PENGARUH WAKTU HIDROLISIS PROTEIN GELATIN OLEH ENZIM

PROTEASE TERHADAP VOLUME NaOH DAN mg NITROGEN ASAM AMINO

MELALUI TITRASI FORMAL ASAM AMINO

Oleh,
Ni Luh Putu Agustina Putri
1713081015
Program Studi Kimia, Jurusan Kimia, Fakultas MIPA,
Universitas Pendidikan Ganesha
Email : agustinaputrik22@gmail.com

ABSTRAK
Pada praktikum ini dilakukan titrasi formal asam amino dengan tujuan untuk menghidrolisis
protein dengan enzim protease dan untuk membuat kurva hubungan antara volume NaOH terhadap
waktu dan kurva mg nitrogen asam amino terhadap waktu pada titrasi formal asam amino. Metode
yang digunakan adalah metode eksperimen laboratorium dimana dilakukan titrasi dengan interval
waktu 0, 15, 30, 45, 60, 75, dan 90 dengan NaOH 0,02 M terhadap larutan campuran gelatin dan
tripsin. Hasil yang diperoleh dalam praktikum ini adalah larutan protein (gelatin) dapat dihidrolisis
dengan tripsin (enzim protease). Kurva hubungan antara volume NaOH terhadap waktu dan kurva
mg nitrogen asam amino terhadap waktu pada titrasi formal asam amino berbanding lurus dimana
semakin lama larutan didiamkan, maka semakin banyak volume NaOH yang diperlukan untuk
mentitrasi larutan asam amino tersebut maka semakin banyak pula mg nitrogen dari asam amino
yang dihasilkan. Peningkatan jumlah mg asam amino terjadi seiring dengan bertambahnya waktu
kontak antara larutan gelatin dengan larutan tripsin.
Kata kunci: asam amino, formaldehida, titrasi formal
ABSTRACT
In this practicum, a formal titration of amino acids is carried out in order to hydrolyze
proteins with the enzyme protease and to make a curve of the relationship between the volume of
NaOH against time and the mg curve of amino acid nitrogen to time on the formal titration of amino
acids. The method used is a laboratory experimental method in which titrations with time intervals
are 0, 15, 30, 45, 60, 75, and 90 with 0.02 M NaOH on a mixture of gelatin and trypsin. The results
obtained in this practicum are protein solution (gelatin) can be hydrolyzed with trypsin (protease
enzyme). The curve of the relationship between the volume of NaOH against time and the curve of the
amino acid mg of nitrogen to the time on the formal titration of the amino acid is directly proportional
where the longer the solution is left, the more volume of NaOH needed to titrate the amino acid
solution, the more mg of nitrogen from the amino acid resulting from. An increase in the number of mg
of amino acids occurs with increasing contact time between the gelatin solution and trypsin solution.
Keywords: amino acids, formaldehyde, formal titration

