LAPORAN PRAKTIKUM

KI2221 CARA PEMISAHAN & ELEKTROMETRI

MODUL 09: HPLC (HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY)

Nama : Naufal Hanif Kusuma

NIM : 10519084

Hari : Selasa

Tanggal : 6 April 2021

Asisten : Siti Oryza Sativa

LABORATORIUM KIMIA ANALITIK

PROGRAM STUDI KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
2021
 LAPORAN PRAKTIKUM
KI2221 CARA PEMISAHAN & ELEKTROMETRI
MODUL 09: HPLC (HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY)

I. TUJUAN PERCOBAAN
Menentukan konsentrasi sampel kafein menggunakan regresi linear konsentrasi
standar terhadap tinggi puncak kromatogram dan konsentrasi standar terhadap luas daerah
puncak kromatogram menggunakan metode HPLC (High Performance Liquid
Chromatography).

II. PRINSIP PERCOBAAN

Kromatografi merupakan salah satu teknik pemisahan yang didasarkan pada
interaksi zat analit dengan fasa diam dan fasa gerak. Fasa diam merupakan pelarut atau
komponen yang statis dan umumnya berada atau menempel pada dinding kolom. Fasa
gerak merupakan pelarut yang digunakan untuk membawa zat analit melewati kolom
kromatografi hingga mencapai detektor. Sifat kepolaran fasa diam dan fasa gerak dibuat
berlawanan, di mana jika fasa diam merupakan zat polar maka fasa gerak menggunakan
zat non-polar, begitupun sebaliknya. Salah satu jenis kromatografi adalah HPLC atau
kromatografi cair performa tinggi. Dalam HPLC, sampel cair atau padat dilarutkan pada
pelarut tertentu dan dilewatkan kolom hingga mencapai detektor dan diukur
kromatogramnya.

III. MSDS (Material Safety Data Sheets)

Bahaya &
No. Senyawa TB(0C) TD(0C) MR Sifat Fisik
Penanganan
Berbahaya jika
1. Kafein 238 - 194,2 Padatan putih
tertelan, terhirup,
terkena mata atau
2. Asam Fosfat 42,4 - 97,9 Larutan bening
kulit. Jika terpapar
harap hubungi
3. Metanol -97,6 65 32,04 Cairan bening
tenaga medis.
4. Air 0 100 18 Cairan bening Tidak berbahaya.
*Sumber: pubchem.ncbi.nlm.nih.gov

IV. ALAT & BAHAN

- Set alat HPLC
 - Syringe
- Penangas ultrasonik
- Set alat gelas
- Larutan standar 500 ppm kafein
- Larutan 5% asam fosfat
- Metanol
- Air bidestilasi
- Dua jenis sampel produk mengandung kafein

V. CARA KERJA
5.1. Pembuatan Fasa Gerak
Dibuat fasa gerak dengan komposisi 140 mL aqua bidestilasi, 1,4 mL H3PO4 5%
dan 60 mL metanol. Gas yang terlarut di dalam campuran dihilangkan menggunakan
penangas ultrasonik.

5.2. Penyiapan Larutan Standar

Dengan menggunakan larutan standar 500 ppm kafein, dibuat sederet larutan
standar dengan konsentrasi masing-masing 20, 40, 60, 80, 100 ppm sebanyak 5 mL.
Pengenceran dilakukan menggunakan eluen yang telah dibuat pada bagian pembuatan
fasa gerak.

5.3. Penyiapan Larutan Sampel

Jika sampel berupa minuman berkarbonasi (cola atau sejenisnya), gas
dihilangkan terlebih dahulu menggunakan penangas ultrasonik. Pengenceran
dilakukan sebanyak 5 kali dalam labu takar 10 mL menggunakan eluen.

