PERTEMUAN I

PENGENALAN ALAT DAN STERILISASI

BAHAN/PERALATAN

I. Nama Alat Beserta Fungsinya

Tabel 1.
Nama- Nama Alat Yang Digunakan Selama Praktek Mikrobiologi Pangan
Beserta Gambar dan Fungsinya

N Nama Alat Gambar Fungsi

o
1. Autoklaf Untuk proses
sterilisasi basah,
dengan menggunakan
tekanan 1 atm dan suhu
121 oC.
2. Mikroskop Untuk melihat benda-
benda yang ukurannya
kecil atau mikro.

3. Oven Untuk proses

sterilisasi kering.

4. Inkubator Untuk membiakkan

mikroba.

PENUNTUN MIKROBIOLOGI PANGAN TA.2020/2021

1
5. Petridish Tempat
mengembangbiakkan
mikroba.

6. Gelas Tempat meletakkan

Objek/Kaca objek atau sampel.
Preparat

7. Jarum Ose Untuk mengambil dan

memindahkan mikroba
yang ada pada sampel.

8. Lampu Untuk meminimalkan

Spritus terjadinya kontaminasi
melalui udara selama
proses pembiakan.

9. Jarum Untuk mengikolasi

Enten jamur.

10. Jarum untuk mengambil

Inkolasi biakan murni atau
membiakkan secara
tusukan.

11. Tabung untuk mengetahui

Durham adanya pembentukan
gas selama fermentasi
di dalam tabung reaksi.

12. Tabung Untuk tempat media

Pengencer/ atau wadah
Reaksi pengembangbiakan
mikroba.

PENUNTUN MIKROBIOLOGI PANGAN 2020/2021 Page 2

II. Cara Atau Prosedur Kerja.

1.Autoklaf

Cara atau prosedur pemakaian autoklaf:

a. Tuangkan air suling secukupnya ke dalam autoklaf dan kemudian

tatalah labu atau tabung – tabung berisi medium ke dalam wadah

aluminium.

b. Tutup autoklaf dan kencangkan mornya dengan serentak setiap 2

mor yang letaknya berlawanan.

c. Sambungkan ke listrik, kemudian tekan tombol power yang

berwarna hijau, atur pengatur suhu sampai 10 (sepuluh).

d. Pastikan pengatur uap berada dalam kondisi terbuka. Tunggu

sampai ada uap air yang keluar pada pengatur uap tersebut.

Kemudian tutup pengatur uap.

e. Pada saat jarum tekanan menunjukkan 1,7 bar, lalu cabut

colokkan dan matikan dan kembalikan pengatur suhu kembali ke

angka 0 (nol). Selanjutnya, tutup pengatur uap, kemudian buka

klepnya.

f. Agar tidak terkena uap yang masih tersisa segeralah menjauh

setelah membuka penutupnya dan tunggu sampai semua uap telah

keluar sebelum mengeluarkan barang-barang yang ada di

dalamnya.

g. Selanjutnya buka tutup autoklaf dengan mor yang berlawanan

lepaskan baut-bautnya, putar tutupnya dan angkatlah, medium

dan alat sudah steril dengan cara mempertahankan pada

tekanan 1 atm selama 15-20 menit.

PENUNTUN MIKROBIOLOGI PANGAN 2020/2021 Page 3

 2. Mikroskop

Cara atau prosedur kerja mikroskop :

a. Tarik tabung okuler ± 2 cm (naik).

b. Letakkan lensa obyektif 10 : 1 pada kedudukan sporis dengan

lensa okuler.

c. Letakkan kaca preparat.

d. Naikkan kondensor tinggi dan buku diafragma seluruhnya.

e. Lihat kaca preparat dari samping dan tetapkan cermin datar

sehingga preparat tadi disinari dengan terang.

f. Turunkan lensa obyektif 10 x kaca preparat ± ½ cm di atas

preparat.

g. Putar tubus dengan perlahan-lahan dengan menggunkaan sekrup

penggerak kasar hingga terlihat bayangan.

h. Putar sekrup penggerak halus naik turun hingga di dapat

bayangan yang baik.

3. Oven

Cara atau prosedur kerja oven:

a. Push dan Atur waktu yang dibutuhkan.

b. Atur suhu.

c. Masukkan alat-alat gelas.

d. Suhu ± 160 oC- 175 oC dengan suhu ± 2 jam.

4. Inkubator

Cara atau prosedur kerja inkubator:

a. Push.

b. Atur waktu yang dibutuhkan.

PENUNTUN MIKROBIOLOGI PANGAN 2020/2021 Page 4

 c. Atur suhu.

d. Masukkan medium.

e. Suhu ± 24 oC- 37 oC dengan suhu ± 24 jam.

III. Nama Bagian-bagian Dari Autolaf dan Mikrosop

a. Autoklaf

Bagian dari Autoklaf :

1. Tombol pengatur waktu mundur (timer).

2. Katup pengeluaran uap.
3. Pengukur tekanan.
4. Klep pengaman.
5. Tombol on-off
6. Ermometer
7. Lempeng sumber panas.
8. Aquades (H2O)
9. Sekrup Pengaman
10. Batas penambah air.

PENUNTUN MIKROBIOLOGI PANGAN 2020/2021 Page 5

 b. Mikroskop

 Lensa Okuler, yaitu lensa yang dekat dengan mata pengamat

lensa ini berfungsi untuk membentuk bayangan maya, tegak, dan

diperbesar dari lensa objektif.

 Lensa Objektif, lensa ini berada dekat pada objek yang di

amati, lensa ini  membentuk bayangan nyata, terbalik, di

perbesar. Di mana lensa ini di atur oleh revolver untuk

menentukan perbesaran lensa objektif.

 Tabung Mikroskop (Tubus), tabung ini berfungsi untuk

mengatur fokus dan menghubungan lensa objektif dengan lensa

okuler.