PENDAHULUAN
Suatu molekul protein disusun Suatu protein mengalami
oleh sejumlah asam amino tertentu dengan hidrolisis sehingga protein dapat dipecah
susunan yang sudah tertentu pula dan menjadi asam-asam amino sehingga
bersifat turunan. Protein merupakan penyusun asam aminonya akan terurai.
senyawa organik kompleks berbobot Hidrolisis protein dapat dilakukan dengan
molekul tinggi yang merupakan polimer dari menggunakan enzim protease daritripsin.
monomer-monomer asam amino yang Asam amino bebas yang dihasilkan dari
dihubungkan satu sama lain dengan ikatan hidrolisis ini apabila direaksikan
peptida. Molekul protein mengandung denganformaldehid berlebih akan
karbon, hidrogen, oksigen, nitrogen dan membentuk derivat metilol. Penentuan
kadang kala sulfur serta fosfor. secara kuantitatif salah satu gugus dari asam
amino akan dapat memberikan indikasi
untuk mengetahui derajat hidrolisis protein.
Jika suatu asam amino dalam larutan
dititrasi dengan basa, maka ion hidrogen
dari ammonium yang dititrasi menurut teori
zwitter ion. Protein dihidrolisis akan
didapatkan asam aminonya. Hidrolisis suatu
protein dapat dilakukan dengan
menggunakan enzim protease dan tripsin.
Tripsin adalah suatu enzim proteolitik atau
enzim yang mengkatalisis hidrolisis protein.
H3N+CHRCOO-(aq) ⇌ H2NCHRCOO-(aq) + H+(aq)
H2NCHRCOO-(aq) + 2HCHO(aq) ⇌
Pada reaksi diatas, terdapat ion
H+ yang dilepaskan pada reaksi ini dapat
dititrasi langsung dengan NaOH sampai
dengan pH 8,0. Titrasi asam amino atau
campuran asam amino dalam keberadaan
formaldehid disebut dengan titrasi formal
asam amino. Titrasi ini merupakan metode
analisis untuk mengikuti pembentukan asam
amino bebas yang dihasilkan pada proses
hidrolisis protein oleh enzim
proteotik.Selama hidrolisis suatu protein,
sejumlah gugus karboksil dan gugus amino
bertambah terus. Penentuan secara
kuantitatif salah satu gugus akan dapat
memberikan indikasi untuk mengetahui
derajat hidrolisis protein. Menurut teori
zwitterion, apabila suatu asam amino dalam
larutan dititrasi dengan basa, berarti ion
hidrogen dari ammonium yang dititrasi.
Gugus ammonium dari asam amino yang
bersifat buffer pada daerah pH tinggi atau di
atas pH 11, sehingga tidak mungkin dititrasi
sampai titik akhir. Hal yang sama juga
terjadi pada gugus karboksil yang bersifat
buffer pada pH rendah sehingga tidak
mungkin juga dititrasi dengan basa.
Penambahan formalin ke dalam larutan
asam amino akan membentuk dimetilol.
Dengan terbentuknya dimetilol berarti gugus
amino dari protein sudah terikat dan tidak
akan mempengaruhi titik akhir titrasi
Tripsin mengkatalisis hidrolisis ikatan amida
di bagian karboksil dari lisin atau arginin.
Protein jika dihidrolisis akan menghasilkan
asam amino bebas. Asam amino bebas ini
ini bila direaksikan dengan formaldehida
berlebih akan membetuk derivat metilol.
Reaksi ini menyebabkan asam amino bebas
bentuk isoelektrik kehilangan satu proton
dari gugus NH3+.
(HOCH2)2NCHRCOO-(aq)
sehingga titik akhir titrasi dapat ditentukan
dengan tepat. Indikator yang digunakan
adalah fenolftalein (Tika, 2010).
Protein dihidrolisis akan
didapatkan asam amino. Hidrolisis suatu
protein dapat dilakukan dengan
menggunakan enzim protease dan tripsin.
Tripsin adalah suatu enzim proteolitik atau
enzim yang mengkatalisis hidrolisis protein.
Tripsin mengkatalisis hidrolisis ikatan amida
di bagian karboksil dari lisin atau arginin
(Fessenden, 2010). Protein jika dihidrolisis
akan menghasilkan asam amino bebas.
Asam amino bebas ini ini bila direaksikan
dengan formaldehida berlebih akan
membetuk derivat metilol. Reaksi ini
menyebabkan asam amino bebas bentuk
isoelektrik kehilangan satu proton dari
gugus NH3+. Titrasi formal asam amino
dilakukan dengan tujuan untuk
menghidrolisis protein menggunakan enzim
protease, dan dibuat kurva hubungan antara
volume NaOH terhadap waktu dan kurva
mg nitrogen asam amino terhadap waktu
pada titrasi formal asam amino.
METODE
