Signifikansi Klinis dan Patologis Tumor Stem Cell

Marker ALDH1 dan CD133 pada Karsinoma Kolorektal

Maryam Rezaee1 , Elmira Gheytanchi1, Zahra Madjd 1,2, Mitra Mehrazma1,3*

1. Oncopathology Research Center, Iran University of Medical Sciences, Tehran, Iran

2. Department of Molecular Medicine, Faculty of Advanced Technologies in Medicine, Iran University of Medical Sciences,
Tehran, Iran
3. Department of Pathology, Hasheminejad Kidney Center, Iran University of Medical Sciences, Tehran, Iran

Abstrak
Latar Belakang & Tujuan: Kanker kolorektal (KKR) merupakan kanker tersering ketiga di
dunia dengan angka kematian yang tinggi. Penyebab utama kematian pada pasien adalah
kekambuhan dan metastasis yang terutama disebabkan oleh subpopulasi kecil sel di dalam
tumor yang disebut sel punca kanker (kanker stem cell (CSCs). Penelitian ini bertujuan untuk
mengevaluasi korelasi antara ekspresi ALDH1 dan CD133 sebagai penanda terkait CSC dan
karakteristik klinikopatologis pada CRC.
Metode: Dalam studi potong lintang ini, total 483 sampel tumor CRC diwarnai secara
imunohistokimia untuk mendeteksi penanda CD133 dan ALDH1. Korelasi ekspresi penanda
dengan faktor klinikopatologi juga dievaluasi.
Hasil: Terdapat hubungan yang bermakna antara intensitas luminal CD133 dengan invasi
saraf (P=0,05) dan antara intensitas sitoplasma CD133 dengan metastasis (P=0,05). Dalam
hal skor-H, hubungan signifikan positif yang diamati antara ekspresi sitoplasma CD133 dan
kelenjar getah bening (P=0,02), saraf (P=0,04) dan invasi vaskular (P=0,02). Ekspresi
sitoplasma ALDH1 menunjukkan korelasi yang signifikan dengan ukuran tumor (P=0,001).
Kesimpulan: Temuan kami menunjukkan bahwa peningkatan ekspresi CD133 dan ALDH1
dikaitkan dengan perkembangan tumor dan hasil yang lebih buruk pada pasien CRC. Penanda
ini dapat menjadi kandidat yang baik untuk penargetan lokal CSC menggunakan antibodi.
Penelitian masa depan perlu ditingkatkan pendekatan untuk deteksi dini CRC, dan
pemantauan pengobatan untuk CRC dan kanker lainnya.
PENDAHULUAN
Kanker kolorektal adalah salah satu kanker paling umum ketiga dan penyebab keempat
kematian terkait kanker di seluruh dunia dengan 700.000 kematian setiap tahun (1-4). Dalam
hal jenis kelamin, CRC dianggap sebagai kanker paling umum kedua pada wanita dan ketiga
pada pria (5). Faktor risiko terkait dengan kebiasaan atau karakteristik pribadi termasuk usia,
riwayat penyakit kronis dan gaya hidup yang terkait dengan perkembangan CRC (3). Mutasi
berbeda yang menargetkan gen seperti penekan tumor, perbaikan DNA, dan onkogen
menyebabkan CRC (6). Berdasarkan situs mutasi gen, CRC dapat dikategorikan sebagai
sporadis (70%); diwariskan (5%) dan keluarga (25%) (7). Ketidakstabilan kromosom (CIN),
ketidakstabilan mikrosatelit (MSI) dan fenotipe metilasi pulau CpG (CIMP) telah dilaporkan
sebagai mekanisme utama yang terlibat dalam patogenesis CRC (8). Jalur utama seperti
WNT, TP53, MAPK/PI3K, TGF-β, dan mutasi gen PTEN, PIK3CA, C-MYC, SMAD2,
SMAD4, BRAF dan KRAS dipengaruhi oleh perubahan dan translokasi kromosom (9-12).
Meskipun perbaikan dalam diagnosis dan terapi CRC, tingkat kelangsungan hidup pasien
dengan CRC masih tetap buruk karena resistensi obat, metastasis, dan kekambuhan (13, 14).
