Nama : Maestro Abdillah

Nim : 061930400586
Kelas : 3 KB
Mk : Praktikum KAI

SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS

I. DASAR TEORI

Spektrofotometri UV-Vis adalah anggota teknik analisis

spektroskopik yang memakai sumber REM (radiasi elektromagnetik)
ultraviolet dekat (190-380 nm) dan sinar tampak (380-780 nm) dengan
memakai instrumen spektrofotometer.Spektrofotometri UV-Vis melibatkan
energi elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehingga
spektrofotometri UV-Vis lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif
dibandingkan kualitatif.

Spektrofotometri merupakan salah satu metode dalam kimia analisis

yang digunakan untuk menentukan komposisi suatu sampel baik secara
kuantitatif dan kualitatif yang didasarkan pada interaksi antara materi
dengan cahaya.Peralatan yang digunakan dalam spektrofotometri disebut
spektrofotometer.Cahaya yang dimaksud dapat berupa cahaya visibel, UV
dan inframerah, sedangkan materi dapat berupa atom dan molekul namun
yang lebih berperan adalah elektron valensi. 2

Sinar atau cahaya yang berasal dari sumber tertentu disebut juga
sebagai radiasi elektromagnetik. Radiasi elektromagnetik yang dijumpai
dalam kehidupan sehari-hari adalah cahaya matahari. Dalam interaksi materi
 dengan cahaya atau radiasi elektromagnetik. Radiasi elektromagnetik
kemungkinan dihamburkan, diabsorbsi atau dihamburkan dikenal adanya
spektroskopi hamburan, spektoskopi absorbsi ataupun spektroskopi emisi.

Pengertian spektroskopi dan spektrofotometri pada dasarnya sama

yaitu di dasarkan pada interaksi antara materi dengan radiasi
elektromagnetik.Namun pengertian spektrofotometri lebih spesifik atau
pengertiannya lebih sempit karena ditunjukan pada interaksi antara materi
dengan cahaya (baik yang dilihat maupun tidak terlihat). Sedangkan
pengertian spektroskopi lebih luas misalnya cahaya maupun medan magnet
termasuk gelombang elektromagnetik.

Cahaya yang dapat dilihat oleh manusia disebut cahaya terlihat/

tampak. Biasanya cahaya yang terlihat merupakan campuran dari cahaya
yang mempunyai berbagai panjang gelombang, mulai dari 400 nm , seperti
pelangi di langit.
Hubungan antara warna pada sinar tampak dengan panjang
gelombang terlihat seperti tabel dibawah. Dalam tabel berikut ini tercantum
warna dan warna komplementernya merupakan pasangan dari setiap dua
warna dari spektrum yang menghasilkan warna putih jika dicampurkan.
Tabel Warna dan warna komplementer

Panjang Warna Warna Komplementer

gelombang
(nm)
400 – 435 Ungu Hijau Kekuningan
435 – 480 Biru Kuning
480 – 490 Biru Kehijauan Jingga
490 – 500 Hijau Kebiruan Merah
500 – 560 Hijau Ungu Kemarahan
 560 – 580 Hijau Kekuningan Ungu
592 – 610 Jingga Biru Kehijauan
610 – 680 Merah Hijau Kebiruan
680 – 700 Ungu Kemerahan Hijau
Saat sinar mengenai larutan bening , maka akan terjadi 2 hal :
1. Transmisi
Transmitan larutan adalah bagian dari sinar yang diteruskan melalui larutan.

2. Absorpsi

Cahaya akan diserap jika energi cahaya tersebut sesuai dengan energi yang
dibutuhkan untuk mengalami perubahan dalam molekul. Absorbansi larutan
bertambah dengan pengurangan kekuatan sinar.

Bila seberkas sinar radiasi dengan intensitas I ˳ dilewatkan melalui medium

yang panjang b dan mengandung molekul pada tingkat energi elektronik dasar
dengan konsentrasi C, Maka radiasi akan diserap sebagian dan intensitas radiasi
akan berkurang menjadi I , sehingga berlaku persamaan :

I = I ˳. exp (- kbc) (1)

atau
Log I ˳ /¿ I = a.b.c atau A = a.b.c (2)
dengan,
k
a ¿ 2,303 =koefisienserapan( serapanmolar)

A ¿ log I ˳ /¿ I ¿ absorban
k ¿ tetapan perbandingan
I ˳ /I ¿ transmitansi (T)