5.4. Analisis
Kromatografi direkam pada masing-masing larutan standar dan sampel yang
telah disiapkan.

VI. DATA PENGAMATAN

6.1. Data Umum
- Panjang gelombang (λ) = 274 nm
- Eluen = metanol : aquabidestilasi : asam fosfat (HPLC Grade)
- Laju alir eluen = 1 mL/menit
- Tipe kolom = C18
- Volume injeksi = 25 μL
- Tinggi puncak kromatogram larutan sampel 1 = 500,37262 mAU
 - Luas daerah puncak kromatogram larutan sampel 1 = 4720,81787 mAU
- Tinggi puncak kromatogram larutan sampel 2 = 362,70023 mAU
- Luas daerah puncak kromatogram larutan sampel 2 = 3230,56616 mAU

6.2. Kromatogram Larutan Sampel dan Standar

Gambar 6.2.1. Kromatogram Larutan Standar 20 ppm

Gambar 6.2.2. Kromatogram Larutan Standar 40 ppm

Gambar 6.2.3. Kromatogram Larutan Standar 60 ppm

Gambar 6.2.4. Kromatogram Larutan Standar 80 ppm

Gambar 6.2.5. Kromatogram Larutan Standar 100 ppm

Gambar 6.2.6. Kromatogram Larutan Sampel 1

 Gambar 6.2.7. Kromatogram Larutan Sampel 2

VII. PERHITUNGAN & PENGOLAHAN DATA

7.1. Kurva Regresi Linear Tinggi Puncak dan Luas Daerah Puncak Larutan Standar
Tinggi Puncak Luas Daerah
No. C (ppm)
(mAU) (mAU*s)
1. 20 118,27427 1173,32227
2. 40 254,99759 2423,32178
3. 60 408,6546 3738,60327
4. 80 546,17017 4977,71973
5. 100 695,34167 6263,06494

Konsentrasi vs Tinggi Puncak

800
700 y = 7,2265x - 28,905
R² = 0,9997
Tinggi Puncak (mAU)

600
500
400
300
200
100
0
0 20 40 60 80 100 120
C (ppm)
 Konsentrasi vs Luas Daerah
7000
y = 63,669x - 104,96
6000
R² = 0,9999
Luas Daerah (mAU*s)
5000

4000

3000

2000

1000

0
0 20 40 60 80 100 120
C (ppm)

7.2. Penentuan Konsentrasi Larutan Sampel Kafein

Berdasarkan tinggi puncak:
y = 7,2265x - 28,905
Di mana y = tinggi puncak dan x = nilai konsentrasi standar. Disubtitusi nilai
tinggi puncak larutan sampel 1 dan sampel 2.
y(1) = 500,37262 = 7,2265x1 – 28,905
x1 = 73,241 ppm
y(2) = 362,70023 = 7,2265x2 – 28,905
x2 = 54,190 ppm
Berdasarkan luas daerah puncak:
y = 63,669x - 104,96
Di mana y = luas daerah puncak dan x = nilai konsentrasi standar. Disubtitusi
nilai luas daerah puncak larutan sampel 1 dan sampel 2.
y(1) = 4720,81787 = 63,669x3 – 104,96
x3 = 74,795 ppm
y(2) = 3230,56616 = 63,669x4 – 104,96
x4 = 52,389 ppm

VIII. PEMBAHASAN
Kromatografi merupakan salah satu teknik pemisahan yang didasarkan pada
interaksi zat analit dengan fasa diam dan fasa gerak. Fasa diam merupakan pelarut atau
komponen yang statis dan umumnya berada atau menempel pada dinding kolom. Fasa
gerak merupakan pelarut yang digunakan untuk membawa zat analit melewati kolom
kromatografi hingga mencapai detektor. Sifat kepolaran fasa diam dan fasa gerak dibuat
berlawanan, di mana jika fasa diam merupakan zat polar maka fasa gerak menggunakan
zat non-polar, begitupun sebaliknya.

Salah satu jenis kromatografi adalah HPLC atau kromatografi cair performa tinggi.
Dalam HPLC, sampel cair atau padat dilarutkan pada pelarut tertentu dan dilewatkan
kolom hingga mencapai detektor dan diukur kromatogramnya. Pemisahan ditentukan oleh
interaksi fasa terlarut dan diam, termasuk adsorpsi padat-cair, partisi cair-cair, pertukaran
ion, eksklusi ukuran, dan interaksi fasa terlarut dan bergerak. Berikut contoh skema
diagram HPLC:

