BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan selama 6 bulan yaitu pada bulan Januari 2019

sampai Juni 2019. Pengerjaan sampel dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi

Fakultas Kedokteran Universitas Udayana, Jalan P.B. Sudirman, Denpasar

sehingga diperoleh data tentang daya hambat perasan buah mengkudu terhadap

pertumbuhan bakteri Salmonella typhi.

3.2 Bahan dan Alat Penelitian

3.2.1 Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari buah

mengkudu, bakteri S. typhi, media Salmonella Shigella Agar, media Mueller

Hinton Agar, Standar Mc Farland 0,5%, aquades steril, NaCl fisiologis 0,85%,

aluminium foil, chloramphenicol, cakram disk kosong, lidi kapas steril.

3.2.2 Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu pisau, lampu

spritus/bunsen, botol vial, pipet ukur merek Pyrex 10 ml, mikropipet merek Iso

Lab volume 1000 µl, blue tips, ose bulat, tabung reaksi merek Pyrex volume 10

ml, rak tabung reaksi, pinset steril, inkubator merek LW Scientific, jangka sorong,

autoclave, kertas saring, parutan, gelas ukur, termometer air, plate steril,

stopwach.

18
 19

3.3 Rancangan Penelitian

Dalam penelitian “Daya hambat perasan buah mengkudu (Morinda

citrifolia L.) terhadap pertumbuhan bakteri Salmonella typhi”, jenis penelitian

yang digunakan yaitu true–experiment. Jenis rancangan yang digunakan peneliti

yaitu posttest dengan kelompok kontrol (Posttest Only Control Grup Design).

Bentuk rancangan penelitian ini adalah :

K+ O1
P
RA
K- O2
RS

S P1 O3

P2 O4

P3 O5

P4 O6

P5 O7

Gambar 3.1 Rancangan Penelitian

Keterangan :
P : Populasi
S : Sampel
RS : Random Sampling
RA : Random Alokasi
K+ : Kontrol positif (cakram disk yang mengandung antibiotik chloramphenicol).
K- : Kontrol negatif (cakram disk yang mengandung aquadest).
P1 : Perlakuan 1 (cakram disk yang mengandung perasan buah mengkudu
20%).
P2 : Perlakuan 2 (cakram disk yang mengandung perasan buah mengkudu
40%).
 20

P3 : Perlakuan 3 (cakram disk yang mengandung perasan buah mengkudu

60%).
P4 : Perlakuan 4 (cakram disk yang mengandung perasan buah mengkudu
80%).
P5 : Perlakuan 5 (cakram disk yang mengandung perasan buah mengkudu
100%).
O1 : Zona hambat pertumbuhan bakteri S. typhi pada K+
O2 : Zona hambat pertumbuhan bakteri S. typhi pada K-
O3 : Zona hambat pertumbuhan bakteri S. typhi pada P1
O4 : Zona hambat pertumbuhan bakteri S. typhi pada P2
O5 : Zona hambat pertumbuhan bakteri S. typhi pada P3
O6 : Zona hambat pertumbuhan bakteri S. typhi pada P4
O7 : Zona hambat pertumbuhan bakteri S. typhi pada P5

3.4 Populasi, Sampel, dan Jumlah Sampel

3.4.1 Populasi

Populasi dalam penelitian ini adalah biakan murni bakteri S. typhi pada

media Salmonella Shigella Agar.

3.4.2 Sampel

Sampel dalam penelitian ini adalah hasil biakan murni bakteri S. typhi

pada media Salmonella Shigella Agar yang diukur zona hambatnya pada media

Mueller Hinton Agar.

3.4.3 Jumlah Unit Penelitian

Jumlah unit penelitian dalam penelitian ini sebanyak tujuh unit yaitu

bakteri S. typhi yang akan diberikan perlakuan meliputi konsentrasi perasan buah

mengkudu 20%, 40%, 60%, 80%, 100% ditambah dengan satu kontrol positif dan

satu kontrol negatif. Konsentrasi tersebut dipilih berdasarkan penelitian yang

menunjukkan bahwa konsentrasi efektif dalam menghambat pertumbuhan bakteri

Flavobacterium dan Enterobacter yakni 30% dan 35% (Maliana dkk., 2013).