Persamaan dua dikenal sebagai hukum Lambert – Berr , yang digunakan

sebagai dasar analisa kuantitatif dalam spektrofotometri sinar tampak.
 Dari persamaan tersebut diatas menunjukan bahwa absorbansi berbanding
lurus dengan konsentrasi larutan. Besarnya konsentrasi ini sebanding dengan
konsentrasi larutan sehingga dengan meletakkan besarnya absorbansi sebagai titik
ordinat dengan konsentrasi larutan standar sebagai absis akan diperoleh kurva garis
lurus. Kurva ini disebut dengan kurva kalibrasi ( kurva standar ). Dengan
memasukkan absorbansi larutan cuplikan pada kurva kalibrasi tersebut, maka dapat
ditentukan konsentrasi larutan di dalam cuplikan.

Pada analisis kualitatif, ada tiga metode yang sesuai dan secara umum sering
digunakan pada penentuan unsur di dalam suatu bahan, seperti diuraikan dibawah
ini.

1. Metode Relatif, yaitu dengan mengukur absorbansi atau transmitan dari

larutan blanko, larutan standar dan larutan cuplikan.

Ab−Ao Cb As− Ao
= atau Cs=Cb
As−Ao Cs Ab−Ao

dengan,

Ab = absorbansi larutan baku

Ac = absorbansi larutan blanko

As = absorbansi larutan cuplikan

Cb = konsentrasi larutan baku

Cs = konsentrasi larutan cuplikan

2. Metode kurva kalibrasi, yaitu dengan membuat kurva antara konsentrasi

standar terhadap absorbansi, dengan kurva tersebut berupa garis lurus, kemudian
dengan cara menginterpolasikan dari larutan cuplikan ke dalam kurva standar
tersebut diatas, akan diperoleh konsentrasi larutan cuplikan.
 3. Metode penambahan standar

Untuk kondisi tertentu, metode kalibrasi kurang baik, karen adanya matrik
yang mengganggu pengukuran absorbansi atau transmitannya. Pada metode kurva
penambahan standar ini dibuat sederetan larutan cuplikan dengan konsentrasi yang
sama. Masing- masing larutan ditambah dengan larutan standar dari unsur yang
dilakukan analisis dengan konsentrasi mulai dari 0 sampai konsentrasi tertentu.
Absorbansi masing- masing larutan diukur dan dibuat kurva absorbansi terhadap
konsentrasi unsur standar yang ditambahkan.

Dari ekstrapolasi kurva ke sumbu konsentrasi akan diperoleh intersept pada

sumbu konsentrasi yang merupakan konsentrasi unsur di dalam cuplikan yang
diukur.

Selain dengan cara ekstrapolasi, konsentrasi unsur didalam cuplikan dapat

dihitung dengan persamaan :

Ao
Cs=X
Aadd−Ao

dengan,

Cs = konsentrasi unsur di dalam cuplikan

Ao = absorbansi larutan cuplikan tanpa penambahan larutan standar

Aadd = absorbansi larutan cuplikan dengan penambahan larutan standar

X = konsentrasi unsur standar yang ditambahkan.

Pada spektrofotometer UV-Vis dapat melakukan penentuan terhadap
sampel yang berupa larutan, gas atau uap. Untuk sampel yang berupa larutan perlu
diperhatikan pelarut yang dipakai antara lain :
1. Pelarut yang dipakai tidak mengandung sistem ikatan rangkap terkonjugasi pada
struktur molekulnya yang tidak bewarna

2. Tidak terjadi interaksi dengan molekul senyawa yang dianalisis

3. Kemurniannya harus tinggi atau derajat untuk analisis.

  Bagian-bagian Spektrofotometer UV-Vis

1.       Sumber cahaya

Sumber cahaya pada spektrofotometer harus memiliki pemancaran radiasi yang

stabil dan intensitasnya tinggi. Sumber cayaha pada spektrofotometer UV-Vis ada
dua macam :
a.       Lampu Tungsten (Wolfram)
Lampu ini digunakan untuk mengukur sampel pada daerah tampak. Bentuk
lampu ini mirip dengan bola lampu pijar biasa, memiliki panjang gelombang antara
350-2200 nm. Spektrum radiasinya berupa garis lengkung , Umumnya memiliki
waktu 1000jam pemakaian b.     

b. Lampu Deuterium

Lampu ini dipakai pada panjang gelombang 190-380 nm. Spektrum energy
radiasinya lurus, dan digunakan untuk mengukur sampel yang terletak pada daerah
UV. Memiliki waktu 500 jam pemakaian.