 Makrometer (Pemutar Kasar), makrometer berfungsi untuk

menaik turunkan tabung mikroskop secara cepat.

 Mikrometer (Pemutar Halus), pengatur ini berfungsi untuk

menaikkan dan menurunkan mikroskop secara lambat, dan

bentuknya lebih kecil daripada makrometer.

PENUNTUN MIKROBIOLOGI PANGAN 2020/2021 Page 6

  Revolver, revolver berfungsi untuk mengatur perbesaran lensa

objektif dengan cara memutarnya.

 Reflektor, terdiri dari dua jenis cermin yaitu cermin datar dan

cermin cekung. Reflektor ini berfungsi untuk memantulkan

cahaya dari cermin ke meja objek melalui lubang yang terdapat

di meja objek dan menuju mata pengamat. Cermin datar

digunakan ketika cahaya yang di butuhkan terpenuhi, sedangkan

jika kurang cahaya maka menggunakan cermin cekung karena

berfungsi untuk mengumpulkan cahaya.

 Diafragma, berfungsi untuk mengatur banyak sedikitnya cahaya

yang masuk.

 Kondensor, kondensor berfungsi untuk mengumpulkan cahaya

yang masuk, alat ini dapat putar dan di naik turunkan.

 Meja Mikroskop, berfungsi sebagai tempat meletakkan objek

yang akan di amati.

 Penjepit Kaca, penjepit ini berfungsi untuk menjepit kaca yang

melapisi objek agar tidak mudah bergeser.

 Lengan Mikroskop, berfungsi sebagai pegangang pada

mikroskop.

 Kaki Mikroskop, berfungsi untuk menyangga atau menopang

mikroskop.

 Sendi Inklinasi (Pengatur sudut), untuk mengatur sudut atau

tegaknya mikroskop.

PENUNTUN MIKROBIOLOGI PANGAN 2020/2021 Page 7

4.STERILISASI

Adalah suatu proses untuk mematikan semua mikro organisme

yang terdapat di dalam suatu benda.

Sterilisasi dapat dilakukan :

1. Penggunaan panas

Banyak digunakan untuk mikrobiologi.

2. Penggunaan bahan kimia

Menggunakan gas misalnya : setilen oksida, formal dehid,

menggunakan radiasi misalnya : sinar alfa dan dilakukan pada

suhu kamar 2-18 jam, misalnya untuk bahan-bahan dari plastik.

3. Penyaringan (filtrasi pada suhu kamar digunakan untuk serum

enzim, antibiotika, dll).

a. Sterilisasi panas basah : bila panas digunakan bersama-sama

dengan uap air dan biasanya dilakukan di dalam autoklaf pada

suhu 1210C, tekanan 1 atm selang 15 menit.

b. Sterilisasi panas kering : kurang efisien dan membutuhkan

suhu lebih tinggi serta waktu lebih lama.

- Bahan- bahan yang biasa disterilkan adalah pipet, tabung reaksi,

cawan Petri, botol.

- Bahan-bahan yang disterilkan harus dilindungi dengan cara

membungkus, menyumbat, dan menaruhnya dalam wadah

tertutup untuk mencegah kontaminasi setelah dikeluarkan dari

oven. Suhu dan waktu yang seringkali digunakan untuk sterilisasi

panas kering yaitu pada suhu 1650C selama 2 jam.

PENUNTUN MIKROBIOLOGI PANGAN 2020/2021 Page 8

 4.
PERTEMUAN II

MORFOLOGI BAKTERI (PEWARNAAN GRAM)

Mengamati bentuk dan ciri-ciri mikroba dengan mikroskop dapat

dilakukan dengan dua cara (1) mengamati sel-sel hidup tanpa diwarnai,

yaitu dengan membuat preparat basah ( pertemuan II). Dan (2).

Mengamati mikroba yg sudah mati dengan diwarnai. Kebanyakan sel

bakteri tidak berwarna. Terdapat beberapa zat pewarna yang

digunakan untuk melihat bakteri dan struktur dalam selnya.

Pewarnaan yang dilakukan untuk mewarnai bakteri merupakan

modifikasi atau gabungan dari cara pewarnaan sederhana

Tujuan Pewarnaan ;

Untuk melihat bentuk dan sifat bakteri yang diamati. Pewarnaan

dapat mengikat warna pada dinding sel. Jika kristal violet yang terikat

akan terlihat bakteri gram positif (+), jika safranin yang terikat yang

terlihat bakteri gram negative (-).

PENUNTUN MIKROBIOLOGI PANGAN 2020/2021 Page 9

Pewarnaan ada 2 :

1. Pewarnaan sederhana

Hanya menggunakan 1 macam warna saja seperti kristal violet atau

methylen blue atau fuchsin basa

2.Pewarnaan differensial

Menggunakan pewarnaan yang lebih kompleks, yaitu :

a. kristal violet c. Alkohol 70%

b. lugol /Iodium d. Safranin

Reagen :

1. Aquades steril, Safranin, Kristal Violet (0,02 gr dalam 100 ml

aquades,) Lugol, Alkohol 70 %.

Bahan :

2. Makanan y6ang mengandung bakteri : ikan, Daging, lepat, Lempar,

yogur, roti.

Alat : Jarum ose dan Kaca preparat

Prosedur :

I. Pewarnaan sederhana.

1. Bersihkan kaca preparat dengan alcohol sampai

lemaknya hilang. Dan keringkan di atas lampu spiritus.

2. Ambil bahan makanan dengan jarum ose yang sebelumnya

sudah di panaskan di atas spiritus. Letakkan pada kaca

preparat steril.

3.Tambahkan aquades steril dan homogenkan.

4.Fiksasi dengan melakukan di atas api.

5. Tambahkan kristal violet atau genta violet, biarkan 1 menit

PENUNTUN MIKROBIOLOGI PANGAN 2020/2021 Page 10

 dan kemudian cuci di air yang mengalir.

6.Keringkan dan diamati dibawah mikroskop.