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam
praktikum ini terdiri dari 3 buah gelas kimia
100 mL, 3 buah Erlenmeyer 100 mL, 1 set
buret dan statif, 1 buah spatula, 1 buah
batang pengaduk, 1 buah labu ukur 100 mL,
1 buah pipet ukur 25 mL, 1 buah kaca arloji,
1 buah termometer, 1 buah pemanas listrik,
2 buah pipet tetes,dan 1 buah labu ukur 25
mL. Bahan-bahan yang digunakan adalah
100 mL larutan gelatin 5%, 100 mL larutan
NaOH 0,2 M, 50 mL larutan NaOH 0,02 M,
50 mL larutanHCl 0,1 M, indikator PP 1%
secukupnya, 75 mL larutan formaldehida
40%, 25 mL larutan tripsin 1%, dan aquades
secukupnya.
Prosedur Kerja
• Penyiapan Larutan Gelatin
Larutan gelatin sebanyak 100 mL
ditambahkan 1 mL larutan fenolftalein dan
NaOH 0,2 M tetes demi tetes hingga timbul
warna merah muda. Larutan gelatin yang
berwarna merah muda ditambahkan tetes
demi tetes larutan HCl 0,1 M sampai warna
merahnya hilang. Larutan tersebut kemudian
direndam dalam inkubator air pada suhu 38
°C selama 5 menit.
• Penyiapan Larutan Tripsin
Larutan tripsin sebanyak 100 mL
ditambahkan dengan beberapa tetes
indikator fenolftlein dan tetes demi tetes
larutan NaOH 0,2 M sampai timbul warna
merah muda. Larutan tripsin yang berwarna
merah muda ditambahkan tetes demi tetes
larutan HCl 0,1 M ke dalam larutan tersebut
sampai warna merahnya hilang. Larutan
tersebut kemudian diinkubasi dalam
inkubator pada suhu 38°C selama 5 menit.
• Titrasi Formal Asam Amino
Larutan gelatin sebanyak 100
mLdisiapkan dengan melarutkan sebanyak
5,0011 gram padatan gelatin dan
ditambahkan aquades yang telah dipanaskan
sampai volume 100 mL. Setelah itu,
ditambahkan 1 mL larutan indikator PP ke
dalam larutan gelatin kemudian
ditambahkan dengan larutan NaOH 0,2 M
tetes demi tetes hingga timbul warna merah
muda. Kemudian ditambahkan tetes demi
tetes larutan HCl 0,1 M sampai warna merah
muda hilang. Selanjutnya larutan tersebut
direndam dalam inkubator air pada suhu
38°C. Pada tabung lain, 25 mL larutan
Tripsin ditambahkan dengan beberapa tetes
indikator PP dan tetes demi tetes larutan
NaOH 0,2 M sampai timbul warna merah
muda. Setelah itu, ditambahkan tetes demi
tetes larutan HCl 0,1 M ke dalam larutan
tersebut sampai warna merahnya hilang.
Kemudian larutan ini diinkubasi dalam
inkubator air pada suhu 38°C selama
beberapa menit. Selanjutnya, ditambahkan
larutan tripsin ke dalam larutan gelatin dan
diaduk perlahan. Setelah tercampur merata,
diambil 10 mL campuran dan dimasukkan
ke dalam Erlenmeyer 100 mL (larutan ini
digunakan sebagai kontrol atau waktu nol).
Dilakukan pendidihan untuk merusak enzim
kemudian didinginkan. Kemudian
ditambahkan 15 mL formalin netral dan 3
tetes fenolftalein kemudian titrasi dilakukan
menggunakan NaOH 0,02 M dengan
interval waktu 15, 30, 4, 60, 75, dan 90
menit dari waktu nol dilakukan yang sama
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada eksperimen ini dilakukan
titrasi formal asam amino yaitu titrasi asam
amino atau campuran asam amino dalam
keberadaan formaldehida. Langkah pertama
pada praktikum ini dengan menyiapkan
larutan gelatin sebanyak 100 mL dengan
menimbang sebanyak 5,0011 gram, lalu
dilarutkan kedalam aquades yang telah
dipanaskan dan diaduk hingga menjadi
homogen. Larutan gelatin ditambahkan
larutan PP, larutan gelatin yang sudah
ditambahkan indikator fenolftlein,
kemudian ditambahkan dengan larutan
NaOH tetes demi tetes. Penambahan NaOH
ini mengakibatkan larutan gelatin berubah
warna menjadi merah muda. Larutan gelatin
yang berwarna merah muda kemudian
ditambahkan dengan HCl tetes demi tetes
yang menyebabkan larutan kembali
berwarna kuning bening. Penambahan HCl
bertujuan untuk membuat larutan tersebut
mencapai pH 8, karena sebelumnya
dilakukan penambahan NaOH yang
membuat larutan bersifat basa. Penambahan
HCl hingga pH 8 dilakukan, karena pada
pH ini merupakan pH optimum bagi enzim
tripsin untuk bekerja optimal. Selanjutnya
larutan gelatin ini diinkubasi pada suhu 38