Oleh karena itu, penting untuk mengembangkan dan menerapkan biomarker yang tepat dan
sesuai untuk meningkatkan proses diagnostik yang membantu dokter dalam mendeteksi CRC
pada tahap awal. Bukti yang muncul telah menunjukkan bahwa subpopulasi sel yang juga
disebut tumor initiating atau cancer stem cells (CSCs) dengan karakteristik multi-potensi dan
pembaruan diri memiliki peran penting dalam patofisiologi CRC (15-17). Mereka
menunjukkan resistensi kemoterapi, potensi diferensiasi, dan tumorigenisitas tinggi dan bisa
menjadi pendekatan terapi yang menjanjikan untuk manajemen CRC (18, 19). CSC telah
dikenal secara efektif pada tumor padat yang berbeda termasuk CRC (20). Penargetan CSC
dapat dicapai di CRC melalui berbagai penanda permukaan sel yang terkait dengan
pembaruan diri, termasuk reseptor CD133, CD166, CD44, CD24, beta1 integrin-CD29, Lgr5,
EpCAM (ESA), ALDH-1, Msi-1, DCAMLK1 atau EphB (18, 21). Oleh karena itu,
memahami penanda mana yang memiliki efek terbesar pada diagnosis dan prognosis pasien
telah menjadi fokus banyak penelitian. CD133 dan ALDH-1 adalah salah satu penanda utama
yang telah dikaitkan dengan CSC di CRC (22).
Penanda permukaan sel CD133 juga dikenal sebagai AC133 pada manusia atau prominin-1
pada hewan pengerat adalah molekul transmembran lima domain dengan berat molekul 120
kDa yang telah diidentifikasi sebagai penanda CSC normal dan diduga pada beberapa kanker,
termasuk tumor otak, karsinoma prostat dan CRC (23-29). Studi sebelumnya melaporkan
pembaruan diri in-vitro dan in-vivo dan potensi tumorigenisitas tinggi dari CD133 di CRC
(28, 30). Telah ditunjukkan bahwa ekspresi CD133 dalam kombinasi dengan penanda CSC
diduga lainnya berkorelasi dengan hasil klinis pada pasien CRC (31).
Aldehyde dehydrogenase (ALDH) dengan beberapa isoform dan fungsi seluler serta
distribusi jaringan yang berbeda terletak pada kromosom 12 (30, 32). Ini dianggap sebagai
enzim detoksifikasi untuk oksidasi aldehida intraseluler (32, 33). Isoform ALDH termasuk
ALDH-1 dapat menyebabkan prognosis yang buruk pada pasien dan telah dilaporkan menjadi
penanda sel induk diduga pada beberapa kanker seperti kanker payudara (34),
adenokarsinoma pankreas (35), kanker ovarium (32) kanker paru-paru dan kanker kolorektal
(30, 32, 36). Resistensi terhadap kemoterapi dikaitkan dengan pemicuan transkripsi di
ALDH1 yang mengarah ke resistensi obat dan radiasi di CSC yang pertama kali terdeteksi
dalam sel progenitor hematopoietik (32). Peran ALDH-1 dan isoformnya dalam karakteristik
CSC termasuk pembaruan diri, diferensiasi dan transisi epitel-mesenkim (EMT) juga telah
ditunjukkan pada xenotransplantasi kanker payudara dan kanker usus besar (32, 37, 38).
Studi sebelumnya dalam literatur menunjukkan nilai prognostik ekspresi ALDH1 pada
kanker yang berbeda termasuk CRC (39, 40) dan beberapa di antaranya menunjukkan bahwa
ada hubungan antara ekspresi ALDH1 dan stadium tumor (41).
Mempertimbangkan kurangnya informasi komprehensif yang berfokus pada hubungan antara
ekspresi bersamaan penanda CSC diduga ALDH1 dan CD133 dengan faktor klinikopatologi
utama di CRC, penelitian saat ini bertujuan untuk mengevaluasi ekspresi imunohistokimia
penanda ini pada pasien CRC.