II. Pewarnaan Diferensial

1. Bersihkan kaca preparat dengan alcohol sampai lemaknya hilang.

Dan keringkan di atas lampu spiritus.

2. Ambil bahan makanan dengan jarum ose yang sebelumnya sudah

di panaskan di atas spiritus. Letakkan pada kaca preparat steril.

3. Tambahkan aquades steril dan homogenkan.

4. Fiksasi dengan melakukan di atas api.

5. Tambahkan kristal violet atau genta violet, biarkan 1 menit dan

kemudian cuci di air yang mengalir.

6. Tambahkan lugol, biarkan 1 menit dan kemudian cuci di air yang

mengalir.

7. Tambahkan alcohol 70%, biarkan 10 detik dan kemudian cuci di

air yang mengalir

8. Tambahkan safranin, biarkan 30 detik dan kemudian cuci di air

yang mengalir.

9. Kemudian keringkan dengan kertas saring.

10. Lakukan pengamatan di bawah mikroskop. Jika pengamatan:

Ungu /biru gram positif (+) (bentuk bulat/batang)

Merah/pink gram negative (-) (bentuk susunan).

PENUNTUN MIKROBIOLOGI PANGAN 2020/2021 Page 11

Pertanyaan :

Jelaskan perbedaan bakteri gram positif dan gram negatif dalam hal :.

1.Komposisi dinding selnya.

2.Sifat dinding sel tersebut terhadap reaksi pewarnaan Gram.

PENUNTUN MIKROBIOLOGI PANGAN 2020/2021 Page 12

 PERTEMUAN III

MORFOLOGI KAPANG DAN KHAMIR

Kapang dan khamir dapat menyebabkan kerusakan pada

berbagai makanan pada kondisi dimana bakteri dan khamir dihambat

pertumbuhannya. Misalnya kapang pada kondisi Aw yang rendah, Pada

Ph rendah atau suhu rendah. Sebaliknya pada jenis makanan tertentu

kapang digunakan untuk industry makanan sebagai hasil dari

fermentasi. Seperti tempe, tauco , roti dan lain-lain.

Khamir digunakan dalam industri Misalnya : Produksi protein sel

tunggal, alkohol dan lain-lain. Sifat khamir menentukan jenis-jenis

makanan yang ditumbuhinya, tapi tidak dapat ditumbuhi oleh kapang

dan bakteri

Tujuan :

Mahasiswa mengetahui morfologikapang dan khamir.

Reagen

1. Gliserol 10 %, 4. Laktofenol

2. Aquades steril, 5. Methylen Blue

3. ; Alkohol 70 %

PENUNTUN MIKROBIOLOGI PANGAN 2020/2021 Page 13

 Bahan :

1. Makanan yang mengandung kapang : kecap, tauco,roti, tempe.

2. Makanan yang mengandung khamir : selai, madu, tapai singkong,

sari buah.

Alat :

1. Kaca preparat 3. Spiritus

2. Jarum ose 4. Mikroskop

Prosedur (Pembuatan preparat basah) Khamir dan Bakteri :

1. Bersihkan kaca preparat dengan alcohol sampai lemaknya hilang.

2. Keringkan di atas lampu spiritus.

3. Ambil/letakkan Jika bahannya padat ambil 1 tetes aquades

steril, kemudian 1 mata ose bahan , homogenkan. Tutup dengan

gelas penutup (cover glass), Jika bahannya cair tidak perlu

ditambahkan aquades.

4. Hindari adanya gelembung udara antara gelas objek dan gelas

penutup

5. Letakkan dan amati preparat basah ini di bawah kaca mikroskop.

6. Laporkan bentuk dan ukuran bakteri, serta pengelompokannya

(misalnya tunggal . berpasangan dll)

7. Laporkan juga bentuk khamir, misalnya ovoidal, silindrikal dll.

Jika pengamatan dgn preparat basah khamir sukar untuk dilihat

Maka :

1.Bersihkan kaca preparat dengan alcohol sampai lemaknya hilang.

Dan keringkan di atas lampu spiritus.

PENUNTUN MIKROBIOLOGI PANGAN 2020/2021 Page 14

 2. Ambil Bahan letakkan pada kaca objek, biarkan mengering,

kemudian difiksasi di atas api perlahan-lahan

3. Teteskan biru methylen biarkan mengering 2 menit

4. Cuci dengan air mengalir, kemudian serap dengan kertas saring.

5. Amati dibawah mikroskop.

Prosedur Pemeriksaan Kapang:

1. Bersihkan kaca preparat dengan alcohol sampai lemaknya hilang.

2. Keringkan di atas lampu spiritus.

3. Ambil 1 tetes gliserol /laktofenol dgn jarum yg lebih tebal dari

jarum ose.

4. Ambil pertumbuhan kapang dgn hari-hati agar dapat dilihat

sampai miceliumnya. Tutup dengan gelas objek.

5. Amati dibawah mikroskop dan Gambarkan bentuk micelium

(septat, nonseptat, bentuk cabang), bentuk spora aseksual

(konidia,sporangiospora,arthrospora) serta besar wan warnya.,

Pertanyaan :

PENUNTUN MIKROBIOLOGI PANGAN 2020/2021 Page 15

1. Sebutkan 5 (lima ) contoh kapang yang digunakan dalam fermentasi
makanan.
2. Sebutkan 3 (tiga) contoh kapang yang sering tumbuh pada makanan
dan memproduksi mikotoksin.
3. Sebutkan 3 (tiga) macam makanan/minuman yang difermentasi
menggunakan khamir. Sebutkan jenis khamir yang digunakan.

PERTEMUAN IV

PENUNTUN MIKROBIOLOGI PANGAN 2020/2021 Page 16

 PEMBUATAN MEDIA DAN ISOLASI MIKROBA

A. PEMBUATAN MEDIA
Pupukan yang digunakan untuk menumbuhkan mikroba di

laboratorium disebut medium (tunggal) atau media (jamak).

