Anda di halaman 1dari 11

PENGARUH WAKTU HIDROLISIS PROTEIN GELATIN OLEH ENZIM

PROTEASE TERHADAP VOLUME NaOH DAN mg NITROGEN ASAM AMINO


MELALUI TITRASI FORMAL ASAM AMINO

Oleh,
Ni Luh Putu Agustina Putri
1713081015
Program Studi Kimia, Jurusan Kimia, Fakultas MIPA,
Universitas Pendidikan Ganesha
Email : agustinaputrik22@gmail.com

ABSTRAK
Pada praktikum ini dilakukan titrasi formal asam amino dengan tujuan untuk menghidrolisis
protein dengan enzim protease dan untuk membuat kurva hubungan antara volume NaOH terhadap
waktu dan kurva mg nitrogen asam amino terhadap waktu pada titrasi formal asam amino. Metode
yang digunakan adalah metode eksperimen laboratorium dimana dilakukan titrasi dengan interval
waktu 0, 15, 30, 45, 60, 75, dan 90 dengan NaOH 0,02 M terhadap larutan campuran gelatin dan
tripsin. Hasil yang diperoleh dalam praktikum ini adalah larutan protein (gelatin) dapat dihidrolisis
dengan tripsin (enzim protease). Kurva hubungan antara volume NaOH terhadap waktu dan kurva
mg nitrogen asam amino terhadap waktu pada titrasi formal asam amino berbanding lurus dimana
semakin lama larutan didiamkan, maka semakin banyak volume NaOH yang diperlukan untuk
mentitrasi larutan asam amino tersebut maka semakin banyak pula mg nitrogen dari asam amino
yang dihasilkan. Peningkatan jumlah mg asam amino terjadi seiring dengan bertambahnya waktu
kontak antara larutan gelatin dengan larutan tripsin.
Kata kunci: asam amino, formaldehida, titrasi formal
ABSTRACT
In this practicum, a formal titration of amino acids is carried out in order to hydrolyze
proteins with the enzyme protease and to make a curve of the relationship between the volume of
NaOH against time and the mg curve of amino acid nitrogen to time on the formal titration of amino
acids. The method used is a laboratory experimental method in which titrations with time intervals
are 0, 15, 30, 45, 60, 75, and 90 with 0.02 M NaOH on a mixture of gelatin and trypsin. The results
obtained in this practicum are protein solution (gelatin) can be hydrolyzed with trypsin (protease
enzyme). The curve of the relationship between the volume of NaOH against time and the curve of the
amino acid mg of nitrogen to the time on the formal titration of the amino acid is directly proportional
where the longer the solution is left, the more volume of NaOH needed to titrate the amino acid
solution, the more mg of nitrogen from the amino acid resulting from. An increase in the number of mg
of amino acids occurs with increasing contact time between the gelatin solution and trypsin solution.
Keywords: amino acids, formaldehyde, formal titration

PENDAHULUAN
Suatu molekul protein disusun Suatu protein mengalami
oleh sejumlah asam amino tertentu dengan hidrolisis sehingga protein dapat dipecah
susunan yang sudah tertentu pula dan menjadi asam-asam amino sehingga
bersifat turunan. Protein merupakan penyusun asam aminonya akan terurai.
senyawa organik kompleks berbobot Hidrolisis protein dapat dilakukan dengan
molekul tinggi yang merupakan polimer dari menggunakan enzim protease daritripsin.
monomer-monomer asam amino yang Asam amino bebas yang dihasilkan dari
dihubungkan satu sama lain dengan ikatan hidrolisis ini apabila direaksikan
peptida. Molekul protein mengandung denganformaldehid berlebih akan
karbon, hidrogen, oksigen, nitrogen dan membentuk derivat metilol. Penentuan
kadang kala sulfur serta fosfor. secara kuantitatif salah satu gugus dari asam
amino akan dapat memberikan indikasi
untuk mengetahui derajat hidrolisis protein. Tripsin mengkatalisis hidrolisis ikatan amida
Jika suatu asam amino dalam larutan di bagian karboksil dari lisin atau arginin.
dititrasi dengan basa, maka ion hidrogen Protein jika dihidrolisis akan menghasilkan
dari ammonium yang dititrasi menurut teori asam amino bebas. Asam amino bebas ini
zwitter ion. Protein dihidrolisis akan ini bila direaksikan dengan formaldehida
didapatkan asam aminonya. Hidrolisis suatu berlebih akan membetuk derivat metilol.
protein dapat dilakukan dengan Reaksi ini menyebabkan asam amino bebas
menggunakan enzim protease dan tripsin. bentuk isoelektrik kehilangan satu proton
Tripsin adalah suatu enzim proteolitik atau dari gugus NH3+.
enzim yang mengkatalisis hidrolisis protein.