2.      Monokromator

Monokromator adalah alat yang memecah cahaya polikromatis menjadi cahaya

tunggal (monokromatis) dengan komponen panjang gelombang tertentu. Bagian-
bagian monokromator, yaitu:

a.       Prisma
 Prisma mendispersikan radiasi elektromagnetik sebesar mungkin supaya di
dapatkan resolusi yang baik dari radiasi polikromatis.

b.     Grating (kisi difraksi)

Kisi difraksi memberi keuntungan lebih bagi proses spektroskopi. Dispersi

sinar disebarkan merata, dengan pendispersi yang sama, hasil dispersi akan lebih
baik. Selain itu kisi difraksi dapat digunakan dalam seluruh jangkauan spektrum.

c.       Celah optis

Celah ini digunakan untuk mengarahkan sinar monokromatis yang

diharapkan dari sumber radiasi. Apabila celah berada pada posisi yang tepat, maka
radiasi dirotasikan melalui prisma, sehingga diperoleh panjang gelombang yang
diharapkan.

d.      Filter

Berfungsi untuk menyerap warna komplementer sehingga cahaya yang

diteruskan merupakan cahaya berwarna yang sesuai dengan panjang gelombang
yang dipilih.

3.      Kompartemen sampel

Kompartemen ini digunakan sebagai tempat diletakkannya kuvet. kuvet merupakan

wadah yang digunakan untuk menaruh sampel yang akan dianalisis. Pada
spektrofotometer double beam, terdapat dua tempat kuvet. Satu kuvet digunakan
sebagai tempat untuk menaruh sampel, sementara kuvet lain digunakan untuk
menaruh blanko. Sementara pada spektrofotometer single beam, hanya terdapat
satu kuvet.

Kuvet yang baik harus memenuhi beberapa syarat sebagai berikut :

a.       Permukaannya harus sejajar secara optis

b.      Tidak berwarna sehingga semua cahaya dapat di transmisikan

c.       Tidak ikut bereaksi terhadap bahan-bahan kimia

d.      Tidak rapuh

e.       Bentuknya sederhana

Terdapat berbagai jenis dan bentuk kuvet pada spektrofotometer. Umumnya pada
pengukuran di daerah UV, digunakan kuvet yang terbuat dari bahan kuarsa atau
plexiglass. Kuvet kaca tidak dapat mengabsorbsi sinar uv, sehingga tidak
digunakan pada saat pengukuran di daerah UV.  Oleh karena itu, bahan kuvet
dipilih berdasarkan daerah panjang gelombang yang digunakan. Gunanya agar
dapat melewatkan daerah panjang gelombang yang digunakan.

• UV : fused silika, kuarsa

• Visible : gelas biasa, silika atau plastik

• IR : KBr, NaCl, IRTRAN atau kristal dari senyawa ion

Bahan Panjang gelombang

Silika 150-3000
Gelas 375-2000
Plastik 380-800

4.      Detektor

Detektor akan menangkap sinar yang diteruskan oleh larutan. Sinar kemudian
diubah menjadi sinyal listrik oleh amplifier dan dalam rekorder dan ditampilkan
dalam bentuk angka-angka pada reader (komputer).
Terdapat beberapa jenis detector pada spektrofotometer :

Jenis detector λ range (nm) Sifat pengukuran

Penggunaan
Phototube 150 – 1000 arus listrik UV

Photomultiplie 150 – 1000 arus listrik UV/Vis

r

Solid state 350 – 3000

Thermocouple 600 – 20.000 arus listrik IR

Thermistor 600 – 20.000 hambatan listrik IR

Tabel 3 Jenis-jenis detektor berdasarkan panjang gelombang

Syarat-syarat ideal sebuah detector adalah :

-          Mempunyai kepekaan tinggi

-          Respon konstan pada berbagai panjang gelombang

-          Waktu respon cepat dan sinyal minimum tanpa radiasi

-          Sinyal listrik ayng dihasilkan harus sebanding dengan tenaga radiasi

5.      Visual display

Merupakan system baca yang memperagakan besarnya isyarat listrik, menyatakan

dalam bentuk % Transmitan maupun Absorbansi.
HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY

( HPLC )