Oleh sebab itu, untuk mengetahui daya hambat perasan buah mengkudu terhadap

pertumbuhan bakteri S. typhi, peneliti menggunakan konsentrasi yang lebih

 21

rendah dari 30% sampai dengan konsentrasi diatas 35%, sehingga konsentrasi

yang digunakan adalah 20%, 40%, 60%, 80%, dan 100%.

Penggunaan chloramphenicol sebagai kontrol positif disebabkan karena

chloramphenicol merupakan senyawa antimikroba berspektrum luas yang dapat

digunakan untuk bakteri gram negatif. Chloramphenicol bekerja dengan

menghambat sintesis protein bakteri, yang dihambat adalah enzim peptidil

transferase yang berperan sebagai katalisator untuk membentuk ikatan-ikatan

peptida pada proses sintesis protein pada bakteri (Brooks, 2005).

Untuk mendapatkan hasil penelitian yang valid maka perlu dilakukan

pengulangan guna mendapat jumlah unit penelitian yang valid. Jumlah

pengulangan ditentukan dengan rumus Federer (1963) sebagai berikut :

(t-1)(r-1) ≥ 15

Keterangan :
r = banyaknya pengulangan
t = jumlah perlakuan

Karena jumlah perlakuan adalah tujuh, maka jumlah pengulangan sebagai

berikut :

(7-1)(r-1) ≥ 15

6(r-1) ≥ 15

6r ≥ 15 + 6

r ≥ 3,5

Berdasarkan rumus diatas, diperoleh nilai r = 3,5 maka banyak

pengulangan yang harus dilakukan adalah sebanyak empat kali. Maka jumlah unit

penelitian yang digunakan adalah empat dikali tujuh sebanyak 28.

 22

3.5 Variabel Penelitian

1. Variabel bebas (independent variables)

Dalam penelitian ini variabel bebas adalah perasan buah mengkudu

dengan konsentrasi 20%, 40%, 60%, 80%, dan 100%.

2. Variabel terikat (dependent variables)

Variabel terikat dalam penelitian ini adalah diameter zona hambat

pertumbuhan bakteri S. typhi pada media Mueller Hinton Agar.

3. Variabel penganggu (confounding)

Pada penelitian ini yang menjadi variabel peganggu yaitu kontaminasi

mikroba lain, ketebalan media, kekeruhan suspensi bakteri, suhu inkubasi, waktu

inkubasi.

3.6 Definisi Operasional Variabel

a. Perasan buah mengkudu adalah cairan yang berwarna cokelat keruh dari buah

mengkudu matang yang diperoleh dengan cara memeras secara manual

menggunakan tangan.

b. Bakteri S. typhi adalah bakteri gram negatif yang koloninya tak berwarna

dengan bagian tengah berwarna hitam pada media selektif Salmonella

Shigella Agar yang dicampurkan kedalam larutan NaCl fisiologis.

c. Pertumbuhan bakteri adalah pertambahan jumlah sel bakteri yang terlihat dari

pertambahan jumlah koloni yang semakin banyak atau ukuran koloni yang

semakin besar pada media Mueller Hinton Agar setelah diinkubasi pada suhu

37° C selama 24 jam.

 23

d. Daya hambat perasan buah mengkudu adalah kemampuan zat yang terdapat

pada perasan buah buah mengkudu untuk menghambat pertumbuhan bakteri

S. typhi dan dinyatakan dengan diameter zona hambat (mm).

e. Diameter zona hambat adalah daerah bening disekitar cakram disk yang

terdapat dalam media Mueller Hinton Agar yang menunjukkan luas

pertumbuhan bakteri S. typhi yang dihambat oleh perasan buah mengkudu.

Daerah bening yang terbentuk diukur menggunakan jangka sorong dan

hasilnya dinyatakan dalam satuan milimeter.

