Review Jurnal :

Hyperlipidemia mengganggu refleks serebrovaskular

dan memburuk cacat perfusi iskemik

PENDAHULUAN

Hyperlipidemia mempromosikan atherosclerosis ekstrakranial dan risiko untuk stroke

atherothrombotic dan cardioembolic. Namun, itu berdampak pada regulasi serebrovaskular di
otak normal atau iskemik kurang dipahami dengan baik. Independen dari stenosis aterosklerotik,
hiperlipidemia merusak fungsi otot endotel dan otot polos baik arteri sistemik dan serebral.
Misalnya, hyperlipidemia mengganggu relaksasi endotelium yang bergantung pada karotis dan
basilar arteri in vitro, dan di arteriol pial in situ.3-6 Fungsi endotel dipulihkan oleh pemulung
radikal bebas, penghapusan genetik NADPH oksidase subunit gp91 (phox), dan L-arginin, yang
berimplikasi berkurang ketersediaan oksida nitrat sebagai mekanisme penting.7,8 Selain itu,
lipoprotein densitas rendah yang dioksidasi menambahi leukosit microvasculature, dan mengarah
ke sensitisasi Ca2 dalam pembuluh darah otot polos melalui aktivasi Rho / Rho-kinase.9 Oleh
karena itu, hiperlipidemia dapat mempengaruhi fisiologi serebrovaskular melalui endotelium,
otot polos, dan sel yang bersirkulasi.

BAHAN DAN METODE

Hewan dan Diet Eksperimental Semua prosedur eksperimental dilakukan sesuai dengan
Panduan ini untuk Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium (Publikasi NIH No. 85-23,
1996), dan telah disetujui oleh dewan peninjau kelembagaan (MGH Sub-komite tentang
Penelitian Hewan, SRAC). Sebanyak 144 tikus digunakan. Pria tikus tipe liar (C57BL / 6J)
dibandingkan dengan ApoE / tikus (Jackson Laboratorium, Bar Harbor, ME, USA) melakukan
backcross dengan latar belakang C57BL / 6J selama lebih dari 10 generasi. Semua tikus diberi
makan chow biasa atau ‘western’- tipe HFD yang mengandung 42% total kalori dari lemak dan
0,15% kolesterol (Harlan-Teklad, Indianapolis, IN, USA) hingga 12 minggu mulai dari usia 4
minggu.
CBF Istirahat Mutlak

Kami mengukur CBF istirahat absolut di korteks, striatum, dan otak kecil menggunakan
teknik [14C] -iodoamphetamine (masing-masing n¼4, jenis liar dan ApoE /). Tikus pada
awalnya dibius dengan isoflurane (induksi 2%, 1% pemeliharaan), diintubasi melalui
trakeostomi, dan berventilasi mekanis (70% N2O, 30% O2; SAR 830 / P, CWE, Ardmore, PA,
USA). Ventilasi parameter dan campuran gas disesuaikan untuk mempertahankan arteri normal
pCO2 dan pO2. Arteri femoralis dan vena jugularis eksterna dikateterisasi. Anestesi kemudian
dialihkan ke a-chloralose (50 mg / kg, intraperitoneal). Suhu tubuh dijaga pada suhu 37C dengan
menggunakan bantal pemanas termostatik (FHC, Bowdoinham, ME, USA).

Laser Speckle Flowmetry (LSF)

Kami mengukur perubahan CBF non-invasif melalui tengkorak utuh menggunakan LSF,
seperti yang dijelaskan secara terperinci di tempat lain.14 Secara singkat, kamera perangkat yang
dilengkapi charge (Cohu, San Diego, CA, USA) diposisikan di atas kepala (bidang pencitraan
5.24 7mm2), dan dioda laser (780 nm) digunakan untuk menerangi yang utuh permukaan
tengkorak secara difus. Kedalaman penetrasi laser adalah sekitar 500 mm. Gambar spekel
mentah digunakan untuk menghitung spekel kontras, yang merupakan ukuran visibilitas speckle
terkait dengan kecepatan partikel hamburan, dan karenanya CBF. Kontras belu didefinisikan
sebagai rasio standar deviasi intensitas piksel terhadap piksel rata-rata intensitas di wilayah kecil
gambar.