A. Dasar Teori

Kromatografi adalah metode suatu proses fisik yang digunakan untuk memisahkan
komponen-komponen dari suatu campuran senyawa kimia. Dalam kromatografi,
campuran tersebut dibuat sebagi zona yang sempit (kecil) pada salah satu ujung
media porus seperti adsorben, yang disebut alas atau landasan kromatografi. Zona
campuran kemudian digerakan dengan larutan suatu cairan atau gas yang bergerak
sebagai pembawa, melaui media porus tersebut, yang berupa partikel-partikel yang
”diam“ (tidak bergerak, statisiones). Sehingga akibatnya masing-masing komponen
dari campuran tersebut akan terbagi (terdistribusi) secara tidak merata antara alas
yang “diam” dan cairan atau gas yang membawanya. Akibat selanjutnya, masing-
masing komponen akan bergerak (bermigrasi) pada kecepatan yang berbeda
(differential migration) dan dengan demikian, akan sampai pada ujung lain dari
alas tersebut pada waktu yang berlainan, dan dengan demikian terjadilah
pemisahan diantara komponenkomponen yang ada. (Bahti, Husein H. 2011: 4).

Kromatografi merupakan salah satu metode pemisahan komponenkomponen

campuran yang berdasarkan distribusi diferensial dari komponenkomponen sampel
diantara dua fasa, yaitu fasa gerak dan fasa diam. Salah satu teknik kromatografi
yang dimana fasa gerak dan fasa diamnya menggunakan zat cair adalah HPLC
(High Performance Liquid Chromatography) atau didalam bahasa Indonesia
disebut KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi).
Teknik HPLC merupakan suatu metode kromatografi cair-cair, yang dapat
digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis
kualitatif dengan teknik HPLC didasarkan pada pengukuran luas area standar. Pada
prakteknya, metode pembandingan area standar dan sampel kurang menghasilkan
data yang akurat bila hanya melibatkan suatu konsentrasi standar. Oleh karena itu,
dilakukan dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi. (Wiji, dkk. 2010 : 17).

HPLC yang modern telah mucul akibat pertemuan dari kebutuhan, keinginan
manusia untuk meminimalis pekerjaan, kemampuan teknologi, dan teori untuk
memandu pengembangan pada jalur yang rasional. Jelas sebelum era peralatan
yang modern bahwa LC (Liquid Chromatography) memiliki kekuatan pemisahan
yang sangat ampuh, bahkan untuk komponen-komponen yang berhubungan sangat
erat. LC harus ditingkatkan kecepatannya, diotomasasi, dan harus disesuaikan
dengan sampel-sampel yang lebih kecil, waktu elusi yang beberapa jam
(Underwood, Day. 2002 : 553).

HPLC berbeda dari kromatografi kolom cairan konvensional dalam hal digunakan
bahan pengisi kolom berupa partikel yang sangat kecil berukuran sampai 3-5 μm
(1μm = 10-6 m). Sehingga mengharuskan digunakannya tekanan tinggi sampai
20.000 Kpa ( 200 atmosfir) untuk mengalirkan fasa gerak melalui kolom tersebut.

Ternyata, penggunaan bahan pengisi kolom yang lebih kecil ini bukan saja telah
memperbaiki kecepatan analisis, tapi (dari ini yang lebih penting) ialah telah
menghasilkan suatu teknik dengan daya pisah yang tinggi. HPLC mempunyai
kelemahan- kelemahan yang diantaranya, peralatannya lebih rumit, tidak murah,
dan perlu pengalaman. Untuk beberapa jenis zat, metode ini kurang sensitif. Selain
itu sampel disyaratkan harus stabil dalam larutan.

Berdasarkan kepolaran fasa geraknya, HPLC dibagi menjadi 2 macam yaitu :

a) Fase Normal HPLC

HPLC jenis ini secara esensial sama dengan kromatografi kolom. Meskipun
disebut normal, ini bukan bentuk biasa dari HPLC. Kolom ini diisi dengan partikel
silika yang sangat kecil dan pelarut nonpolar seperti heksan sebuah kolom
sederhana memiliki diameter internal 4,6 mm (dan kemungkinan kurang dari nilai
ini) dengan panjang 120 nm250 nm. Senyawa-senyawa polar dalam campuran
melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding dengan
senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian
akan lebih cepat melewati kolom. Apabila pasangan fasa diam lebih polar daripada
fasa geraknya maka sistem ini disebut HPLC fase normal.

b) Fase Balik HPLC

Pada HPLC jenis ini, ukuran kolomnya sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi
non polar melalui pelekatan hidrokarbon dengna rantai panjang pada
permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Dalam kasus
ini, akan terdapat interaksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam
campuran yang melalui kolom. Interaksi yang terjadi tidak sekuat interaksi antara
rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fasa diam) dan
molekulmolekul polar dalam larutan. Oleh karena itu molekul-molekul polar akan
lebih cepat bergerak melalui kolom. Sedangkan molekulmolekul non polar akan
bergerak lambat karena interaksi dengan gugus hidrokarbon.