H3N+CHRCOO-(aq) ⇌ H2NCHRCOO-(aq) + H+(aq)


H2NCHRCOO-(aq) + 2HCHO(aq) ⇌ (HOCH2)2NCHRCOO-(aq)

Pada reaksi diatas, terdapat ion sehingga titik akhir titrasi dapat ditentukan
H+ yang dilepaskan pada reaksi ini dapat dengan tepat. Indikator yang digunakan
dititrasi langsung dengan NaOH sampai adalah fenolftalein (Tika, 2010).
dengan pH 8,0. Titrasi asam amino atau Protein dihidrolisis akan
campuran asam amino dalam keberadaan didapatkan asam amino. Hidrolisis suatu
formaldehid disebut dengan titrasi formal protein dapat dilakukan dengan
asam amino. Titrasi ini merupakan metode menggunakan enzim protease dan tripsin.
analisis untuk mengikuti pembentukan asam Tripsin adalah suatu enzim proteolitik atau
amino bebas yang dihasilkan pada proses enzim yang mengkatalisis hidrolisis protein.
hidrolisis protein oleh enzim Tripsin mengkatalisis hidrolisis ikatan amida
proteotik.Selama hidrolisis suatu protein, di bagian karboksil dari lisin atau arginin
sejumlah gugus karboksil dan gugus amino (Fessenden, 2010). Protein jika dihidrolisis
bertambah terus. Penentuan secara akan menghasilkan asam amino bebas.
kuantitatif salah satu gugus akan dapat Asam amino bebas ini ini bila direaksikan
memberikan indikasi untuk mengetahui dengan formaldehida berlebih akan
derajat hidrolisis protein. Menurut teori membetuk derivat metilol. Reaksi ini
zwitterion, apabila suatu asam amino dalam menyebabkan asam amino bebas bentuk
larutan dititrasi dengan basa, berarti ion isoelektrik kehilangan satu proton dari
hidrogen dari ammonium yang dititrasi. gugus NH3+. Titrasi formal asam amino
Gugus ammonium dari asam amino yang dilakukan dengan tujuan untuk
bersifat buffer pada daerah pH tinggi atau di menghidrolisis protein menggunakan enzim
atas pH 11, sehingga tidak mungkin dititrasi protease, dan dibuat kurva hubungan antara
sampai titik akhir. Hal yang sama juga volume NaOH terhadap waktu dan kurva
terjadi pada gugus karboksil yang bersifat mg nitrogen asam amino terhadap waktu
buffer pada pH rendah sehingga tidak pada titrasi formal asam amino.
mungkin juga dititrasi dengan basa. METODE
Penambahan formalin ke dalam larutan Alat dan Bahan
asam amino akan membentuk dimetilol. Alat-alat yang digunakan dalam
Dengan terbentuknya dimetilol berarti gugus praktikum ini terdiri dari 3 buah gelas kimia
amino dari protein sudah terikat dan tidak 100 mL, 3 buah Erlenmeyer 100 mL, 1 set
akan mempengaruhi titik akhir titrasi buret dan statif, 1 buah spatula, 1 buah
batang pengaduk, 1 buah labu ukur 100 mL, direndam dalam inkubator air pada suhu
1 buah pipet ukur 25 mL, 1 buah kaca arloji, 38°C. Pada tabung lain, 25 mL larutan
1 buah termometer, 1 buah pemanas listrik, Tripsin ditambahkan dengan beberapa tetes
2 buah pipet tetes,dan 1 buah labu ukur 25 indikator PP dan tetes demi tetes larutan
mL. Bahan-bahan yang digunakan adalah NaOH 0,2 M sampai timbul warna merah
100 mL larutan gelatin 5%, 100 mL larutan muda. Setelah itu, ditambahkan tetes demi
NaOH 0,2 M, 50 mL larutan NaOH 0,02 M, tetes larutan HCl 0,1 M ke dalam larutan
50 mL larutanHCl 0,1 M, indikator PP 1% tersebut sampai warna merahnya hilang.
secukupnya, 75 mL larutan formaldehida Kemudian larutan ini diinkubasi dalam
40%, 25 mL larutan tripsin 1%, dan aquades inkubator air pada suhu 38°C selama
secukupnya. beberapa menit. Selanjutnya, ditambahkan
Prosedur Kerja larutan tripsin ke dalam larutan gelatin dan
• Penyiapan Larutan Gelatin diaduk perlahan. Setelah tercampur merata,
Larutan gelatin sebanyak 100 mL diambil 10 mL campuran dan dimasukkan
ditambahkan 1 mL larutan fenolftalein dan ke dalam Erlenmeyer 100 mL (larutan ini
NaOH 0,2 M tetes demi tetes hingga timbul digunakan sebagai kontrol atau waktu nol).