Fisiologi Serebrovaskular

Kami menilai penggandaan neurovaskular fungsional, hiperkapartemia, dan autoregulasi

pada mouse yang sama dalam urutan ini (n¼11 dan 7, liar jenis dan ApoE /, masing-masing).
Tikus dibius dengan isofluran (2% induksi, 1% pemeliharaan), diintubasi melalui trakeostomi,
dan berventilasi mekanis (70% N2O, 30% O2; SAR 830 / P, CWE). Femoral arteri dikateterisasi
untuk perekaman tekanan darah terus menerus (ETH-400 penguat transduser, ADInstruments,
Medford, MA, USA), dan gas darah dan pengukuran pH setidaknya setiap 30 menit (sampel 30
ml, Gas Darah Penganalisis 248, CIBA / Corning, New York, NY, AS). Parameter ventilasi dan
campuran gas disesuaikan untuk mempertahankan pCO2 dan pO2 arteri normal. Suhu tubuh
dijaga pada suhu 37C dengan menggunakan bantal pemanas termostatik (FHC).
Defisit Perfusi pada Stroke Iskemik

Kami memeriksa cacat perfusi iskemik menggunakan LSF selama pertengahan distal
oklusi arteri serebral (dMCAO; n¼27 dan 25, tipe liar dan ApoE /, masing-masing, pada
berbagai durasi HFD). Tikus dibius dengan isoflurane (2% untuk induksi, 1% untuk
pemeliharaan, dalam 70% N2O dan 30% O2) dan diintubasi melalui trakeostomi. Kedalaman
anestesi disesuaikan dengan menekan respons kardiovaskular pada cubitan ekor. Arteri femoralis
adalah kateter untuk pengukuran tekanan darah. Suhu dubur disimpan pada suhu 37C dengan
menggunakan alas pemanas yang dikontrol secara termostatis. Tikus umpuh (pancuronium
bromide, 0,4 mg / kg / jam, intraperitoneal), berventilasi mekanis, dan ditempatkan dalam
bingkai stereotaxic. Darah arteri gas dan pH diukur setiap 30 menit dan ventilasi disesuaikan
pertahankan dalam jangkauan fisiologis.

Penentuan Volume Infark

Kami menentukan volume infark setelah 4 atau 8 minggu HFD secara terpisah kelompok
tikus (masing-masing n¼12, tipe liar dan ApoE /) tanpa intubasi atau ventilasi mekanis, karena
intervensi ini meningkat secara signifikan morbiditas dan mortalitas selama periode bertahan
hidup. Setelah 60 menit dMCAO seperti dijelaskan di atas, klip mikrovaskular telah dihapus
dengan hati-hati dan reperfusi dikonfirmasi menggunakan LSF. Tikus dikeluarkan jika reperfusi
tidak ditetapkan, atau jika perdarahan terjadi di situs klip. Tikus-tikus itu terbunuh 48 jam setelah
iskemia dan seluruh otak diinkubasi pada 2,3,5- triphenyl-tetrazolium chloride (TTC) selama 60
menit. Setelah mendapatkan gambar dari permukaan hemisferik dorsal dan lateral secara
terpisah, otak dipotong menjadi bagian koron setebal 1 mm, dan area infark pada setiap bagian
itu terukur dan terintegrasi. Karena volume infark yang relatif kecil setelah dMCAO, volume
infark tidak langsung untuk koreksi edema tidak andal dan karenanya tidak diperhitungkan.
Ambang Batas CBF untuk Viabilitas Jaringan Kami menentukan tingkat kritis minimum residu
CBF yang diperlukan untuk mempertahankan viabilitas jaringan dengan menggabungkan hasil
jaringan menggunakan TTC defisit pewarnaan dan perfusi menggunakan LSF (n¼17 dan 12, tipe
liar dan ApoE /, masing-masing, pada berbagai durasi HFD). Menggunakan permukaan tengara,
pandangan punggung otak bernoda TTC topikal pada 48 jam adalah terdaftar bersama dengan
gambar LSF yang diperoleh 60 menit setelah Dmcao sebelum reperfusi. Ketidakcocokan spasial
kecil dikoreksi oleh gambar bengkok bila perlu. Profil CBF residual antara lambda dan cabang
MCA yang tersumbat kemudian diplot seperti dijelaskan di atas menggunakan LSF peta dan
ditumpangkan pada gambar otak punggung bernoda TTC menunjukkan infark. CBF residual
yang sesuai dengan tepi infark ditentukan sebagai ambang di bawah mana infark terjadi, seperti
yang dilaporkan sebelumnya.