Komponen instrumentasi penyusun Kromatografi Cair Kinerja Tinggi : a)

Reservoir Pelarut
Jumlah reservoir pelarut : (1) bisa salah satu atau lebih; berisi pelarut organik
seperti heksana, atau air, atau campuran air dan pelarut organik seperti
metanol,tergantung kepada apakah kita bekerja menggunakan fasa normal atau
fasa terbalik atau metode kromatografilainnya.

Bila sistem KCKT dilengkapi dengan alat pencampuran (2) (atau mempunyai lebih
dari satu pompa) yang memungkinkan membuat campurancampuran pelarut
dengan komposisi yang diatur dengan bantuan suatu programener, maka
diperlukan lebih dari satu reservoir, sistem ini diperlukan untuk melakukan elusi
bergradien dimana komposisi pelarut diubah-ubah selama pengelusian.

Pelarut fasa gerak dipompa dari reservoir oleh sistem pompa, demikian sehingga
campuran pelarut dengan komposisi tertentu dapat mengalir tanpa denyutan
(pulseless). Kecepatan aliran dapat diatur antara 0,1 – 10 mL/menit. Gas yang
terlarut dalam pelarut fasa gerak yang digunakan harus dibuang terlebih dahulu
(de-gassing), selain itu, pelarut harus di saring dahulu agar bebas dari partikel-
partikel kecil yang tidak larut.

Pada saluran-saluran pelarut biasanya dipasang saringan (berukuran 2-10 mμ)

untuk mencegah partikel-partikel kecil yang tidak larut tadi, masuk kedalam
kolom. Saringan ini harus diganti atau dibersihkan bila terjadi penyumbatan.
Diantara jenis-jenis pompa yang paling umum digunakan untuk sistem HPLC
adalah jenis pompa “isap dan tekan ” (reciprocating).

Pompa “isap dan tekan” yang sederhana mempunyai kecepatan isap yang tetap.
Artinya, waktu yang diperlukan untuk langkah mengisis sama dengan waktu untuk
langkah memompa. Pompa seperti ini memerlukan perendam denyutan yang baik.
Oleh karena itu, pompa jenis ini umumnya menggunakan dua pengisap yang
masing-masing bekerja kebalikan satu dari yang lainnya. Setiap pengisap
memppunyai dua katup pengendali.

Pelarut diisap ke dalam ruang pengisap melalui katup pemasukkan dan kemudian
ditekan ke luar melalui katup pengeluaran. Untuk melakukan elusi bergradien
diperlukan dua sistem pompa yang masing-masing mempunyai satu atau dua
penghisap. Ada dua macam rancangan utama pompa gradien yaitu pecampuran
tekana tinggi yang mempunyai hantaran dua pompa dan pencampuran tekana
rendah dengan hantaran satu pompa.

Rancangan pompa gradien yang pertama, yakni sistem pencampuran tekanan

tinggi, mempunyai dua pompa dan satu pengendali, masing-masing pompa
menghantarkan satu sistem pelarut. Fungsi pengendali adalah mengatur kecepatan
aliran masing-masing pelarut sesuai dengan komposisi yang diinginkan dan juga
berfungsi untuk menjamin terjadinya pengadukan yang baik oleh suatu pengaduk
dinamik. Setiap pompa mempunyai dua penghisap dan setiap penghisap
mempunyai dua katup. Jenis yang kedua, pompa pembagi bertekanan rendah hanya
mempunyai satu penghisap. Untuk melakukan elusi gradien hanya diperlukan satu
pompa. Pompa ini mempunyai katup pembagi, tidak mempunyai pengendali
gradien.