°C. Pengkondisian ini bertujuan agar enzim
protease dapat bekerja secara optimal.
Pada langkah selanjutnya, larutan
tripsin ditambahkan dengan indikator
fenolftalein. Tujuan ditambahkannya
indikator fenolftalein adalah untuk
mengetahui perubahan pH yang terjadi pada
sistem larutan. Setelah ditambahkan
indikator fenolftalein larutan tidak berubah
warna. Larutan tripsin yang sudah
ditambahkan indikator fenolftlein,
kemudian ditambahkan dengan larutan
(a) (b)
Gambar 1. (a) Larutan gelatin, (b) Larutan Tripsin, (c) Campuran larutn tripsin dan
gelatin, (d) Campuran larutn tripsin dan gelatin yang dipanaskan.
Pada proses selanjutnya, setelah
larutan tripsin dan larutan gelatin siap
maka larutan tripsin dan larutan gelatin
dicampur dan diaduk perlahan.
Pencampuran kedua larutan ini
menghasilkan warna putih kekuningan.
Penambahan larutan tripsin akan mampu
menghidrolisis protein khususnya gelatin.
Digunakan larutan tripsin dalam hidrolisis
protein ini karena pada tripsin terdapat
enzim protease yang mampu
menghidrolisis protein dengan memotong
ikatan peptida pada sisi C dari gelatin
NaOH tetes demi tetes. Penambahan NaOH
ini mengakibatkan larutan tripsin berubah
warna menjadi merah muda. Larutan tripsin
yang berwarna merah muda kemudian
ditambahkan dengan HCl tetes demi tetes
yangmenyebabkan larutan kembali
berwarnaputih keruh Penambahan HCl
bertujuan untuk membuat larutan tersebut
mencapai pH 8, karena sebelumnya
dilakukan penambahan NaOH yang
membuat larutan bersifat basa. Penambahan
HCl hingga pH 8 dilakukan, karena pada
pH ini merupakan pH optimum bagi enzim
tripsin untuk bekerja optimal. Selanjutnya
larutan tripsin ini diinkubasi pada suhu
380C. Pengkondisian ini bertujuan agar
enzim protease dapat bekerja secara optimal.
(c) (d)
yang menghasilkan asam amino bebas
sehingga dapat dititrasi.
Larutan gelatin dan tripsin yang
telah homogen, lalu diambil sebanyak 10
mL dan dimasukkan kedalam Erlenmeyer
kemudian dipanaskan hingga mendidih.
Tujuan dilakukan pemanasan adalah untuk
merusak enzim sehingga reaksi akan
terhenti. Larutan ini kemudian
didinginkan dan ditambahkan 15 mL
formalin netral dan 3 tetes fenolftalein.
Larutan ini digunakan sebagai standar
karena diambil pada menit ke-nol.
Pengambilan campuran ini diulangi
sebanyak 4 kali, dengan interval waktu
tertentu, yaitu pada menit ke-15, menit ke-
30, menit ke 45, menit ke-60, menit ke-75,
dan menit ke-90. Masing -masing
campuran tersebut diperlakukan sama
seperti kontrol, yaitu dipanaskan hingga
mendidih. Tujuan penambahan formalin
adalah agar formalin bereaksi dengan
gugus amino yang tidak bermuatan
sehingga memungkinkan gugus amonium
mem-buffer di daerah pH yang lebih
rendah dan dapat dititrasi pada titik akhir
secara kuantitatif menggunakan suatu
indikator. Hal ini dilakukan karena jika
tidak ditambahkan dengan formaldehid,
gugus amonium dari asam amino akan
bersifat buffer pada daerah pH tinggi,
diatas pH 11, sehingga tidak mungkin
dititrasi sampai titik akhir. Hal yang sama
Gambar 2.Reaksi Keseluruhan Titrasi Formal Asam Amino
Selama melakukan titrasi formal
asam amino volume NaOH yang
juga terjadi pada gugus karboksil yang
bersifat buffer pada pH rendah sehinga
tidak mungkin dititrasi dengan basa.
Reaksi yang terjadi pada titrasi
dengan menggunakan formalin merupakan
reaksi pembentukan dimetilol. Dengan
terbentuknya dimetilol ini, berarti gugus
aminonya sudah terikat dan tidak akan
mempengaruhi reaksi yang terjadi antara
gugus asam (karboksil) dengan basa
(NaOH) sehingga titik akhir titrasi dapat
diakhiri dengan tepat. Indikator yang
digunakan adalah fenolftalein. Bila titik
akhir titrasi diperoleh tepat, maka akan
terjadi perubahan warna larutan dari
bening menjadi merah muda. Reaksi yang
terjadi secara keseluruahan pada titrasi
formal asam amino adalah sebagai berikut
diperlukanpada menit ke- 0, 15, 30, 45,
60, 75 dan 90 adalah sebagai berikut:
 Tabel 1. Data Volume NaOH yang digunakanpadaTitrasi Formal Asam Amino