MATERIAL & METODE
Pengumpulan Data Pasien dan Persiapan Sampel
Dalam studi cross-sectional ini, jaringan formalin-fixed-paraffin-embedded (FFPE) dari 483
pasien, yang didiagnosis dengan CRC, dikumpulkan dari tiga Pusat Rujukan berbasis
Universitas Hasheminejad, Rasoul-Akram dan Firoozgar di Teheran, Iran, dari 2009 hingga
2015. Rekam medis pasien dievaluasi untuk memastikan parameter demografi dan
klinikopatologi berikut disertakan, yaitu, usia, jenis kelamin, ukuran tumor, derajat, dan
stadium, lokasi tumor, status diferensiasi tumor, metastasis, kelenjar getah bening dan invasi
jaringan saraf. Semua histologi tumor dinilai menggunakan slide tumor yang diwarnai dengan
hematoxylin dan eosin (H&E) oleh ahli patologi yang berpengalaman. Selanjutnya, data
pasien dijaga kerahasiaannya dan penggunaan etis sampel jaringan pasien telah disetujui oleh
Komite Etika Universitas Ilmu Kedokteran Iran (IR.IUMS.REC 1395.9311100010).
Konstruksi Blok Tissue Microarray (TMA)
Blok CRC TMA disiapkan seperti yang disebutkan di atas (40). Singkatnya, pemilihan area
perwakilan tumor dilakukan dari slide H&E untuk persiapan TMA. Inti dengan diameter 0,6
mm dari area tumor yang ditandai dimasukkan ke dalam blok microarray jaringan oleh Tissue
Arrayer Minicore (ALPHELYS, Plaisir, Prancis). TMA dibuat dalam lima salinan untuk
setiap sampel, skor rata-rata inti kemudian dianggap sebagai skor akhir (27). Akhirnya,
pemotongan blok TMA dilakukan untuk pewarnaan imunohistokimia.
Penentuan Penanda Imunohistokimia (IHC)
Tingkat ekspresi ALDH1 dan CD133 dievaluasi di bagian CRC dengan metode IHC, seperti
yang dijelaskan sebelumnya (30). Singkatnya, blok CRC TMA manusia yang tertanam
parafin dipotong pada ketebalan 5 m dan kemudian dipasang ke slide Super frost (Superfrost
plus, Thermo Scientific, Jerman). Semua slide di-dewax pada 60oC selama 30 menit,
dideparafinisasi dengan xilena dan direhidrasi dalam pengenceran serial alkohol etil dan
kemudian diperlakukan dengan hidrogen peroksida 3% selama 20 menit. Untuk penguraian
antigenic epitop, proses pengambilan antigen dilakukan dengan menggunakan sistem
pressure-cooking dengan cara merendam buffer sitrat (pH: 6.0) sebagai larutan target
pengambilan kedua marka. Setelah pendinginan slide pada suhu kamar, mereka dibilas dalam
tris-buffered saline (TBS) tiga kali. Untuk pewarnaan primer kedua penanda, slide masing-
masing diinkubasi dengan antibodi ALDH1A1 monoklonal rekombinan kelinci (1:200,
semalaman pada suhu 40oC, ab52492; Abcam; USA) dan antibodi CD133 poliklonal kelinci
(1:250, semalam pada suhu 40oC, ab19898; Abcam; AMERIKA SERIKAT). Pewarnaan
sekunder dilakukan dengan menggunakan EnVision TM/HRP, reagen Kelinci/Tikus (Dako;
kode K5007; Denmark; Siap pakai) selama 30 menit dalam kotak basah pada suhu 37oC dan
kemudian divisualisasikan dengan Dako REALTM DAB+ Chromogen (Dako; Denmark)
berbasis pada instruksi pabrik. Setelah dicuci di TBS, slide akhirnya diwarnai dengan
pewarna hematoxylin Mayer (Dako; Denmark) selama 15 menit, dan didehidrasi dalam
pengenceran serial alkohol etil dan dibersihkan dalam xilena.