Medium dibedakan atas 3 macam yaitu :

1. Medium cair yang dapat digunakan untuk berbagai tujuan

termasuk menumbuhkan atau membiakkan mikroba, fermentasi,

dan uji-uji lainnya, misalnya Nutrient Broth, Glucosa Broth dan

sebagainya.

2. Medium Padat, misalnya Nutrient Agar, Plate Count Agar, atau

Potato Dextrose Agar, yang dapat digunakan untuk

menumbuhkan mikroba pada permukaannya sehingga membentuk

koloni yang dapat dilihat, dihitung, atau diisolasi.

3. Medium setengah padat (semi solid) yang mempunyai konsistensi

di antara medium cair dan medium padat.

Tujuan :

1. Mahasiswa dapat mengetahui tentang medium.

2. Mahasiswa dapat mengetahui tentang cara pembuatan medium.

3. Mahasiswa dapat mengetahui tentang cara penyimpanan medium.

Reagen/Bahan :

PENUNTUN MIKROBIOLOGI PANGAN 2020/2021 Page 17

 1. NA/PDA/PCA

2. Aquades

Prosedur :

1. Ambillah medium Nutrient Agar (NA), baca petunjuknya baik-

baik. Hitunglah jumlah yang sesuai untuk volume yang anda

butuhkan. Ambil medium NA dengan spatula atau sendok yang

disediakan dan timbanglah sebanyak 10 gr dengan neraca

analitik.

2. Tambahkan medium dengan air suling sebanyak 500 dalam gelas

kimia 800 ml.

3. Didihkan beberapa menit agar medium larut dan terus diaduk

dengan batang pengaduk dari kaca.

4. Penyiapan medium seperti NA biasanya tidak perlu dilakukan

penyesuaian PH.

5. Masukkan ke dalam tabung reaksi 1/2-3/4, kemudian tabung

ditutup atau disumbat dengan kapas.

6. sterilkan medium tersebut dalam autoklaf pada suhu 121 0C

dengan tekanan 1 atm selama 15 menit.

7. Tuangkan medium secara merata ke dalam cawan Petri steril

secara aseptic. Penuangan agar dengan suhu yang terlalu tinggi

akan menyebabkan kondensasi yang berlebihan.

8. Biarkan medium menjadi padat dan dingin dan tulis pada

permukaan luar cawan/tabung, tanggal dan nama medium.

9. Bungkus cawan Petri dengan kertas dan tabung dalam keranjang

serta simpan dalam lemari es.

B.ISOLASI MIKROBA

PENUNTUN MIKROBIOLOGI PANGAN 2020/2021 Page 18

Tujuan : Mahasiswa mengetahui tentang isolasi dan cara

melakukan isolasi mikroba.

Reagen/Bahan :

1. Alkohol

2. Pepton water/NaCL fisiologis (0,85%)

3. Sarden , Udang, susu

Alat :

Cawan petri, pipet, penangas air. tabung reaksi, bunsen.

Prosedur :

1. Siapkan tempat steril dan alat-alat yang sudah disterilkan.

2. Encerkan 5 ml atau 5 gr sample (hancurkan),

3. Campurkan ke dalam 45 ml peptone water/NaCl Fisiologis steril,

kemudian homogenkan dengan memutar atau diguncang sebanyak

25 x. Sehingga di dapat pengenceran 1 : 10 atau 10 -1

(pengenceran 10-1).

4. Isi 4 buah tabung reaksi dengan 9 ml NaCl fisiologis steril, beri

nama masing-masing tabung dengan 10-2, 10-3, 10-4,dan 10-5.

5. Ambil 1 ml dari pengenceran 1, lalu ditambahkan ke tabung reaksi

yang telah berisi 9 ml NaCl fisiologis steril (pengenceran 10 -2),

kemudian di mix . Lakukan hal yang sama sampai pengenceran

10-5 secara aseptic.

PENUNTUN MIKROBIOLOGI PANGAN 2020/2021 Page 19

 PERTEMUAN V DAN VI

ANALISIS KUANTITATIF MIKROBIOLOGI

PADA BAHAN PANGAN
(METODE HITUNGAN CAWAN & MPN)

A.Metode Hitungan Cawan :

Jika sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada

medium agar, maka sel mikroba tersebut akan berkembang biak

dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata

tampa menggunakan mikroskop. Metode hitungan cawan

merupakan metode yang paling sensitive untuk menghitung

jumlah mikroba.

Metode Hitungan Cawan dapat dibedakan dalam 2 cara :

1. Metode tuang.

Contoh/SAMPEL yang sudah diencerkan DALAM PROSES

ISOLASI dimasukkan ke dalam cawan petri, kemudian

ditambahkan agar cair steril yang telah didinginkan (47-50 oC)

sebanyak 15-20 ml dan digoyangkan supaya menyebar dan

merata.

2. Metode permukaan.

PENUNTUN MIKROBIOLOGI PANGAN 2020/2021 Page 20

 Cara yang dilakukan pada metode ini adalah terlebih

dahulu dibuat medium padat pada cawan petri. Kemudian 0,1 ml

contoh yang telah diencerkan (diisolasi) dipipet pada permukaan

agar tersebut, dan diratakan dengan batang gelas yang

melengkung yang steril.

Metode hitungan cawan

Bahan : NA dan Aquades.

Sampel : Susu bubuk fisian flag.

Alat : Cawan Petri dan pipet.

Prosedur :

Metode Hitungan Cawan

Awal dari kegiatan hitung cawan dimulai dengan kegiatan isolasi

1. Sampel diencerkan dengan larutan pengencer. (dalam proses

isolasi)

2. Sampel dari pengenceran diambil sebanyak 0,1 ml dengan pipet

dan dipindahkan ke cawan steril.

3. Sebelumnya telah disiapkan media untuk pertumbuhan sel. Media

ini biasanya mengandung agar dan dalam keadaan cair .