Pengukuran Kolesterol Serum

Darah dikumpulkan dari arteri femoralis pada akhir percobaan di atas es selama 30 menit,
disentrifugasi (14.000 r.p.m., 4 1C selama 10 menit), dan serum disimpan pada suhu 80 1C
sampai distribusi kolesterol lipoprotein diukur dengan kromatografi cair tekanan tinggi
(Liposearch, Skylight Biotech, Akita, Jepang). Pengukuran lipid plasma menunjukkan sekitar 4-6
kali lipat peningkatan total kolesterol dan kepadatan rendah fraksi lipoprotein (LDL), dan
penurunan kepadatan tinggi 60% hingga 70% fraksi lipoprotein (HDL), dalam ApoE /
dibandingkan dengan tikus tipe liar; kadar trigliserida tidak berubah (Tabel Tambahan 1).

Western Blotting

Untuk analisis Western blot, seluruh otak dari tipe liar (WT) pada 8 minggu HFD, ApoE /
tikus pada diet reguler, dan ApoE / tikus pada 8 minggu HFD (masing-masing n¼3)
dihomogenisasi oleh penggiling jaringan dengan buffer lisis mengandung 10mM Tris-HCl, pH
6,8, 1mM EDTA, dan 10% SDS dengan satu tablet mini protease-inhibitor-koktail lengkap
(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA) per buffer 50 mL. Lima belas ml diencerkan dengan
tepat larutan protein dan 10 ml 2 sampel buffer (125mM Tris-HCl, pH 6,8, 4% SDS, 20%
gliserol, 0,05% bromphenol blue dan 10% b-2-mercaptoethanol) direbus selama 10 menit pada
95 1C. Jumlah yang sama 60 mg protein per sampel dipisahkan pada 7,5% SDS-polyacrylamide
gel dan selanjutnya dipindahkan ke membran fluoride polivinilidena (Millipore, Billerica, MA,
USA).

Histopatologi

Kami memeriksa tingkat aterosklerosis pada otak dan ekstraserebral arteri menggunakan
pewarnaan hematoxylin / eosin rutin perfusi intrakardiak diperbaiki jaringan (4%
paraformaldehyde) dipanen pada akhir LSF percobaan dalam tiga tipe liar dan lima ApoE / tikus.
Selain itu, tiga ApoE / tikus diperiksa setelah lebih dari 6 bulan HFD dimulai pada usia 12 bulan.
Otak juga dinilai untuk neuropatologis perubahan. Basis tengkorak dan tulang belakang leher
serta toraks dibedah blok, dengan jantung, lengkung aorta dan cabang serviks utama di situ,
termasuk bagian yang membeku dari arteri karotis interna dan serviks arteri vertebralis. Jaringan
kemudian didekalsifikasi, disematkan parafin, dan sectioned (12 mm) en blok untuk melestarikan
hubungan anatomi. Ekranakranial dan arteri intrakranial diperiksa untuk keberadaan yang
terbuka (mis., sumbing kolesterol) atau aterosklerosis (misalnya sel busa subendotelial).

Analisis Data dan Statistik

Eksperimen dilakukan dengan menggunakan genotipe; namun, perubahan yang terlihat

pada kualitas bulu dari waktu ke waktu menghalangi penyumbatan efektif untuk durasi HFD.
Tidak adanya intervensi terapeutik meniadakan kebutuhan untuk pengacakan. Berdasarkan
kriteria yang telah ditentukan, hewan dikeluarkan jika tekanan darah arteri awal kurang dari
80mmHg, pH kurang dari 7,25, pCO2 lebih dari 50mmHg, dan pO2 kurang dari 100mmHg. Data
dianalisis dengan cara topeng, dinyatakan sebagai rata-rata ± standar kesalahan, dan diuji secara
statistik menggunakan uji-t atau analisis satu atau dua arah varians untuk tindakan independen
atau berulang yang diikuti oleh Tukey, Sidak, atau beberapa uji perbandingan Dunnet jika perlu
(SPSS v11.0, IBM, Armonk, NY, USA; GraphPad Prism v6, La Jolla, CA, USA). Po0.05
dianggap signifikan secara statistik.