Sistem Evaluasi dan Skoring Immunostaining
Analisis pencitraan inti CRC TMA untuk ekspresi ALDH1 dan CD133 dilakukan dengan
cara yang dikodekan secara independen oleh dua ahli patologi (M.M. dan M.R.) tanpa
pengetahuan tentang karakteristik klinikopatologis pasien. Perbedaan di antara mereka
diselesaikan dengan konsensus. Persentase pewarnaan ekspresi sitoplasma dan luminal
CD133 dan ALDH1, masing-masing, dinilai sebagai berikut: 1; kurang dari 25%, skor 2; 26-
50%, skor 3; 51-75% dan skor 4; lebih dari 75%. Intensitas pewarnaan dievaluasi
menggunakan sistem semi-kuantitatif, mulai dari yang tidak diwarnai hingga kuat: 0; non-
pewarnaan, 1; pewarnaan lemah, 2; pewarnaan sedang, 3; pewarnaan yang kuat. Hasil skor
histokimia akhirnya dihitung dengan mengalikan intensitas dalam persentase total sel positif
mulai dari 0-300 termasuk kurang dari 100, antara 100-200 dan lebih dari 200.
Analisis statistik
Semua analisis statistik dilakukan dengan menggunakan SPSS versi 22 (SPSS Inc., Chicago,
IL., USA). Perbedaan ALDH1 dan CD133, berdasarkan parameter klinikopatologis yang
berbeda, diperkirakan dengan uji 2 atau uji eksak Fisher, jika sesuai. Perbedaan yang
signifikan secara statistik dianggap sebagai nilai-P<0,05 dan semua statistik disajikan dalam
dua tempat desimal.
HASIL
Karakteristik Klinikopatologi dan Tumor Pasien
Dalam penelitian cross-sectional ini, total 483 pasien, didiagnosis dengan adenokarsinoma
kolorektal, dilibatkan dalam penelitian ini. Dari 483 kasus, 52,4% kasus adalah laki-laki dan
47,6% di antaranya adalah perempuan dengan usia rata-rata 59,12±14,8 (kisaran 23-92 tahun)
pada saat diagnosis. Dari semua pasien, 46,2% berusia 60 tahun dan 53,8% berusia <60
tahun. Hasil patologi menunjukkan bahwa lokasi tumor yang paling umum adalah sigmoid
(164 kasus, 35,5%), dan rektum (129 kasus, 28%). Ukuran rata-rata tumor adalah 5 cm, 324
(67,1%) tumor kurang dari 5 cm dan 159 (32,9%) lebih dari 5 cm. Sel tumor diklasifikasikan
juga, berdiferensiasi sedang dan buruk. Dari semua sampel tumor, terdapat 173 (35,8%) sel
berdiferensiasi baik, 277 (57,3%) berdiferensiasi sedang dan 33 (6,8%) sel adenokarsinoma
berdiferensiasi buruk. Tiga puluh empat (7%) pasien menunjukkan metastasis dan 449 (93%)
kasus tidak memiliki metastasis. Keterlibatan kelenjar getah bening terjadi pada 181 pasien
(37,5%) dan tidak ada pada 302 pasien (62,5%). Invasi saraf diamati pada 97 (20,1%) kasus
dan non-invasi pada 386 (79,9%) kasus dan 74 (15,3%) kasus memiliki invasi vaskular. Ada
84 (17,4%) TNM stadium 1, 208 (43,1%) TNM stadium 2, 168 (34,8%) TNM stadium 3 dan
23 (4,8%) pasien TNM stadium 4. Prevalensi stadium tumor tertinggi adalah 2a (38%).
Korelasi Antara Ekspresi Positif CD133 dan Karakteristik Klinikopatologi CRC
CD133 diekspresikan dalam sitoplasma 358 dan area luminal dari 315 sampel tumor dan
intensitas pewarnaan pada jaringan CRC ditunjukkan pada Gambar 1. Sejumlah sampel
tumor dikeluarkan dari penelitian karena proses penanganan jaringan atau kurangnya tumor
di dalam inti. Ekspresi CD133 sangat bervariasi antara sampel tumor yang berbeda. Dalam
hal intensitas ekspresi, intensitas luminal yang kuat diamati pada 75,9% sampel, dan 42,7%
kasus menunjukkan intensitas sitoplasma yang kuat.
Gambar 1. Pola ekspresi CD133 dalam jaringan CRC. (A) Lemah; (B) Sedang; dan (C)
Intensitas pewarnaan yang kuat.
Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1, ekspresi luminal dan sitoplasma CD133 secara
keseluruhan tidak terkait secara signifikan dengan jenis kelamin, usia, ukuran tumor
(P>0,05). 66,1% sampel yang menunjukkan invasi saraf memiliki ekspresi CD133 yang
tinggi. Ada korelasi yang signifikan antara intensitas luminal ekspresi CD133 dan invasi saraf
(P=0,05). Ekspresi CD133 yang tinggi ditemukan pada 79,4% sampel tumor dengan
keterlibatan kelenjar getah bening. Namun, tidak ada korelasi signifikan yang diidentifikasi
antara ekspresi luminal dan sitoplasma yang kuat dari CD133 dan keterlibatan kelenjar getah
bening. 40% pasien dengan metastasis menunjukkan ekspresi sitoplasma CD133 yang tinggi
dibandingkan dengan 66,7% kasus metastasis dengan ekspresi luminal tinggi yang signifikan
(P=0,05). Intensitas luminal CD133 yang lebih tinggi terdeteksi pada 76,4% sel tumor ganas
yang berdiferensiasi sedang atau buruk dibandingkan dengan sel tumor yang berdiferensiasi
baik (75%). Nilai-nilai ini relatif rendah dalam ekspresi sitoplasma CD133. Tidak ada
hubungan yang signifikan antara ekspresi CD133 luminal dan sitoplasma dan diferensiasi
tumor.
Dalam hal skor-H ekspresi CD133 seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1, 64,6% pria dan
69,3% kasus wanita menunjukkan skor-H tinggi (>200) ekspresi luminal CD133
dibandingkan dengan 33,2% pria dan 26,8% wanita dalam ekspresi sitoplasma CD133. 64.7.
% kasus dengan skor-H lebih tinggi dari 200 memiliki ukuran tumor lebih dari 5cm dan 55%
tumor dengan invasi vaskular memiliki skor-H lebih tinggi (>200) dan 55,4% tumor dengan
invasi saraf menunjukkan skor-H lebih tinggi dari 200. kelenjar getah bening terlibat dalam
73 (68,2%) kasus dengan skor H yang lebih tinggi. Tidak ada hubungan yang signifikan
antara luminal dan sitoplasma H-score CD133 dengan usia, jenis kelamin, ukuran tumor, dan
metastasis (P>0,05). Skor-H luminal CD133 menunjukkan korelasi yang nyata dengan invasi
saraf (P=0,04). Terdapat hubungan bermakna antara skor-H sitoplasma CD133 dengan faktor
klinis meliputi invasi kelenjar getah bening (P=0,02), saraf (P=0,04), dan vaskular (P=0,02).
Tabel 1. Hubungan antara intensitas dan H-score ekspresi CD133 dengan karakteristik
klinikopatologis pada Karsinoma Kolorektal
Patients and
H-score of CD133
tumor P-value Intensity of CD133 expression P-value
expression No. (%)
characteristics
Expression
Low High Negative Weak Moderate Strong
Pattern
Cytoplasmic 250(69.8) 108(30.2) 3(0.8) 77(21.5) 125(34.9) 153(42.7)
Luminal 105(33.3) 210(66.7) 8(2.5) 25(7.9) 43(13.7) 239(75.9)
Age
≥60
Cytoplasmic 130(69.1) 58(30.9) 0.76 1(0.5) 39(20.7) 68(36.2) 80(42.6) 0.86