4. Media cair dituangkan ke dalam cawan dan digoyang-goyangkan

supaya bahan menyebar rata di dalam medium. Kemudian

didiamkan sampai medium mengeras (membentuk gel) karena

suhunya turun/menjadi dingin.

5. Cawan tersebut diinkubasi dalam keadaan terbalik selama 48 jam

dengan suhu 350C.

Soal :

PENUNTUN MIKROBIOLOGI PANGAN 2020/2021 Page 21

 1. Suatu contoh tepung ikan diketahui mengandung jumlah mikroba 2,9 X 10 7
koloni/gr. Jelaskan secara skematis Cara melakukan pengenceran dan
pemupukan sehingga dapat diperoleh jumlah koloni di dalam cawan yang
memenuhi syarat untuk dihitung dan dilaporkan sebagai Standard Plate Count
(SPC).
2.Laporkan standard plate count dari contoh dibawah ini :

Contoh Pengenceran Koloni/gr

_______ 10-2 1-3 10-4 10-5 .................

Kaldu 280 45 3 -- ... .......

daging 262 28 1 -- ... .......
Udang - TBUD 1200 340 ... .......
segar TBUD 1000 325 ... .......
Cabe 1300 294 27 6 ... .......
bubuk 1280 340 35 3 ... .......
Susu 35 5 0 0 ... .......
bubuk 25 4 0 0 ... .......

B. METODE MOST PRABABLE NUMBER

(MPN)

Tujuan

Mempraktekkan cara perhitungan mikroba dalam media cair.

Metode MPN :

Media yang digunakan adalah media cair, media ini ditaruh dalam

tabung pengencer. Pertumbuhan mikroba ditandai dengan

terjadinya kekeruhan pada tabung atau terbentuknya gas dalam

tabung durham.

PENUNTUN MIKROBIOLOGI PANGAN 2020/2021 Page 22

 Reagen : Air kran, aquades, dan NaCL, Nutrien Broth,

Lactosa broth

Sampel : Air kran/air sumur/air tahu/Yoghurt/Asinan sayur.

Alat : Tabung pengencer, Tabung durham, Pipet.

Prosedur kerja metode MPN

1. Dibuat satu seri pengenceran bahan dan masing-masing tingkat

pengenceran terdiri dari 3 tabung. Yang akan ditentukan

jumlahnya adalah mikroba yang dapat memfermentasi laktosa

dan medianya adalah actose broth.

2. Inkubasi 24 jam, amati jumlah tabung positif pada masing-

masing tingkat pengenceran, kemudian lanjutkan inkubasi 24 jam

berikutnya dan amati lagi.

Rumus perhitungan jumlah koloni:

Kombinasi : 3 .2. 1.
Nilai MPN dari Tabel ( 3 tabung ) = 1,5

MPN Count” = Nilai MPN X 1 pengenceran yang ditengah

C = 1,5 x 1/10-3

PENUNTUN MIKROBIOLOGI PANGAN 2020/2021 Page 23

Soal :
1. Apakah kelebihan dan kekurangan metode MPN dibanding metode
hitung cawan ?

2.Laporkan MPN dari Contoh Dibawah ini.

Contoh Pengenceran Koloni/gr

_______ 10-2 10-3 10-4 10-5 .........
Air buangan industri +++++ ++++- -----+ ---+- ..........
Air sumur - - +++ - +++- ----+ +---- ........
Air leding ----- ----+ ----- ----- ........
Air cendol - - +++ - - ++ - ----- ----- ........

PERTEMUAN VII

PENUNTUN MIKROBIOLOGI PANGAN 2020/2021 Page 24

 Pengaruh Faktor Intrinsik Terhadap Pertumbuhan
Mikroba

Kemampuan mikroorganisme untuk tumbuh dan tetap hidup

merupakan hal yang penting dalam ekosistem pangan. Suatu

pengetahuan dan pengertian tentang faktor-faktor yang

mempengaruhi kemampuan tersebut sangat penting untuk

mengendalikan hubungan antara mikroorganisme – makanan –

manusia.

Beberapa faktor utama yang mempengaruhi pertubuhan

mikroorganisme meliputi suplai zat gizi, waktu, suhu, air, PH dan

tersedianya oksigen.

Tabel 2.
Bahan dan Alat Pertumbuhan Mikroba
Jenis Bahan
Protein hewani (Bakteri) Ikan mentah
Daging mentah
Susu
Sayuran (Kapang dan Tomat segar
khamir) Bayam segar
Wortel segar
Buah (kapang dan khamir) Pepaya
Sirsak
Jambu air
Karbohidrat Kentang

Prosedur :

PENUNTUN MIKROBIOLOGI PANGAN 2020/2021 Page 25

 1. Bagi bahan pada masing-masing golongan.

2. Bahan yang didapatkan kemudian dibiarkan diudara terbuka

selama 2 jam.

3. Amati mikroba apa yang terdapat didalamnya dengan cara

menghancurkan bahan tersebut dan dilihat jenisnya di bawah

mikroskop.

4. Setelah diketahui jenis mikroba apa yang terdapat dalam bahan

tersebut, kemudian diambil 1 loop bahan dan diinokulasikan

diatas cawan agar (NA, PDA), kemudian inkubasi selama 1 jam.

dan jenis bahan makanan.

5. Buat laporan.

PERTEMUAN VIII

PENUNTUN MIKROBIOLOGI PANGAN 2020/2021 Page 26

 PENGARUH FAKTOR EKSTRINSIK TERHADAP

PERTUMBUHAN MIKROBA

1.Pengaruh Penyimpanan Suhu Dingin Dan Suhu Ruang Terhadap

Pertumbuhan Mikroba

Tujuan :

Mempelajari pengaruh suhu dingin dan suhu ruang terhadap

pertumbuhan mikroba.