Dengan katup-katup pembagi dimungkinkan untuk membuat suatu campuran

terner (tiga jenis pelarut) dengan perbandingan yang diinginkan. Jadi untuk
melakukan gradien gradien tidak diperlukan lebih dari satu pompa. Katupkatup
pembagi ini dikendalikan oleh suatu microprocessor dan terbuka selama langkah
pemasukan pelarut. (Bahti, Husein. H . 2011 : 34-40)

b) Kolom
Kolom HPLC biasanya terbuat dari stailess steel, akan tetapi ada juga yang terbuat
dari gelas berdinding tebal. Kolom utama berisi fasa diam, tepat terjadinya
pemisahan campuran menjadi komponen-komponen. Bergantung keperluannya
kolom utama dapat digunakan untuk analisis atau preparatif setiap komponen yang
keluar kolom ditampung pada tabung yang berbeda dan keluaran HPLC
dihubungkan dengan fraction colector selain kolom utama dikenal pula kolom
pengaman.

Kolom utama berisi fasa dian dan jenisnya bervariasi bergantung pada keperluan,
misalnya dikenal kolom C8, C-18, cyanopropyl, dan penukar ion. Kolom utama
untuk HPLC biasanya berukuran panjang berkisar antara 5-30 cm dan diameter
dalam berkisar 4,5–10 mm.

Kolom pengaman (guard coloumn) disebut juga pra-kolom karena letaknya

sebelum sistem pemasukan cuplikan. Kolom ini berukuran pendek 5 cm dengan
diameter 4,6 mm biasanya dipaking dengan partikel silika berukuran besar dari
ukuran partikel kolom utama. Kolom pengaman mempunyai dua fungsi yaitu:
menyaring kotoran yang terbawa oleh fasa gerak dan untuk menjenuhkan fasa
gerak dalam rangka menghindarkan terjadinya erosi fasa diam oleh aliran pelarut.

Kolom merupakan jantung kromatograf, keberhasilan atau kegagalan analisis

bergantung pada pilhan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Kolom dapat dibagi
menjadi dua kelompok :

- Kolom analitik

Garis tengah dalam 2-6 mm, panjang bergantung pada jenis kemasan, untuk
kemasan pelikel biasanya panjang kolom 50-100 cm, untuk kemasan mikropartikel
berpori biasanya 10-30 cm.

- Kolom preparative
Umumnya bergaris tengah 6 mm atau lebih besar, dan panjang 25-100 cm.

c) Pompa

Pada HPLC, pompa ini berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom
yang berisi serbuk halus. Digunakan pompa bertekanan tinggi dalam metode ini
sebagai akibat penggunaan fasa gerak yang berupa zat cair yang akan sukar
mengalir dalam kolom yang dipadatkan dengan serbuk halus. Oleh karena itu, agar
zat cair dapat melewati kolom secara tepat maka dibutuhkan bantuan pompa yang
bertekana tinggi. Pompa yang digunakan dalam HPLC harus memenuhi
persyaratan sebagai berikut :

 Menghasilkan tekanan sampai 5000 psi

 Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menit

 Bahan tahan korosi

 Keluaran bebas pulse

d) Injector Sample

Sampel-sampel cair dan larutan disuntikan secara langsung ke dalam fase gerak
yang mengalir dibawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang
terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk
sampel (sample loop) internal atau eksternal.

Salah satu jenis penyuntik untuk memasukan sampel ke dalam sistem (kolom)
kromatografi adalah penyuntik loop. Dalam prakteknya, loop tidak perlu diisi
penuh, tapi bila tidak diisi penuh akan mengakibatkan lebih jeleknya presisi hasil
eksperimen dan ketergantungan presisi tersebut kepada bagaimana sioperator
menggunakan penyuntik.

Perlu diingat, bahwa penyuntik tidak boleh dicabut sebelum pegangan

(handle) penyuntik diputar dari posisi load (“pengisap”) ke posisi inject (“suntik”).
Karena sampel akan mengalir ke saluran pembuangan. Hal yang terakhir ini
tentunya tidak diinginkan, pegangan penyuntik harus diputar cepat agar pemutusan
aliran ke dalam diinginkan. Pegangan penyuntik harus diputar cepat agar
pemutusan aliran ke dalam kolom, antara posisi pengisian (load) dan posisi
penyuntikan (inject) berlangsung cepat.

Yang menjadi faktor ketidak tepatan pengukuran HPLC salah satunya terletak pada
keterulangan pemasukan cuplikan kedalam paking kolom. Masalahnya kebanyakan
memasukan cuplikan kedalam kolom dapat menyebabkan band broadening. Oleh
karen itu cuplikan yang dimasukkan harus sekecil beberapa puluh mikroliter.
Beberapa teknik pemasukan cuplikan kedalam sistem dapat diuraikan sebagai
berikut :

 Injeksi Syringe

Syringe disuntikan melalui septum (seal karet) dan untuk ini dirancang syringe
yang tahan tekanan sampai 1500 psi. Akan tetapi keterulangan injeksi stringe ini
sedikit lebih baik dari 2-3 % dan sering lebih jelek.

