggera pterodonta. Dua senyawa seskuiterpen jenis eudesmane diidentifikasi dalam C8:
asam pterodontik dan pterodondiol. C8 adalah terbukti memiliki efek spektrum luas terhadap
yang berbeda virus influenza, termasuk virus influenza manusia dan unggas. C8 menghambat
reseptor Toll-like 7, primer diferensiasi myeloid protein respons 88 dan reseptor faktor nekrosis
tumor (TNF) terkait faktor 6 ekspresi, selain fosforilasi p65. C8 dapat menghambat translokasi
nuklir p65 / NF-κB. Selain itu, C8 mencegah peningkatan ekspresi mRNA sitokin, termasuk
interleukin (IL) -1β, IL-6, IL-8 dan motif C-C chemokine 2 (MCP-1). Selanjutnya, ekspresi
protein dari IL-6, IL-8, TNF-α, C-X-C motif chemokine 10, MCP-1 dan C-C motif chemokine 5
itu menghambat Wang et al. [20]

Fr 14 diisolasi dari L.pterodonta, ia memiliki spektrum yang luas aktivitas virus anti-influenza.
Fr14 menghambat p38 / MAPK dan kemudian menghambat NF-κB dan COX-2 Wang et al. [23].
3, 5-Dihydroxy-6, 7,3′4′-tetramethoxyflavone (DHTMF) adalah iso- polimetoksiflavon terbaru
dari L.pterodonta. DHTMF menunjukkan antiprolifer- yang baik aktivitas-aktivitas asli melawan
sejumlah garis sel kanker Cao et al. [24]. Efek anti-inflamasi dari total flavonoid L.pterodonta
(TFLP) dievaluasi dengan berbagai model in vivo baik akut dan peradangan kronis. Mekanisme
anti-inflamasi TFLP mungkin terkait dengan penghambatan prostaglandin pembentukan,
pengaruh pada sistem antioksidan dan Sion rilis LZM, Wu et al. [22]. Efek hepatoprotektif dari
fenolik total dari L.pterodonta (TPLP) terhadap CCI4-, D-GalN-, Cedera yang diinduksi TAA-,
dan t-BHP diperiksa dalam biakan primer hepatosit tikus neonatal. TPLP menghambat
kebocoran seluler dua enzim, ASAT dan ALAT hepatosit, yang disebabkan oleh bahan kimia ini
dan peningkatan viabilitas sel. Menetralkan spesies oksigen reaktif oleh mekanisme
nonenzimatik mungkin menjadi salah satu mekanisme utama TPLP terhadap cedera hepatosit
akibat bahan kimia, Wu et al. [22].
Fraksi aktif diisolasi dari L. pterodonta
Sebagian besar seskuiterpenoid L. pterodonta memiliki eudesmane kerangka dan memiliki
berbagai kegiatan farmakologis. Misalnya, pterodontriol A, asam pterodontik, dan asam ilicat
memiliki efek penghambatan pada sel tumor. Asam pterodontik memiliki efek inflamasi seperti
yang diamati dengan mengurangi telinga yang diinduksi xylene edema pada tikus. Aktivitas
antivirus in vitro yang paling banyak adalah asam pterodontik mungkin terkait dengan
menghambat replikasi influenza Virus dengan memblokir ekspor nuklir kompleks RNP dan virus
menipiskan respon inflamasi dengan menghambat aktivasi jalur NF-κB. Asam pterodontik
mungkin merupakan antivirus potensial agen melawan virus influenza A. Ini menyiratkan bahwa
aktivitas anti-virus asam pterodontik dikaitkan dengan mengurangi pelepasan baik sitokin pro-
inflamasi dan kemokin. Karena itu, asam pterodontik mungkin merupakan senyawa timbal
potensial untuk anti- baru Pengembangan obat DENV-2 Guan et al. [11] Penelitian ini
menunjukkan hal itu asam pterodontik, salah satu seskuiterpenoid utama dari L. pterodonta,
memiliki aktivitas in vitro yang kuat dari virus anti-DENV-2. Hasil memberikan petunjuk untuk
mengembangkan obat antivirus baru, studi lebih lanjut adalah diperlukan untuk memverifikasi
mekanisme.

Pengakuan
Karya ini didukung oleh Ilmu Pengetahuan Alam Nasional Yayasan Tiongkok (No. U1502226,
81460593), Kunci Nasional Program R&D Teknologi (2014BAIO1B01).

Ketersediaan Data dan Bahan

Kumpulan data yang digunakan dan / atau dianalisis selama penelitian ini tersedia dari penulis
terkait berdasarkan permintaan yang masuk akal.