Reagen/Bahan :

Beberapa jenis tahu dan tempe, susu cair dan kemasan, buah

Prosedur :

a. Beli tahu yang kecil-kecil (jangan membeli yang besar kemudian

dipotong, karena tahu akan terkontaminasi).

b. Sampel kemudian dibagi untuk disimpan masing-masing pada :

suhu ruang, suhu dingin, dan suhu ruang.

c. Sampel disimpan dalam 1 minggu (minimal 5 hari), dan amati

setiap hari

d. Amati perubahan yang terjadi berdasarkan:

- Aroma, - Rasa - - Rasa

Warna - Tekstur
e. Buat laporan dan bandingkan

PENUNTUN MIKROBIOLOGI PANGAN 2020/2021 Page 27

 2. Pengaruh Ph Terhadap Pertumbuhan Mikroba

PH dapat digunakan untuk mengendalikan pertumbuhan

mikroba. Pada percobaan ini, PH sari buah di buat beragam,

kemudian sari buah disimpan dalam jangka waktu tertentu. Setelah

itu dilakukan pengamatan terhadap pertumbuhan mikroba.

Bahan /Reagen : Buah Markisa, asam sitrat dan NaOH

Alat : Pisau, Talenan, Kompor, kain saring,

Panci, gelas piala 2000 ml, pH meter,

pipet tetes, pengaduk,

Prosedur :

1. Buah markisa dicuci, dibelah dan isinya diperas dengan kain

saring untuk mendapatkan sari buah.

2. Sari buah dibagi 3 kelompok.

3. Masing-masing diberi perlakuan berikut :

a. Ditambah dengan larutan NaOH 1% setetes demi setetes

dengan pipet tetes sampai PH 6-6,5.

b. Ditambah larutan asam sitrat 25% setetes demi setetes dengan

pipet tetes sampai PH 4 (dipantau dengan PH meter).

4. Ditambah larutan asam sitrat 25% setetes demi setetes dengan

pipet tetes sampai Ph 3 (dipantau dengan Ph meter).

5. Masing-masing kelompok sari buah dipanaskan sampai hampir

mendidih, kemudian masukkan ke dalam botol seli berpenutup

ulir dari logam dan ditutup rapat. Setelah itu botol seli yang

berisi sari buah direbus di dalam air mendidih selama 5 menit.

PENUNTUN MIKROBIOLOGI PANGAN 2020/2021 Page 28

 6. Ketiga kelompok sari buah tersebut disimpan selama 1 minggu.

7. Lakukan pengamatan dengan mengamati PH setelah penyimpanan

dan total count bakteri.

Pertanyaan :

1. apakah terdapat hubungan antara PH dengan jumlah bakteri

yang tumbuh pada sari buah setelah penyimpanan.

PERTEMUAN IX & X

PENGARUH PENGAWET DAN REMPAH-REMPAH

TERHADAP PERTUMBUHAN MIKROBA

PENUNTUN MIKROBIOLOGI PANGAN 2020/2021 Page 29

 Memperpanjang masa simpan makanan biasanya dilakaukan

dengan menambahkan bahan pengawet kedalam makanan tersebut.

Berbagai bahan pengawet mempunyai aktifitas yang berbeda –beda.

Misalnya ada yang bersifat bakterisidal yaitu membunuh bakteri,

bakteristatik ( menghambat pertumbuhan bakteri) fungisidal,

fungiistatik, atau menghambat germinasi spora bakteri dan lain-lain.

Salah satu pengawet yang digunakan dalam makanan adalah asam

benzoat. Garam natrium dan asam benzoat. Konsentrasi maksimal yang

dipakai dalam makanan adalah 0,1 % dan efektif digunakan pada pH 2,5

sampai 4. Daya pengawet berkurang dengan tingginya pH.

Rempah-rempah juga dapat menghambat pertumbuhan mikroba

karena adanya senyawa anti mikroba didalamnya

Bahan :

Kelom Uji Pengaruh Na- Uji pengaruh rempah-rempah

pok Benzoat
I Jeruk Segar Lactobasilus Rhizopus
II Jeruk Pasteurisasi Basillus Aspergillus
III Nenas segar Pseudomonas Sacharomyces
IV Nenas Pasteurisasi Staphylococcu Candida
s

Perkelompok
 1. buah agar miring PCA
 2 buah agar miring PCA + 2 % kunyit
 2 buah agar miring PCA + 2 % Bawang putih
 2 buah agar miring PCA 2 % kayu manis
 Larutan Na-benzoat 2 %

Alat : Perkelompok

PENUNTUN MIKROBIOLOGI PANGAN 2020/2021 Page 30

  4 buah tabung reaksi steril
 Pipet 1nml dan 10 ml
 Penangas 630C
 Inkubator suhu kamar

1. Prosedur Uji Pengaruh Na-Benzoat

 Pipet 9 ml sari buah masing-masing ke dalam 4 buah tabung

 3 tabung diisi dengan : 0,2. 0,5. Dan 1 ml larutan Na-benzoat

 1 tabung lainnya dijadikan kontrol

 Jadinya konsentrasi benzoat dalam tabung adalah : 0, 0,04, 0,1

dan 0,2 %.

 Untuk kelompok 2 dan 4 tabung dan isinya di pasteurisasi

dengan cara meletakkan didalam penangas air dengan suhu 63 0C

selama 30 menit

 Kemudian inkubasi semua tabung pada suhu kamar selama 7 hari

 Amati pertumbuhan mikroba yang ditandai dengan timbulnya

kekeruhan/perubahan Bau.

PERTEMUAN XI dan XII

UJI AKTIFITAS STARTER

DALAM FERMENTASI MAKANAN

PENUNTUN MIKROBIOLOGI PANGAN 2020/2021 Page 31

 Tujuan :

1. Mengetahui waktu yang diperlukan oleh ragi tape (khamir) untuk

membuat bahan tersebut menjadi asam.