 Injeksi Stop Flow

Aliran pelarut dihentikan sementara, sambungan pada ujung kolom dibuka dan
cuplikan disuntikan langsung kedalam ujung kolom. Setelah menyambung kembali
kolom maka pelarut dialirkan kembali. Untuk memasukkan cuplikan kedalam fasa
gerak perlu dua langkah : sejumlah volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop
dan posisi „load‟. Cuplikan masih berada dalam loop ; kran diputar untuk
mengubah posisi „load‟ menjadi posisi „injeksi‟ dan fasa gerak membawa
cuplikan kedalam kolom (kran cuplikan)

 Kran Cuplikan

Jenis pemasukan cuplikan ini disebut juga loop dan paling banyak digunakan.
Untuk memasukan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak perlu 2 langkah, yaitu:
sejumlah volume cuplikan disuntikan ke dalam loop dalam posisi load, cuplikan
masih berada dalam loop; kran diputar untuk mengubah posisi load menjadi posisi
injeksi dan fasa gerak membawa cuplikan ke dalam kolom.

e) Detektor

Ada dua jenis detektor yaitu detektor selektif, adalah detektor yang peka terhadap
golongan senyawa tertentu saja. Dan detektor universal, yaitu detektor yang peka
terhadap golongan senyawa apapun kecuali pelarutnya.

Diantara detektor yang digunakan dalam KCKT adalah :

Detektor Ultra Violet – Visible (Sinar Tampak)

Detektor UV terutama digunakan untuk pendeteksian senyawasenyawa organik.

Detektor UV dilengkapi dengan pengatur panjang gelombang, sehingga panjang
gelombang UV yang digunakan dapat dipilih sesuai dengan jenis cuplikan yang
diukur.

Detektor UV-Visible (uv-sinar tampak) paling banyak digunakan, karena

sensitivitasnya yang baik mudah menggunakannya, tidak merusak senyawa yang di
analisis, dan memungkinkan untuk melakukan elusi bergradien. Ada yang dipasang
pada panjang gelombang tetap yaitu pada panjang gelombang 254 nm, dan ada
yang panjang gelombangnya dapat dipilih sesuai dengan diinginkan antara 190-600
nm. Detektor dengan panjang gelombang variabel ini ada yang dilengkapi alat
untuk memilih panjang gelombang secara otomatis dan dapat me-nol-kan sendiri
(allto zero). Detektor jenis ini juga ada yang menggunakan drode erray (sebagai
pengganti photo tube), sehingga dapat melakukan pembacaan absorban yang
kontinyu pada berbagai panjang gelombang.

Detektor Indeks Bias

Detektor indeks bias memberi respons terhadap senyawa yang dianalisis apapun,
termasuk pelarutnya sendiri. Prinsip dasar kerja detektor ini adalah perubahan
indeks bias karena adanya komponen sampel dalam pelarut. Detektor ini bersifat
tidak merusak (non-destruktif), sensitivitasnya cukup tinggi (minimum 10-6 g) dan
umumnya digunakan dalam pekerjaan preparatif. Dengan detektor ini tidak dapat
dilakukan elusi bergradien. Detektor ini digunakan dalam kromatografi eklusi dan
dalam analisis karbohidrat.

Beberapa hal yang harus diperhatikan dalam menggunakan detektor indeks bias :

1. Bila digunakan lebih dari satu pelarut, maka campuran dahulu hingga
homogen dan bebaskan dari gas terlarutnya.

2. Setelah detektor dihidupkan, tunggu beberapa lama sebelum digunakan

sampai detektor stabil.

3. Bila digunakan lebih dari satu detektor yang dipasang berurutan, maka
tempatkanlah detektor indeks bias pada urutan terakhir.

4. Untuk saluran pembuangan, gunakanlah selang teflon berdiameter dalam

(inner diameter) yang besar tapi pendek.