Gambar 8.1. Skema Diagram HPLC

Penggunaan HPLC kerap dibandingkan dengan instrumen GC-MS atau kromatografi

gas spektrofotometri massa. Terdapat beberapa perbedaan pada HPLC dan GC-MS, di
antaranya yaitu bentuk kolom, jenis sampel, kontrol temperatur, dan biaya. Dari bentuk
kolom, HPLC menggunakan tabung logam berdiameter 4-6 inci yang disusun oleh silika
dengan kerapatan tinggi, sedangkan GC menggunakan kolom kapiler melingkar yang
dilapisi oleh bahan tertentu. Dari jenis sampel, HPLC cenderung digunakan untuk sampel
garam atau sampel ionik, sedangkan GC digunakan untuk sampel volatil (mudah
menguap). Dari kontrol temperatur, GC menggunakan oven sebagai kontrol temperatur di
mana suhu dapat diatur sesuai kebutuhan, sedangkan HPLC hanya ditempatkan pada
ruangan bersuhu ruang. Secara biaya, analisis HPLC lebih memakan biaya dibandingkan
GC-MS.
 Prinsip kerja HPLC adalahpemisahan komponen analit berdasarkan kepolarannya,
setiap campuran yang keluar akan terdeteksi dengan detektor dan direkam dalam bentuk
kromatogram. Dimana jumlah peak menyatakan jumlah komponen, sedangkan luas peak
menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran (Kusuma).

Pada praktikum ini, sampel yang digunakan adalah sampel teh dan sampel cola, di
mana sampel teh merupakan sampel 1 dan sampel cola merupakan sampel 2. Metode yang
digunakan pada modul ini adalah HPLC. Secara singkat, cara kerja modul ini yaitu
pertama, dibuat larutan standar kafein dengan variasi konsentrasi dan diukur
kromatogramnya. Kemudian, dari setiap konsentrasi, dikumpulkan masing-masing nilai
tinggi puncak dan luas daerah puncak dan kemudian ditabulasikan bersesuaian dengan
konsentrasi larutan standar. Berdasarkan tabel data tersebut, dibuat regresi linear antara
konsentrasi dengan tinggi puncak dan konsentrasi dengan luas daerah puncak. Selanjutnya,
diukur sampel 1 dan 2 menggunakan HPLC dan didapatkan kromatogram beserta nilai
tinggi puncak dan luas daerah puncak. Masing-masing data tersebut disubtitusikan pada
persamaan yang sesuai (data tinggi puncak disubtitusi ke dalam persamaan regresi tinggi
puncak) dan didapatkan empat data, yaitu konsentrasi sampel 1 dan 2 berdasarkan tinggi
puncak dan luas daerah puncak. Berdasarkan hasil perhitungan, didapatkan:
x1 = 73,241 ppm
x2 = 54,190 ppm
x3 = 74,795 ppm
x4 = 52,389 ppm

Subskrip 1 merujuk pada sampel 1 menggunakan tinggi puncak, subskrip 2 merujuk pada
sampel 2 menggunakan tinggi puncak, subskrip 3 merujuk pada sampel 2 menggunakan
luas daerah puncak, dan subskrip 4 merujuk pada sampel 2 menggunakan luas daerah
puncak.

Secara fitur, terdapat beberapa kelebihan HPLC dibandingkan dengan GC, di

antaranya HPLC dapat digunakan pada analit yang tidak volatil, detektor HPLC memiliki
sensitivitas yang tinggi, daya pisah yang tinggi, dapat mengukur analit dalam jumlah
sedikit, dan dapat dilakukan pada suhu kamar. Selanjutnya, terdapat beberapa kegunaan
HPLC, di antaranya yaitu umum digunakan pada bidang farmasi, pemisahan zat
berdasarkan kepolaran, pemisahan morfin dan heroin, serta pemisahan vitamin dalam air.

IX. KESIMPULAN
Pada praktikum ini dilakukan analisis terhadap sampel teh dan cola menggunakan
metode HPLC. Output yang dihasilkan pada modul ini adalah konsentrasi sampel teh dan
cola menggunakan parameter tinggi puncak dan luas daerah puncak kromatogram HPLC.
Didapatkan nilai konsentrasi sampel teh dan cola sesuai yang telah dicantumkan pada akhir
bagian perhitungan dan pengolahan data.
X. DAFTAR PUSTAKA
Harvey, D. 2000. Modern Analytical Chemistry 1st Ed. Indiana: Depauw University.
Kusuma, A. S. W. Penggunaan Instrumen High Performance Liquid Chromatography
Sebagai Metode Penentuan Kadar Kapsaisin Pada Bumbu Masak Kemasan “Bumbu
Marinade Ayam Special” Merek Sasa.
pubchem.ncbi.nlm.nih.gov, diakses pada Selasa, 13 April 2021.