BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Tempat dan Waktu Penelitian

1. Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas
Indonesia, Herbarium Bogoriense Balitbang Botani Puslitbang Bilologi LIPI-
Cibinong, Laboratorium Terpadu Fakultas Farmasi dan Sains Universitas
Muhammadiyah Prof. Dr. HAMKA, dan Laboratorium Kesehatan Daerah
(LAPKESDA) DKI Jakarta.

2. Jadwal Penelitian

No Uraian kegiatan Bulan I Bulan II Bulan III Bulan IV

1234 1234 1234 1234
1 Telaah Pustaka xxxx xxxx xxxx xxxx
2 Konsultasi xxxx xxxx xxxx xxxx
3 Penyusunan Proposal xxxx
4 Seminar Proposal x
5 Pelaksanaan Orientasi xx
6 Pengumpulan Data x xx
7 Pengolahan Data x
8 Penulisan Skripsi xxxx xxxx xxxx xxxx
9 Sidang x
Keterangan : x = ada kegiatan
Tabel 3.1 Rencana Penelitian

B. Alat dan Bahan Penelitian

1. Alat Penelitian

14
 Alat yang digunakan adalah; Seperangkat alat destilasi uap, GC-MS, belender,
gelas ukur 100 ml Pyrex, gelas erlenmeyer 250 ml Pyrex, gelas ukur 100 ml Pyrex,
labu destilasi 1000 ml Pyrex, pipet tetes, hot plate, aluminium foil, neraca analitik,
spatula, syringe 1 mL.
2. Bahan Penelitian
Bahan yang dibutuhkan antara lain; Daun dan batang ruku-ruku segar yang
diambil dari perkebunan di Tangerang, Na2SO4 anhidrat p.a. Merck, alkohol 96%,
metanol, aquadest.

C. Prosedur Penelitian
1. Determinasi Tanaman
Bahan yang digunakan adalah daun dan batang Tanaman ruku-ruku (Ocimum
tenuiflorum L.) dideterminasi. Determinasi tanaman dilakukan di Herbarium
Bogoriense, Balitbang Botani Puslitbang Bilologi LIPI-Cibinong.
2. Minyak atsiri Daun dan Batang Ruku-ruku
a. Pengolahan Simplisia bahan uji
Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah daun dan batang ruku-ruku segar.
Daun dan batang ruku-ruku segar diperoleh dari …. dengan kriteria warna hijau tua.
Sebanyak 200 gram daun dan batang ruku-ruku segar yang telah di sortir disortir
dan dipotong dengan ukuran yang cukup kecil dan kemudian diblender hingga halus
dengan penambahan aquades 200 ml dan kemudian dimasukkan ke dalam labu alas
ukuran 1000 ml.
b. Minyak Atsiri Daun Ruku-ruku Dengan Alat Destilasi Stahl
Minyak atsiri daun dan batang ruku-ruku diperoleh dengan cara merangkai alat
destilasi Sstahl dan labu alas yang didalamnya sudah terdapat 200 gram daun dan 200
gram batang ruku-ruku halus. Kemudian proses destilasi dilakukan pada suhu 110 –
115o C selama 4-5 jam. Minyak atsiri yang masih bercampur dengan air, dipisahkan
dengan cara sirkulasi kembali ke labu alas. Minyak atsiri yang diperoleh ditambahkan
dengan Na2SO4 anhidrat, kemudian dipisahkan dengan menggunakan spuit 1 mL dan

15
minyak yang diperoleh ditentukan persentasinya. Selanjutnya dianalisis profil
metabolit yang terkandung dengan menggunakan GC-MS.

c. Analisis GC-MS
Analisis GC-MS dilakukan di Laboratorium Kesehatan Daerah DKI Jakarta.
Sebanyak ±2 mL minyak atsiri disuntikkan ke dalam seri GC8000 yang
digabungkan dengan analisis massa TSQ8000 MS (Triplequadrapole). Pemisahan
dilakukan dengan menggunakan kolom DB5-MS. Suhu injeksi 230° C. Aliran
Helium 1 mL/menit. Setelah waktu tunggu pelarut 5 menit pada suhu 70° C, suhu
oven dinaikkan pada suhu 5 °C/menit sampai 310° C, 1 menit isokratik dan
didinginkan hingga 70° C, diikuti dengan penambahan waktu tunggu 5 menit.
Integrasi tanda ion dilakukan dengan menggunakan lab massa untuk menemukan
metode target untuk fragmen karakteristik puncak yang ditandai (Ingole 2016).