HASIL

Histopatologi

Tikus tipe liar tidak menunjukkan bukti aterosklerosis (n¼3; tidak ditampilkan),
sedangkan semua ApoE / tikus dikembangkan lebih awal perubahan yang terdiri dari sel busa
subendothelial yang tersebar di arteri karotis, dan garis-garis lemak ringan di lengkung aorta
proksimal setelah 10 minggu HFD dimulai pada usia 4 minggu (n¼5; Gambar Tambahan 1).
Tidak ada tikus yang menunjukkan aterosklerotik stenosis luminal pada pembuluh serviks pada
usia ini dan HFD durasi. Sebaliknya, aterosklerotik parah dan sering oklusif plak ditemukan di
aorta dan arteri serviks dalam 18 bulan ApoE / tikus diberi makan HFD selama 6 bulan (n¼3).
Intrakranial pembuluh darah bebas dari semua perubahan aterosklerotik yang dapat dilihat di
semua kelompok umur dan durasi HFD dipelajari (tidak ditampilkan).
Fisiologi Sistemik dan Aliran Darah Cerebral Beristirahat

Tekanan darah arteri kira-kira 10% lebih tinggi pada ApoE / tikus tanpa memandang usia
dan durasi HFD, sementara berat badan dan nilai pH arteri dan gas darah tidak berbeda secara
signifikan tipe liar (Tabel Tambahan 2). Meskipun tekanan darah lebih tinggi, CBF istirahat
absolut adalah 20% -30% lebih rendah pada ApoE / tikus dibandingkan dengan tipe liar di
korteks, striatum, dan otak kecil menunjukkan peningkatan resistensi serebrovaskular
(Tambahan Tabel 3). Ini dikonfirmasi non-invasif oleh LSF, yang menunjukkan pengurangan
progresif dalam beristirahat CBF di ApoE / tikus terkait untuk durasi HFD (Gambar 1). Tikus
tipe liar tidak menunjukkan perubahan konsisten dalam istirahat CBF bahkan setelah 10 minggu
HFD.

Respons Aliran Darah Cerebral Fisiologis

Refleks fisiologis dipelajari pada usia 16 ± 1 minggu setelahnya 10 ± 1 minggu HFD

dalam tipe liar, dan pada usia 14 ± 1 minggu setelah 11 ± 1 minggu HFD di ApoE / tikus.
Cacat Perfusi setelah dMCAO

Kami memeriksa defisit perfusi dinamis selama stroke akut menggunakan pencitraan
speckle laser non-invasif melalui tengkorak utuh di berbagai usia dan durasi HFD dalam
kelompok yang terpisah (Gambar 5). MCAO distal secara tiba-tiba mengurangi CBF regional
atas dorsolateral korteks pada semua kelompok (Gambar 5A). Pengurangan perfusi penumbral
(ROI persegi) lebih parah pada ApoE / tikus dibandingkan dengan tipe liar setelah 8 dan 10
tetapi tidak 4 minggu HFD (Gambar 5A, grafik). Perbedaannya bertahan sepanjang 60 menit
dMCAO. Pada intinya, CBF berkurang hingga kurang dari 20% dan tidak berbeda antara strain
(P40.05; tidak ditampilkan). Itu Profil CBF di seluruh wilayah iskemik dipastikan lebih parah
defisit perfusi pada ApoE / tikus dalam penumbra setelah HF.

Volume Infark

Konsisten dengan defisit perfusi yang lebih buruk, volume infark adalah secara signifikan
lebih besar pada ApoE / tikus dibandingkan dengan tipe liar setelah 8 tetapi tidak 4 minggu HFD
bila diukur 48 jam setelahnya DMCAO transien 1 jam (14,5 ± 2,3 vs 14,0 ± 2,9mm3 setelah 4
minggu, dan 11,0 ± 3,9 vs 21,4 ± 3,2mm3 setelah 8 minggu HFD di alam liar jenis dan ApoE /,
masing-masing; Po0.05 setelah 8 minggu; Gambar 6). Infark dalam tipe liar cenderung lebih
kecil setelah 8 minggu HFD dibandingkan dengan 4 minggu. Perbedaannya jelas dalam semua
tingkat irisan anteroposterior.
Ambang Batas