warna merah muda. Larutan gelatin yang Dilakukan pendidihan untuk merusak enzim
berwarna merah muda ditambahkan tetes kemudian didinginkan. Kemudian
demi tetes larutan HCl 0,1 M sampai warna ditambahkan 15 mL formalin netral dan 3
merahnya hilang. Larutan tersebut kemudian tetes fenolftalein kemudian titrasi dilakukan
direndam dalam inkubator air pada suhu 38 menggunakan NaOH 0,02 M dengan
°C selama 5 menit. interval waktu 15, 30, 4, 60, 75, dan 90
• Penyiapan Larutan Tripsin menit dari waktu nol dilakukan yang sama
Larutan tripsin sebanyak 100 mL HASIL DAN PEMBAHASAN
ditambahkan dengan beberapa tetes Pada eksperimen ini dilakukan
indikator fenolftlein dan tetes demi tetes titrasi formal asam amino yaitu titrasi asam
larutan NaOH 0,2 M sampai timbul warna amino atau campuran asam amino dalam
merah muda. Larutan tripsin yang berwarna keberadaan formaldehida. Langkah pertama
merah muda ditambahkan tetes demi tetes pada praktikum ini dengan menyiapkan
larutan HCl 0,1 M ke dalam larutan tersebut larutan gelatin sebanyak 100 mL dengan
sampai warna merahnya hilang. Larutan menimbang sebanyak 5,0011 gram, lalu
tersebut kemudian diinkubasi dalam dilarutkan kedalam aquades yang telah
inkubator pada suhu 38°C selama 5 menit. dipanaskan dan diaduk hingga menjadi
• Titrasi Formal Asam Amino homogen. Larutan gelatin ditambahkan
Larutan gelatin sebanyak 100 larutan PP, larutan gelatin yang sudah
mLdisiapkan dengan melarutkan sebanyak ditambahkan indikator fenolftlein,
5,0011 gram padatan gelatin dan kemudian ditambahkan dengan larutan
ditambahkan aquades yang telah dipanaskan NaOH tetes demi tetes. Penambahan NaOH
sampai volume 100 mL. Setelah itu, ini mengakibatkan larutan gelatin berubah
ditambahkan 1 mL larutan indikator PP ke warna menjadi merah muda. Larutan gelatin
dalam larutan gelatin kemudian yang berwarna merah muda kemudian
ditambahkan dengan larutan NaOH 0,2 M ditambahkan dengan HCl tetes demi tetes
tetes demi tetes hingga timbul warna merah yang menyebabkan larutan kembali
muda. Kemudian ditambahkan tetes demi berwarna kuning bening. Penambahan HCl
tetes larutan HCl 0,1 M sampai warna merah bertujuan untuk membuat larutan tersebut
muda hilang. Selanjutnya larutan tersebut mencapai pH 8, karena sebelumnya
dilakukan penambahan NaOH yang NaOH tetes demi tetes. Penambahan NaOH
membuat larutan bersifat basa. Penambahan ini mengakibatkan larutan tripsin berubah
HCl hingga pH 8 dilakukan, karena pada warna menjadi merah muda. Larutan tripsin
pH ini merupakan pH optimum bagi enzim yang berwarna merah muda kemudian
tripsin untuk bekerja optimal. Selanjutnya ditambahkan dengan HCl tetes demi tetes
larutan gelatin ini diinkubasi pada suhu 38 yangmenyebabkan larutan kembali
°C. Pengkondisian ini bertujuan agar enzim berwarnaputih keruh Penambahan HCl
protease dapat bekerja secara optimal. bertujuan untuk membuat larutan tersebut
Pada langkah selanjutnya, larutan mencapai pH 8, karena sebelumnya
tripsin ditambahkan dengan indikator dilakukan penambahan NaOH yang
fenolftalein. Tujuan ditambahkannya membuat larutan bersifat basa. Penambahan
indikator fenolftalein adalah untuk HCl hingga pH 8 dilakukan, karena pada
mengetahui perubahan pH yang terjadi pada pH ini merupakan pH optimum bagi enzim
sistem larutan. Setelah ditambahkan tripsin untuk bekerja optimal. Selanjutnya
indikator fenolftalein larutan tidak berubah larutan tripsin ini diinkubasi pada suhu
warna. Larutan tripsin yang sudah 380C. Pengkondisian ini bertujuan agar
ditambahkan indikator fenolftlein, enzim protease dapat bekerja secara optimal.
kemudian ditambahkan dengan larutan

(a) (b) (c) (d)

Gambar 1. (a) Larutan gelatin, (b) Larutan Tripsin, (c) Campuran larutn tripsin dan
gelatin, (d) Campuran larutn tripsin dan gelatin yang dipanaskan.