d. Identifikasi komponen
Interpretasi spektrum massa GC-MS dilakukan dengan menggunakan data base
Perpustakaan Instrumentasi Sentral. Spektrum komponen yang tidak diketahui
dibandingkan dengan spektrum komponen yang diketahui yang tersimpan di
perpustakaan instrumentasi sentral. Berat molekul, rumus molekul dan jumlah isyarat
yang digunakan untuk mengidentifikasi nama senyawa dari Perpustakaan spektrum
dicatat (Ingole 2016).
e. Uji Aktivitas Antioksidan
Prosedur kerja uji aktivitas antioksidan adalah:
1. Disiapkan larutan DPPH 0,004%. Dipipet 200 µl pelarut (metanol) kedalam
kuvet, ditambahkan larutan DPPH ad 3 ml, dihomogenkan, dan segera dibuat
spektra sinar tampak (400-600 nm). Selanjutnya dicatat adsorbans yang terdapat
pada kurva puncak.
2. Pengukuran anti radikal bebas untuk bahan uji dipipet 200µl minyak atsiri kedalam
kuvet, ditambahkan larutan DPPH ad 3 ml, lalu segera dibuat spektra sinar

16
 tampak. Selanjutnya, dicatat adsorbans pada menit ke-5 dan juga pada menit ke-60
setelah pereaksian.
3. Perhitungan kapasitas anti radikal bebas DPPH diukur dari peredaman warna ungu
merah DPPH yaitu dengan puncak 517 nm
4. Perhitungan kapasitas anti radikal bebas sebagai % peredaman adsorban pada
puncak 517 nm menggunakan perhitungan sebagai berikut:

A hitung bahan uji = Amaks –

A hitung DPPH = Amaks –

% Peredaman DPPH =

Keterangan:
A1 : Serapan yang didapat pada kurva dengan panjang gelombang sebelum puncak
maksimum.
A2 : Serapan yang didapat pada kurva dengan panjang gelombang setelah puncak
maksimum.

Nilai 0% berarti tidak mempunyai aktivitas anti radikal bebas, sedangkan nilai
100%, berarti peredaman total dan perlu dilanjutkan dengan pengenceran bahan uji.
Untuk melihat batas konsentrasi aktivitasnya. Selanjutnya dibuat kurva linear antara
konsentrasi larutan uji dengan % peredaman DPPH dan ditentukan harga IC50 yakni
konsentrasi larutan uji yang memberikan peredaman DPPH sebesar 50% (Amrun dan
Umayah, 2005). Harga IC50 umumnya untuk menyatakan aktivitas antioksidan suatu
bahan uji dengan peredaman radikal bebas DPPH (Molyneux, 2004)

17
f. Bagan penelitian

200 gram daun ruku-ruku segar

Dipotong-potong dengan ukuran yang cukup kecil

Dihaluskan dengan blender dengan penambahan 200
mL air
Dimasukkan kedalam labu alas 1000 mL
Dirangkai alat destilasi stahl
Dipanaskan pada suhu 110-115O C selama 4-5 jam

Lapisan minyak atsiri dan air

Air destilat dialirkan secara kontiniu ke labu alas

Lapisan atas Lapisan bawah

Ditampung di botol vial

Ditambahkan Na2SO4 anhidrat
Didiamkan
Dipisahkan

Minyak atsiri Na2SO4 hidrat

Dianalisa dengan GCMS dan uji antioksidan

18
G. Cara Analisis Data
Data yang diperoleh pada analisis metabolit sekunder dengan GC-MS berupa
berat molekul dan pola fragmentasi yang menunjukkan jenis metabolit dan intensitas
peak yang menunjukkan kadar. Data hasil penelitian yang diperoleh dianalisa
menggunakan metode analisis cluster. Data hasil yang diperoleh dianalisis cluster
menggunakan program SPSS. Pengelompokan data berdasarkan keberadaan senyawa
dan luas area. Kemudian dilakukan analisis anova untuk mengetahui apakah kadar
minyak atsiri daun dan batang ruku-ruku berbeda secara signifikan.

19