Untuk menguji apakah volume infark yang diperbesar dalam ApoE / tikus dapat
dijelaskan oleh faktor hemodinamik saja, kami menghitung ambang batas viabilitas,
didefinisikan sebagai ambang batas CBF di bawahnya infark terjadi (Gambar 7). Ambang batas
CBF untuk kelayakan secara signifikan lebih tinggi pada ApoE / tikus dibandingkan dengan liar
ketik setelah 8 tetapi tidak 4 minggu HFD, menunjukkan bahwa selain defisit CBF yang secara
signifikan lebih buruk, ApoE / jaringan otak juga lebih banyak peka terhadap iskemia, dan terjadi
infark pada hipoperfusi yang lebih ringan level dibandingkan dengan tipe liar. Menariknya, 8
minggu HFD tampaknya mengurangi ambang batas viabilitas pada tikus tipe liar menyarankan
efek neuroprotektif.

eNOS Fosforilasi

Untuk mengeksplorasi dasar molekuler untuk agunan serebrovaskular disfungsi pada

ApoE / tikus, kami mempelajari ekspresi dan status fosforilasi eNOS dalam jaringan otak yang
dihomogenisasi (Gambar Tambahan 2). Sedangkan kadar total protein eNOS tidak berbeda
antara ApoE / dan tikus tipe liar setelah HFD, eNOS fosforilasi di situs pengaturan positif Serine
1176 (S1176) berkurang pada ApoE / tikus, dan fosforilasi pada situs peraturan negatif
Threonine 494 meningkat dibandingkan dengan tipe liar setelah 8 minggu HFD. ApoE / tikus
dengan diet teratur juga menunjukkan penurunan fosforilasi S1176 meskipun pada tingkat lebih
rendah, sementara Threonine 494 fosforilasi tidak berubah.

DISKUSI

Peningkatan risiko stroke pada hiperlipidemia umumnya dikaitkan dengan aterosklerosis

serviks atau koroner predisposisi aterothrombotik dan stroke kardioembolik. Namun, data kami
menunjukkan itu bahkan tanpa adanya stenosis aterosklerotik, keduanya beristirahat CBF dan
respons vasodilator mendasar terhadap hiperkapnia, fungsional aktivasi kortikal, dan penurunan
tekanan perfusi berkurang pada ApoE hiperlipidemia / tikus. Apalagi arteri focus Oklusi
menghasilkan cacat perfusi yang lebih besar, mungkin karena aliran agunan terganggu. Diambil
bersama dengan tinggi tekanan darah arteri pada ApoE / tikus, terdeteksi pada beberapa tetapi
tidak semua model hewan hiperlipidemia, 5,18 data ini menyarankan CVR istirahat signifikan
meningkat dan vasodilator berat disfungsi pada ApoE / tikus. Disregulasi CBF global semacam
itu mungkin merupakan mekanisme di mana hiperlipidemia mengganggu jaringan homeostasis
dan predisposisi untuk parenkim progresif lambat degenerasi saraf. Misalnya, relatif hipoperfusi
saat istirahat negara dan ketidakcocokan penawaran-permintaan selama metabolisme fungsional
aktivasi dapat menyebabkan kondisi hipoksik-iskemik tingkat rendah yang kronis, selanjutnya
diperburuk oleh gangguan autoregulasi selama hipotensi sementara. Apalagi hipoperfusi saat
istirahat dan mengalami gangguan fungsi vasodilator dapat mengganggu aliran kolateral,
menempatkan lebih besar volume jaringan berisiko infark pada pasien hyperlipidemia setelah
stroke.

ApoE / tikus hiperlipidemia memang mengembangkan jaringan yang lebih parah cedera
pada iskemia serebral fokal yang diperburuk oleh HFD.27 Namun, apakah infark yang membesar
pada ApoE / tikus adalah terkait dengan disfungsi pembuluh darah hiperlipidemia dan lebih
buruk cacat perfusi belum jelas. Dalam laporan sebelumnya, CBF Defisit tidak diukur, atau
diukur hanya pada iskemik inti pada ApoE muda / diet teratur dan tidak berbeda the wild
type.20,27-32 Akibatnya, penelitian sebelumnya menyimpulkan bahwa hasil jaringan yang lebih
buruk mencerminkan mekanisme non-vaskular. Namun, metode tradisional untuk menilai perfusi
selama focus oklusi arteri tidak memiliki spasial (mis., Doppler laser) atau informasi sementara
(mis., autoradiografi). Karena itu, apakah Disfungsi pembuluh darah hiperlipidemia dapat
memperburuk perfusi cacat setelah oklusi arteri fokal belum memadai diuji. Data kami diperoleh
menggunakan flowmetry laser speckle dengan tinggi resolusi spasial dan temporal menunjukkan
perfusi yang jauh lebih besar.