3.7 Prosedur Penelitian

3.7.1 Tahap persiapan

a. Pengambilan buah mengkudu

Buah mengkudu yang digunakan untuk bahan penelitian diambil di

Kelurahan Ubung Kaja, Kota Denpasar. Buah mengkudu tersebut kemudian

dibersihkan untuk diproses menjadi perasan buah mengkudu.

b. Pembuatan perasan buah mengkudu

1. Buah mengkudu matang yang berwarna putih kehijauan, agak lembek dan

berbau khas yang sudah dipetik dari pohon dicuci bersih dengan air mengalir.

2. Alkohol 96% disemprotkan ke seluruh permukaan kulit buah mengkudu.

3. Buah mengkudu dibilas menggunakan akuades steril dan ditiriskan.

4. Buah mengkudu dipotong menjadi dua bagian, kemudian tiap potongan buah

mengkudu diparut kemudian diperas secara manual menggunakan tangan

yang sudah memakai sarung tangan.

 24

5. Perasan buah mengkudu ditampung dalam gelas beker dan dipindahkan ke

dalam erlenmeyer sambil disaring menggunakan kain saring sebanyak satu

kali dan kertas saring sebanyak dua kali. Kain saring dan kertas saring

sebelumnya telah disterilkan menggunakan autoklaf.

6. Hasil saringan ditampung dalam gelas ukur dan ditutup rapat dan dinyatakan

sebagai perasan buah mengkudu dengan konsentrasi 100%.

c. Pengenceran perasan buah mengkudu

1. Pengenceran perasan buah mengkudu dilakukan untuk mendapatkan

konsentrasi 80%, 60%, 40%, dan 20% dengan rumus pengenceran sebagai

berikut :

V1 x C1 = V2 x C2

Keterangan rumus :
V1 : volume perasan buah mengkudu yang akan diencerkan dari konsentrasi 100%.
V2 : volume perasan buah mengkudu yang akan dibuat, yaitu 1000 µl.
C1 : konsentrasi perasan buah mengkudu yang akan diencerkan, yaitu 100%.
C2 : konsentrasi perasan buah mengkudu yang akan dibuat.

Jumlah perasan buah mengkudu konsentrasi 100% yang diperlukan untuk

masing-masing konsentrasi adalah sebagai berikut :

Tabel 3.1 Pengenceran perasan buah mengkudu

Konsentrasi Perasan buah Aquadest steril
mengkudu (100%)
80% 800 µl 200 µl
60% 600 µl 400 µl
40% 400 µl 600 µl
20% 200 µl 800 µl
(Sugianti, 2012)

d. Pembuatan media uji sensitivitas (Mueller Hinton Agar)

1. Bubuk media Mueller Hinton Agar ditimbang sebanyak 20,4 g menggunakan

neraca analitik.
 25

2. Setelah ditimbang, dilarutkan dengan 600 ml aquadest.

3. Media dipanaskan sambil diaduk sampai larut sempurna.

4. Setelah larut sempurna, diukur pH media dengan menggunakan pH stik (pH

optimal 7,3 ± 0,1 pada suhu 25 ºC).

5. Erlenmeyer ditutup dengan kapas lemak dan aluminium foil.

6. Media disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121ºC selama 15 menit.

7. Media yang telah disterilisasi, didiamkan sampai suhu media mencapai 40-

50ºC.

8. Larutan media dituang ke dalam cawan petri ± 15 ml. Kemudian didiamkan

hingga memadat.

9. Setelah media memadat, cawan petri dibalik.

10. Jika media tidak segera digunakan, media dalam tabung erlenmeyer disimpan

di tempat yang aman dan tidak lembab.

e. Pembuatan suspensi bakteri S. typhi

1. Satu sampai tiga ose koloni S. typhi dari biakan murni diambil dan

disuspensikan ke dalam tabung yang berisi 5 ml larutan NaCl fisiologis

0,85%.

2. Suspensi ini dibandingkan dengan kekeruhan standar Mc Farland 0,5%.

3. Cara untuk membandingkan adalah dengan memegang kedua tabung saling

berhimpitan.
 26

3.7.2 Tahap Pemeriksaan

1. Cakram disk kosong disiapkan dan cakram disk ini direndam ke dalam air

perasan buah mengkudu selama 1 jam pada setiap konsentrasi hingga seluruh

cairan meresap ke dalam cakram disk.