Menit ke- Volume NaOH

0 8.5
15 9
30 9.4
45 10
60 10.7
75 11.5
90 12.6

Berdasarkan data diatas, maka dapat NaOH yang diperlukan terhadap waktu
dibuat kurva hubungan antara volume yaitu sebagai berikut.

f(x) = 0.04x + 8.25 12.6

Volume NaOH (mL)

R² = 0.97 11.5
8.5 10.7
10
9 9.4

Waktu (menit)

Gambar 3. Kurva Hubungan antara Volume NaOHyang Diperlukan Terhadap Waktu

Berdasarkan kurva diatas dibutuhkan untuk mengikat gugus

menunjukkan bahwa semakin asam-asam amino bebas tersebut
lama larutan didiamkan, maka semakin banyak pula.
semakin lama waktu suatu larutan Berdasarkan hasil titrasi tersebut,
protein diinkubasi (dihidrolisis) dapat dibuat kurva mg nitrogen asam
maka semakin banyak pula amino terhadap waktu yang diperlukan
volume NaOH yang diperlukan larutan gelatin untuk bereaksi. Dalam
dalam mentitrasi larutan protein penentuan massa nitrogen asam amino,
tersebut. Hal ini disebabkan diasumsikan bahwa larutan NaOH 0,1 N
karena semakin lama larutan sebanyak 1 mL sebanding dengan 1,4 mg
protein diinkubasi, maka asam nitrogen asam amino, sehingga
amino bebas yang terbentuk dari konsentrasi NaOH 0,02 M yang sama
larutan gelatin semakin banyak, dengan 0,02 N sebanding dengan 0,28 mg
sehingga volume NaOH yang nitrogen asam amino, dengan
perhitungannya sebagai berikut.
0,02 N x mg
=
0,1 N 1,4 mg
0,1 x =0,028
 x=0,28 mg