2. Mengamati tingkat perubahan struktur asam dalam waktu 1 jam.

Fermentasi makanan dapat dibedakan atas dua grup

berdasarkan sumber mikroba yang berperan dalam fermentasi

yaitu :

1. Fermentasi spontan

Adalah fermentasi makanan dimana dalam pembuatannya

tidak ditambahkan mikroba dalam bentuk starter atau ragi.

Tetapi mikroba yang berperan aktif dalam proses fermentasi

berkembang biak secara spontan karena lingkungan hidupnya

yang dibuat sesuai untuk pertumbuhannya contoh sayur asin,

dimana pertumbuhan dan aktifitas bakteri asam laktat

dirangsang karena adanya garam yang ditambahkan sebelum

proses fermentasi.

2. Fermentasi tidak spontan

Fermentasi ini terjadi pada makanan yang dalam

pembuatannya ditambahkan mikroba dalam bentuk kultur atau

starter/ragi, dimana mikroba tersebut akan berkembang biak

dan aktif mengubah bahan yang difermentasi menjadi produk

yang diinginkan. Seperti yang terjadi dalam pembuatan tempe,

oncom, keju, yoghurt, sosis, rot, dsb

PENUNTUN MIKROBIOLOGI PANGAN 2020/2021 Page 32

 Tabel. 3
Reagen atau Bahan yang digunakan
Kel Kultur Yoghurt (penyimpanan) Ragi roti Ragi tape
I Tanpa penyimpanan (umur 24 Merek A Merek A
jam pada 37OC)
II Setelah disimpan 7 hari di Merek B Merek B
lemari es
III Setelah disimpan 7 hari pada Merek C Merek C
suhu kamar
IV Setelah dibekukan selama 7 hari Merek D Merek D
Ket :
1. Ragi bubuk (fermifan, maurifan, dan saf instant) 4 gr. (Ragi
roti).
2. Ragi padat (Ragi tape).

Bahan per kelompok :

100 ml susu pateurisai Larutan fenolftalin 1%

50 gr terigu Larutan NaOH 0.1 N

Bubur tepung beras

encer 100 ml.

Alat :

a. Tabung Erlemeyer (2 tabung 200-250 ml, dan 1 tabung 50 ml)

b. 1 gelas kimia, sendok,

c. Penangas air. (water bath),

d. Inkubator,( 45 0C)

e. pH Meter

f. Buret dan Pipet 10 ml

g. Batang pengaduk

Prosedur :

1. Uji Aktifitas Kultur Yogurt

PENUNTUN MIKROBIOLOGI PANGAN 2020/2021 Page 33

 a. Hangatkan 100 ml susu pasteurisasi di dalam penangas air 37 OC.

b. Masukkan dalam Erlenmeyer dan tambahkan 2% kultur yogurt.

c. Inkubasikan pada suhu 45OC selama 2 jam dan amati setiap 1 jam

dimulai dari awal.

d. Pengamatan yang dilakukan meliputi kekentalan secara visual,

bau, asam, PH dan total asam.

e. Pengukuran PH dilakukan dengan cara mengambil sebanyak kira-

kira 20 ml bahan dan diukur PHnya dengan menggunakan PH

meter.

f. Untuk pengukuran total asam :

1). pipet 10 ml bahan dan pindahkan ke dalam tabung erlenmeyrt

50 ml, dicampur dengan 10 ml air destilasi dan tambahkan 5

tetes larutan fenolftalin 1 %.

2).Titrasi dengan menggunakan larutan NaOH 0,1 sampai timbul

warna merah muda.

3). Total asam dihitung dengan persen asam laktat dengan rumus

: % asam laktat = ml NAOH x Normalitas NAOH x 1/10 x 90

% asam laktat = ml NAOH x Normalitas NAOH x 1/10 x 90

Ml atau gr atau contoh

2. Uji Aktifitas ragi roti.

a. Larutkan 2 gr ragi roti ke dalam 30 ml air hangat dan

dicampurkan dengan 50 gr tepung terigu dengan cara

menambahkan sedikit demi sedikit di dalam suatu mangkok.

b. Adonan roti dibuat dengan cara menekan-nekan dengan sendok

atau batang gelas selama 5 menit.

PENUNTUN MIKROBIOLOGI PANGAN 2020/2021 Page 34

 c. Adonan kemudian dimasukkan ke dalam gelas ukur yang telah

dilapisi minyak dan ditekan ke bawah.

d. Lakukan inkubasi pada suhu kamar selama 2 jam ( volume pada

aerob/terbuka dan anaerob/tertutup) dan amati pertambahan

volumenya setiap setengan jam yang dinyatakan dalam ml per 30

menit.

e. Bandingkan aktifitas keempat merek ragi roti yang digunakan.

3. Uji Aktifitas Ragi Tape

a. Masukkan 100 ml bubur tepung beras encer ke dalam tabung

srlen meyer 200 – 250 ml.

b. Tambahkan 4 gr ragi tape yang telah dihancurkan, dan aduk rata.

c. Inkubasi pada suhu 37OC selama 2 jam dan amati setiap satu jam

amati perubahan kekentalan , bau, asam/alcohol, PH dan total

asam seperti yang dilakukan terhadap kultur yogurt.

4. Uji Fermentasi

 Setiap kelompok menyiapkan :

2tabung glucose broth + BCP + tabung durham.

2 tabung sucrose broth + BCP + tabung durham.

2 tabung lactosa broth + BCP + tabung durham

BCP (Brom Cresol Purple) adalah suatu indicator yang berwarna

ungu.

 Inokulasikan 1 tabung dari masing-masing jenis medium dengan 1

loop mikroba dan 1 tabung lainnya dengan 1 loop makanan.

 Inkubasikan pada suhu 30 – 32OC selama 2 – 3 hari.

PENUNTUN MIKROBIOLOGI PANGAN 2020/2021 Page 35

  Amati terbentuknya gas di dalam tabung durham, dan

terbentuknya gas di dalam tabung durham, dan terbentuknya

asam yang ditandai dengan perubahan warna media dari ungu

menjadi kuning.