Pada proses selanjutnya, setelah yang menghasilkan asam amino bebas


larutan tripsin dan larutan gelatin siap sehingga dapat dititrasi.
maka larutan tripsin dan larutan gelatin Larutan gelatin dan tripsin yang
dicampur dan diaduk perlahan. telah homogen, lalu diambil sebanyak 10
Pencampuran kedua larutan ini mL dan dimasukkan kedalam Erlenmeyer
menghasilkan warna putih kekuningan. kemudian dipanaskan hingga mendidih.
Penambahan larutan tripsin akan mampu Tujuan dilakukan pemanasan adalah untuk
menghidrolisis protein khususnya gelatin. merusak enzim sehingga reaksi akan
Digunakan larutan tripsin dalam hidrolisis terhenti. Larutan ini kemudian
protein ini karena pada tripsin terdapat didinginkan dan ditambahkan 15 mL
enzim protease yang mampu formalin netral dan 3 tetes fenolftalein.
menghidrolisis protein dengan memotong Larutan ini digunakan sebagai standar
ikatan peptida pada sisi C dari gelatin karena diambil pada menit ke-nol.
Pengambilan campuran ini diulangi
sebanyak 4 kali, dengan interval waktu juga terjadi pada gugus karboksil yang
tertentu, yaitu pada menit ke-15, menit ke- bersifat buffer pada pH rendah sehinga
30, menit ke 45, menit ke-60, menit ke-75, tidak mungkin dititrasi dengan basa.
dan menit ke-90. Masing -masing Reaksi yang terjadi pada titrasi
campuran tersebut diperlakukan sama dengan menggunakan formalin merupakan
seperti kontrol, yaitu dipanaskan hingga reaksi pembentukan dimetilol. Dengan
mendidih. Tujuan penambahan formalin terbentuknya dimetilol ini, berarti gugus
adalah agar formalin bereaksi dengan aminonya sudah terikat dan tidak akan
gugus amino yang tidak bermuatan mempengaruhi reaksi yang terjadi antara
sehingga memungkinkan gugus amonium gugus asam (karboksil) dengan basa
mem-buffer di daerah pH yang lebih (NaOH) sehingga titik akhir titrasi dapat
rendah dan dapat dititrasi pada titik akhir diakhiri dengan tepat. Indikator yang
secara kuantitatif menggunakan suatu digunakan adalah fenolftalein. Bila titik
indikator. Hal ini dilakukan karena jika akhir titrasi diperoleh tepat, maka akan
tidak ditambahkan dengan formaldehid, terjadi perubahan warna larutan dari
gugus amonium dari asam amino akan bening menjadi merah muda. Reaksi yang
bersifat buffer pada daerah pH tinggi, terjadi secara keseluruahan pada titrasi
diatas pH 11, sehingga tidak mungkin formal asam amino adalah sebagai berikut
dititrasi sampai titik akhir. Hal yang sama

Gambar 2.Reaksi Keseluruhan Titrasi Formal Asam Amino

Selama melakukan titrasi formal diperlukanpada menit ke- 0, 15, 30, 45,
asam amino volume NaOH yang 60, 75 dan 90 adalah sebagai berikut:
Tabel 1. Data Volume NaOH yang digunakanpadaTitrasi Formal Asam Amino

Menit ke- Volume NaOH


0 8.5
15 9
30 9.4
45 10
60 10.7
75 11.5
90 12.6

Berdasarkan data diatas, maka dapat NaOH yang diperlukan terhadap waktu
dibuat kurva hubungan antara volume yaitu sebagai berikut.

f(x) = 0.04x + 8.25 12.6


Volume NaOH (mL)

R² = 0.97 11.5
8.5 10.7
10
9 9.4

Waktu (menit)