2. Untuk kontrol negatif digunakan cakram disk yang direndam ke dalam 1000

µl aquades steril.

3. Untuk kontrol positif digunakan cakram disk antibiotik chloramphenicol.

4. Suspensi S. typhi dengan kepekatan 0,5% Mc Farland disiapkan.

5. Swab kapas steril disiapkan dan dicelupkan kedalam suspensi bakteri. Setelah

suspensi bakteri meresap, swab kapas steril diangkat dan diperas dengan cara

menekankan pada dinding tabung bagian dalam sambil diputar-putar.

6. Swab kapas yang telah dicelupkan tadi digores-goreskan pada permukaan

media Mueller Hinton Agar sampai seluruh permukaan tertutup rapat dengan

goresan-goresan. Goresan dilakukan dengan merata.

7. Media Mueller Hinton Agar didiamkan selama 5 sampai 15 menit agar

suspensi bakteri meresap ke dalam media.

8. Masing-masing cakram disk yang telah jenuh dengan perasan buah

mengkudu serta kontrol positif dan kontrol negatif kemudian ditempelkan

pada permukaan media Mueller Hinton Agar yang sudah digoreskan suspensi

bakteri dan sedikit ditekan dengan pinset sampai melekat sempurna.

9. Jarak antar cakram satu dengan cakram lain minimal 15 mm dan cakram

yang telah ditempelkan pada permukaan media tidak boleh dipindahkan atau

digeser.
 27

10. Media yang telah ditanami cakram disk diinkubasi pada suhu 37° C selama

24 jam dengan posisi terbalik.

3.8 Alur penelitian

Bakteri S. typhi

Media MHA Cakram disk yang diisi

Aquadest Perasan Perasan Perasan Perasan Perasan

(kontrol buah buah buah buah buah
Chlorampenicol
negatif) mengkudu mengkudu mengkudu mengkudu mengkudu
(kontrol positif)
20% 100%
40% 60% 80%

Daya Hambat

Analisis Data

Simpulan

Gambar 3.2 Alur penelitian

3.9 Analisis Data

Data dari hasil penelitian berupa diameter zona hambat yang dinyatakan

dalam satuan millimeter, selanjutnya diolah dengan menggunakan uji statistik

menggunakan bantuan perangkat lunak (software) SPSS 16.0 for windows dengan

langkah sebagai berikut :

a. Analisis statistik
 28

1. Analisis normalitas untuk mengetahui kenormalan data pada masing-masing

kelompok perlakuan dengan menggunakan uji Saphiro Wilk pada taraf

kepercayaan 95% atau  = 0,05.

2. Analisis homogenitas untuk mengetahui homogenitas variasi data dengan

menggunakan uji Levene Test pada taraf kepercayaan 95% atau  = 0,05.

3. Analisis komparasi dengan menggunakan uji One Way Anova yang apabila

data berdistribusi normal dan varian homogen dan apabila signifikan

dilanjutkan dengan uji beda dengan uji Least Significant Difference (LSD)

pada taraf kepercayaan 95% atau  = 0,05. Sedangkan jika data berdistribusi

tidak normal dan varian tidak homogen maka dilakukan uji non parametrik

dengan uji Kruskal Walls (KW) dan apabila signifikan dilanjutkan dengan uji

Mann Whitney dengan taraf kepercayaan 95% atau  = 0,05.

4. Analisis korelasi untuk mengetahui korelasi data dengan menggunakan uji

Product Moment pada taraf kepercayaan 95% atau  = 0,05.

b. Analisis komparasi

Kategori zona hambat hasil penelitian dibandingkan dengan kategori zona

hambat bakteri menurut Davis Stout (1971) berikut :

Tabel 3.2 Tabel kategori zona hambat

No Diameter Zona Hambat (mm) Kategori
1 <5 Lemah
2 5 – 10 Sedang
3 11 – 20 Kuat
4 >20 Sangat Kuat
(Davis dan Stout, 1971)