Jadi, 1 mL NaOH 0,02 N ekivalen Berikut ini perhitungan massa nitrogen

terhadap 0,28 mg nitrogen asam amino. asam amino pada setiap interval waktu
 Pada menit ke-0 VNaOH = 10 mL ; 10 x 0,28 = 2,8 mg
VNaOH = 8,5 mL ; 8,5 x 0,28 = 2,38 mg  Pada menit ke-60
 Pada menit ke-15 VNaOH = 10,7 mL ; 10,7 x 0,28 = 2,99 mg
VNaOH = 9 mL ; 9 x 0,28 = 2,52 mg  Pada menit ke-75
 Pada menit ke-30 VNaOH = 11,5 mL ; 11,5 x 0,28 = 3,22 mg
VNaOH = 9,4 mL ; 9,4 x 0,28 = 2,63 mg  Pada menit ke-90
 Pada menit ke-45 VNaOH = 12,6 mL ; 12,6 x 0,28 = 3,53 mg

Tabel 2. DatamgNitrogen yang Dihasilkan Oleh Asam Aminopada Menit ke-0,

15,30, 45, 60, 75 dan 90
Menit ke- mg Nitrogen
0 Asam Amino
2.38
15 2.52
30 2.63
45 2.8
60 2.99
75 3.22
90 3.53
Berdasarkan data diatas, dapat yang dihasilkan oleh asam amino terhadap
dibuat kurva hubungan antara mg nitrogen waktu yaitu sebagai berikut
mg Nitrogen Asam Amino

f(x)
f(x) == 0.01x
0.01x++2.31
2.31 3.53
2.38
R² = 0.97 3.22
R² = 0.97 2.99
2.63 2.8
2.52

Waktu (menit)

Gambar 4. Kurva Hubungan antara mg Nitrogen Terhadap Waktu

Berdasarkan kurva diatas tripsin yang semakin lama menghidrolisis

menunjukkan peningkatan jumlah mg gelatin menyebabkan gugus karboksil dan
nitrogen asam amino seiring dengan gugus amino yang dihasilkan semakin
bertambahnya waktu kontak antara larutan banyak, sehingga nitrogen yang terdapat
gelatin dengan larutan tripsin.Enzim pada dimetilol juga ikut bertambah.

SIMPULAN
 Berdasarkan hasil pengamatan
dan pembahasan, dapat ditarik simpulan
yaitu,
a. Protein (gelatin) dapat dihidrolisis
dengan enzim protease dari tripsin dan
melalui titrasi formal asam amino
diketahui derajat hidrolisis asam amino
b. Dari data hasil titrasi formal asam
amino dapat dibuat kurva hubungan antara
volume NaOHterhadap waktu dan kurva
hubungan mg nitrogen asam amino
terhadap waktu pada titrasi formal asam
UCAPAN TERIMA KASIH
amino dapat dijelaskan bahwa semakin
Ucapan terima kasih penulis
lama larutan didiamkan, maka semakin
sampaikan kepada Dr. I Nyoman Tika,
banyak volume NaOH yang diperlukan
M.Si., sebagai dosen pengampu mata
untuk mentitrasi larutan asam amino
kuliah Praktikum Biokimia atas
tersebut maka semakin banyak pula mg
bimbingan dan masukan selama
nitrogen dari asam amino yang dihasilkan.
praktikum ini, I Dewa Subamia selaku
laboran di Program Studi Kimia atas
bantuan dalam memberikan segala
keperluan yang berkaitan dengan
praktikum sehingga percobaan ini dapat
dilaksanakan dengan baik.
REFERENSI
Fessenden, F dan Fessenden. 1994. Kima
Organik Jilid 2. Jakarta : Erlangga
Tika, I Nyoman. 2010. Buku Penuntun