Gambar 3. Kurva Hubungan antara Volume NaOHyang Diperlukan Terhadap Waktu

Berdasarkan kurva diatas dibutuhkan untuk mengikat gugus


menunjukkan bahwa semakin asam-asam amino bebas tersebut
lama larutan didiamkan, maka semakin banyak pula.
semakin lama waktu suatu larutan Berdasarkan hasil titrasi tersebut,
protein diinkubasi (dihidrolisis) dapat dibuat kurva mg nitrogen asam
maka semakin banyak pula amino terhadap waktu yang diperlukan
volume NaOH yang diperlukan larutan gelatin untuk bereaksi. Dalam
dalam mentitrasi larutan protein penentuan massa nitrogen asam amino,
tersebut. Hal ini disebabkan diasumsikan bahwa larutan NaOH 0,1 N
karena semakin lama larutan sebanyak 1 mL sebanding dengan 1,4 mg
protein diinkubasi, maka asam nitrogen asam amino, sehingga
amino bebas yang terbentuk dari konsentrasi NaOH 0,02 M yang sama
larutan gelatin semakin banyak, dengan 0,02 N sebanding dengan 0,28 mg
sehingga volume NaOH yang nitrogen asam amino, dengan
perhitungannya sebagai berikut.
0,02 N x mg
=
0,1 N 1,4 mg
0,1 x =0,028
x=0,28 mg

Jadi, 1 mL NaOH 0,02 N ekivalen Berikut ini perhitungan massa nitrogen


terhadap 0,28 mg nitrogen asam amino. asam amino pada setiap interval waktu
 Pada menit ke-0 VNaOH = 10 mL ; 10 x 0,28 = 2,8 mg
VNaOH = 8,5 mL ; 8,5 x 0,28 = 2,38 mg  Pada menit ke-60
 Pada menit ke-15 VNaOH = 10,7 mL ; 10,7 x 0,28 = 2,99 mg
VNaOH = 9 mL ; 9 x 0,28 = 2,52 mg  Pada menit ke-75
 Pada menit ke-30 VNaOH = 11,5 mL ; 11,5 x 0,28 = 3,22 mg
VNaOH = 9,4 mL ; 9,4 x 0,28 = 2,63 mg  Pada menit ke-90
 Pada menit ke-45 VNaOH = 12,6 mL ; 12,6 x 0,28 = 3,53 mg

Tabel 2. DatamgNitrogen yang Dihasilkan Oleh Asam Aminopada Menit ke-0,


15,30, 45, 60, 75 dan 90
Menit ke- mg Nitrogen
0 Asam Amino
2.38
15 2.52
30 2.63
45 2.8
60 2.99
75 3.22
90 3.53
Berdasarkan data diatas, dapat yang dihasilkan oleh asam amino terhadap
dibuat kurva hubungan antara mg nitrogen waktu yaitu sebagai berikut
mg Nitrogen Asam Amino

f(x)
f(x) == 0.01x
0.01x++2.31
2.31 3.53
2.38
R² = 0.97 3.22
R² = 0.97 2.99
2.63 2.8
2.52

Waktu (menit)

Gambar 4. Kurva Hubungan antara mg Nitrogen Terhadap Waktu

Berdasarkan kurva diatas tripsin yang semakin lama menghidrolisis


menunjukkan peningkatan jumlah mg gelatin menyebabkan gugus karboksil dan
nitrogen asam amino seiring dengan gugus amino yang dihasilkan semakin
bertambahnya waktu kontak antara larutan banyak, sehingga nitrogen yang terdapat
gelatin dengan larutan tripsin.Enzim pada dimetilol juga ikut bertambah.

SIMPULAN
Berdasarkan hasil pengamatan
dan pembahasan, dapat ditarik simpulan
yaitu,
a. Protein (gelatin) dapat dihidrolisis
dengan enzim protease dari tripsin dan
melalui titrasi formal asam amino
diketahui derajat hidrolisis asam amino
b. Dari data hasil titrasi formal asam
amino dapat dibuat kurva hubungan antara
volume NaOHterhadap waktu dan kurva
hubungan mg nitrogen asam amino
terhadap waktu pada titrasi formal asam
UCAPAN TERIMA KASIH
amino dapat dijelaskan bahwa semakin
Ucapan terima kasih penulis
lama larutan didiamkan, maka semakin
sampaikan kepada Dr. I Nyoman Tika,
banyak volume NaOH yang diperlukan
M.Si., sebagai dosen pengampu mata
untuk mentitrasi larutan asam amino
kuliah Praktikum Biokimia atas
tersebut maka semakin banyak pula mg
bimbingan dan masukan selama
nitrogen dari asam amino yang dihasilkan.
praktikum ini, I Dewa Subamia selaku
laboran di Program Studi Kimia atas
bantuan dalam memberikan segala
keperluan yang berkaitan dengan
praktikum sehingga percobaan ini dapat
dilaksanakan dengan baik.
REFERENSI
Fessenden, F dan Fessenden. 1994. Kima
Organik Jilid 2. Jakarta : Erlangga
Tika, I Nyoman. 2010. Buku Penuntun