5. Tempatkan detektor pada kondisi suhu yang dipelihara tetap.

6. Jaga agar sel indeks bias selalu bersih.

6. Rekorder

Rekorder adalah alat untuk mencetak hasil percobaan pada lembar berupa
kumpulan puncak (kromatogram) kromatogram HPLC yang didapat berguna untuk
analisis kualitatif dan kuantitatif. Luas peak menyatakan konsentrasi komponen
dalam campuran dan jumlah peak menyatakan jumlah komponen. Analisis
kualitatif dapat dilakukan dengan cara membandingkan waktu retensi (rt) analit
atau sampel dengan waktu retensi standar. Sedangkan analisis kuantitatif depat
dilakukan dengan didasarkan pada luas peak atau tinggi peak dengan metode
standar kalibrasi.

Prinsip kerja instumentasi HPLC

HPLC menggunakan fasa gerak untuk memisahkan komponen dari sebuah

campuran komponen (analit). Prinsip keja HPLC adalah pemisahan setiaap
komponen dalam sampel berdasarkan kepolarannya. Yang paling membedakan
HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi
untuk mendorong fasa gerak. Fasa diam yang biasa digunakan (pada kolom) HPLC
jenis fasa terbalik adalah RMe2SiCl, dimana R adalah rantai alkana C-18 atau C8.
Sementara fasa geraknya berupa larutan yang diatur komposisinya (gradien elusi),
misalnya : air:asetonitril (80:20), hal ini bergantung pada kepolaran analit yang
akan dipisahkan. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan
waktu retensinya akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang punsak-
puncaknya terpisah.

Prinsip dasar HPLC adalah pemisahan komponen-komponen terjadi karena

perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Keunggulan
menggunakan HPLC dibandingkan kromatografi gas yaitu terletak pada
kemampuannya untuk menganalisis cuplikan yang tidak menguap dan labil pada
suhu tinggi. HPLC tidak terbatas pada senyawa organik tapi mampu menganalisis
senyawa anorganik, mampu menganalisis cuplikan yang mempunyai molekul
tinggi (beratnya), mampu menganalisis cuplik yang mempunyai titik didih yang
sangat tinggi seperti polimer.

Cara kerja instumentasi HPLC

Prinsip kerja alat HPLC adalah pertama fasa gerak dialirkan melalui kolom
kedetektor dengan bantuan pompa. Kemudian cuplikan dimasukan ke dalam aliran
fasa gerak dengan cara penyuntikan. Didalam kolom terjadi pemisahan komponen-
komponen campuran karena perbedan kekuatan interaksi antara solut-solut
terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam
akan keluar dari kolom terlebih dahulu. Sebaliknya solut-solut yang interaksinya
kuat dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih lama. Setiap komponen yang
campuran yang keluar kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam
bentuk kromatogram.

Gambar Skema Instrumentasi HPLC

Keuntungan KCKT/HPLC

KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi Gas (KG). Dalam banyak
hal kedua teknik ini dapat digunakan untuk memperoleh efek pemisahan yang
sama membaiknya. Bila derivatisasi diperlukan pada KG, namun pada KCKT zat-
zat yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis. Untuk zat-zat yang labil pada
pemanasan atau tidak menguap, KCKT adalah pilihan utama. Namun demikian
bukan berarti KCKT menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan yang
lebih besar bagi para analis laboratorium. Derivatisasi juga menjadi populer pada
KCKT karena teknik ini dapat digunakan untuk menambah sensitivitas detektor
UV Visibel yang umumnya digunakan.

KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan kromatografi cair

klasik, antara lain:

Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari1 jam. Banyak analisis yang dapat
diselesaikan sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit (uncomplicated),
waktu analisis kurang dari 5 menit bisa dicapai

Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana
interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi
dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam.

Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan fasa diam dan fasa gerak
pada KCKT memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang
diinginkan.

Sensitivitas detektor: Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT

dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam-
macam zat. Detektor-detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi
jumlah sampai picogram(10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer
Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll dapat juga digunakan dalam KCKT

Kolom yang dapat digunakan kembali: Berbeda dengan kolom kromatografi

klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang
bisa dilakukan dengan kolom yang sma sebelum darijenis sampel yang diinjeksi,
kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan Ideal untuk zat bermolekul
besar dan berionik :zat – zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG karena
volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisi spsesies ionik.
KCKT dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat –zat
tersebut.

Mudah rekoveri sampel: Umumnya setektor yang digunakan dalam KCKT tidak
menyebabkan destruktif(kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh
karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah
melewati detector.Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali
untuk kromatografi penukarion memerlukan prosedur khusus.

(Effendy De Lux Putra, 2004: 8)