Laporan :

A. Lampirkan hasil pengamatan saudara dalam bentuk table sebagai

berikut :

Tabel.4
Hasil Uji aktifitas ragi roti
Merek ragi Pengembangan adonan (ml/30 menit)
A ………………………………
B ………………………………
C ………………………………
D ………………………………

Tabel 5.

PENUNTUN MIKROBIOLOGI PANGAN 2020/2021 Page 36

 Hasil uji aktifitas kultur yogurt dan ragi tape

Total
Kultur/Ragi Jam Kekentalan Bau PH
asam (%)
1.Kultur yogurt
- Tanpa penyimpanan 0 …………………. …… …… ………………
1 …………………. ….. …… ……………..
2 …………………. …… …… ………………
….. …… ……………..
-Dalam lemari es 7 hari 0 …………………. …… …… ………………
1 …………………. …… …… ……………..
2 ………………….

-Dalam suhu beku 7 hari 0 ................ ....... ...... ...............

1 ................ ........ ...... ..............
2 ................ ...... ..... ................

-Dalam suhu kamar 7 hari 0 ................ ....... ..... ...............

1 ................. ....... ..... ...............
2 ............... ...... ...... ..............
2. Ragi Tape Merek A
0 …………………. …… …… ………………
1 …………………. ….. …… ……………..
2 …………………. …… …… ………………
….. ….. ……………...
Merek B 0 …………………. …… …… ………………
1 …………………. …… … …………..
2 ………………….
…… …… ………………
Merek C 0 …………………. ….. …… ……………..
1 …………………. …… …… ………………
2 …………………. ….. …… ……………..
…… …… ………………
Merek D 0 …………………. …… …… ……………..
1 ………………….
2 …………………. …… …… ………………

B. Berikan pembahasan mengenai hsil-hasil

PERTEMUAN XIII pengamatan
DAN XIV tersebut

PENUNTUN MIKROBIOLOGI PANGAN 2020/2021 Page 37

 UJI KERUSAKAN BAHAN MAKANAN
Hampir semua bahan pangan tercemar oleh berbagai

mikroorganisme dari lingkungan sekitarnya (udara, air, tanah, debu,

kotoran, bahan organic yang telah busuk).

Mikroorganisme yang berada pada suatu bahan pangan umumnya

bersifat sangat spesifik tergantung dari jenis bahan pangan dan

kondisi tertentu dari penyimpanannya. Contoh: air susu segar biasanya

di rusak oleh bakteri asam laktat produk biji-bijian, serealian

kebanyakan dirusak oleh kapang dan sari buah terutama dirusak oleh

khamir.

Tabel. 7
Pembagian Kelompok dan Bahan yang digunakan
No Kelompok Bahan
1 1,2,3 Susu (25 ml segar dan 25 ml yang telah dibuka 4 jam
2 4,5,6 Ikan goreng (25 gr 2 jam dan 4 jam setelah
digoreng)
3 7,8,9 Bening bayam (dibuka 2 jam dan dibuka 5 jam)
4 10,11 Buah (segar dan tidak segar)
5 12,13 Roti (Baru dan Usang)

Reagen :

PENUNTUN MIKROBIOLOGI PANGAN 2020/2021 Page 38

  Larutan Kristal violet ,

 Larutan malachite green (hijau malasit)

 Larutan Yodium, Alkohol 95, Larutan safranin

 Media Agar PDA dan PCA

Alat : Cawan Petri, batang pengoles, gelas objek, gelas penutup,

jarum ose, mikroskop, tabung reaksi.

Prosedur :

1. Lihat secara fisik : warna, aroma, kekentalan/tekstur.

2. Lihat mirfologi mikroba yang tumbuh dengan mikroskop.

a. Persiapan dan fiksasi

Makanan/kultur cair. Sebarkan satu loop makanan atau

kultur cair pada gelas objek sehingga mencapai diameter 1-

1,5 cm2. Keringkan di udara, dan fiksasi dengan nyala api kecil.

Makanan/kultur padat. Berilah setets air pada gelas objek

dan ambillah sejumlah kecil pertumbuhan mikroba

menggunakan ujung loop, kemudian disebarkan pada tetesan

air di atas gelas objek sehingga mencapai diameter kira-kira

1-1,5 cm2. Suspensi yang terbentuk tidak boleh terlalu keruh

untuk mencegah terbentuknya lapisan film yang terlalu tebal.

Keringkan di udara dan fiksasi dengan nyala api kecil.

b. Pewarnaan gram

(lihat prosedur pewarnaan gram pada Praktikum II).

c. Pewarnaan spora

PENUNTUN MIKROBIOLOGI PANGAN 2020/2021 Page 39

 Teteskan pewarna hijau malasit di atas lapisan film pada

gelas objek, dan biarkan selama 20 menit tanpa pemanasan,

atau selama 5 menit di atas penangas air. Setiap kali pewarna

menjadi kering, teruskan lagi pewarna yang baru. Cucilah

hati-hati dengan air selama 20-30 detik, kemudian di beri

safranin selama 30 detik. Setelah dibilas dengan air

kemudian dikeringkan dengan kertas serap.

Periksalah di bawah mikroskop menggunakan lensa

objektif minyak imersi, serta amati bentuk dan besar spora,

serta letak spora dalam sel. Juga perlu dicatat apakah sel

vegetative membengkak dengan adanya spora atau besarnya

tetap.

3. Lakukan isolasi

Tanam di media agar (PDA) untuk melihat kapang dan

khamir, PCA (untuk melihat bakteri) pada 2 cawan Petri setiap

kelompok. Lihat mikroba apa yang tumbuh pada cawan Petri pada

hari ke 2

4. Lihat hasil isolasi di mikroskop.

PENUNTUN MIKROBIOLOGI PANGAN 2020/2021 Page 40