Luminal 55(32) 117(68) 0.57 4(2.3) 13(7.6) 21(12.2) 134(77.9) 0.82
<60
Cytoplasmic 120(70.6) 50(29.4) 2(1.2) 38(22.4) 57(33.5) 73(42.9)
Luminal 50(35) 93(65) 4(2.8) 12(8.4) 22(15.4) 105(73.4)
Gender
Male
Cytoplasmic 127(66.8) 63(33.2) 0.19 1(0.5) 44(23.2) 60(31.6) 85(44.7) 0.44
Luminal 62(35.4) 113(64.6) 0.37 5(2.9) 16(9.1) 26(14.9) 128(73.1) 0.64
Female
Cytoplasmic 123(73.2) 45(26.8) 2(1.2) 33(19.6) 65(38.7) 68(40.5)
Luminal 43(30.7) 97(69.3) 3(2.1) 9(6.4) 17(12.1) 111(79.3)

Tumor size
≤5
Cytoplasmic 164(68.3) 76(31.7) 0.60 1(0.4) 51(21.3) 82(34.2) 106(44.2) 0.56
Luminal 69(32.4) 144(67.6) 0.71 5(2.3) 17(8) 25(11.7) 166(77.9) 0.52
>5
Cytoplasmic 86(72.9) 32(27.1) 2(1.7) 26(22) 43(36.4) 47(39.8)
Luminal 36(35.3) 66(64.7) 3(2.9) 8(7.8) 18(17.6) 73(71.6)
Vascular
invasion
Yes
Cytoplasmic 41(83.7) 8(16.3) 0.02 1(2) 14(28.6) 20(40.8) 14(28.6) 0.13
Luminal 18(45) 22(55) 0.09 2(5) 2(5) 8(20) 28(70) 0.36
No
Cytoplasmic 209(67.6) 100(32.4) 2(0.6) 63(20.4) 105(34) 139(45)
Luminal 87(31.6) 188(68.4) 6(2.2) 23(8.4) 35(12.7) 211(76.7)
Neural invasion
Yes
Cytoplasmic 53(72.6) 17(23.3) 0.04 1(1.5) 14(21.2) 31(47) 20(30.3)
Luminal 25(44.6) 31(55.4) 0.04 1(1.8) 4(7.1) 14(25) 37(66.1) 0.08
No 0.05
Cytoplasmic 190(57.4) 104(31.4) 2(0.7) 63(21.6) 94(32.2) 133(45.5)
Luminal 80(30.9) 179(69.1) 7(2.7) 21(8.1) 29(11.2) 202(78)
Lymph node
involvement
Yes
Cytoplasmic 53(80.3) 13(19.7) 0.02 1(0.8) 31(23.8) 49(37.7) 49(37.7) 0.53
Luminal 34(31.8) 73(68.2) 0.67 3(2.8) 7(6.5) 12(11.2) 85(79.4) 0.70

No 197(67.5) 95(32.5) 2(0.9) 46(20.2) 76(33.3) 104(45.6)

 Patients and
H-score of CD133
tumor P-value Intensity of CD133 expression P-value
expression No. (%)
characteristics
Cytoplasmic 18(34.1) 137(65.9) 5(2.4) 18(8.7) 31(14.9) 154(74)
Luminal
Metastasis
Yes
Cytoplasmic 18(72) 7(28) 0.80 1(4) 9(36) 5(20) 10(40) 0.05
Luminal 9(42.9) 12(57.1) 0.33 1(4.8) 4(19) 2(9.5) 14(66.7) 0.21
No
Cytoplasmic 232(69.7) 101(30.3) 2(0.6) 68(20.4) 120(36) 143(42.9)
Luminal 96(32.7) 198(67.3) 7(2.4) 21(7.1) 41(13.9) 225(76.5)
Differentiation
Cytoplasmic
Well 97(71.9) 38(28.1) 0.51 0(0) 31(23) 43(31.9) 61(45.2) 0.51
Moderate & Poor 153(68.6) 70(31.4) 3(1.3) 46(20.6) 82(36.8) 92(41.3)
Luminal
Well 44(36.7) 76(63.3) 0.32 1(0.8) 14(11.7) 15(12.5) 90(75) 0.12
Moderate & Poor 61(31.3) 134(68.7) 7(3.6) 11(5.6) 28(14.4) 149(76.4)
Stage
Cytoplasmic
I & II 148(67.6) 71(32.4) 0.24 2(0.9) 46(21) 71(32.4) 100(45.7) 0.52
III & IV 102(73.4) 37(26.6) 1(0.7) 31(22.3) 54(38.8) 53(38.1)
Luminal
I & II 69(34.3) 132(60.7) 0.61 6(3) 18(9) 28(13.9) 149(74.1) 0.70
III & IV 36(31.6) 78(68.4) 2(1.8) 7(6.1) 15(13.2) 90(78.9)

Korelasi Antara Ekspresi Positif ALDH1 dan Fitur Klinikopatologis CRC

Pola ekspresi ALDH1 terutama sitoplasma pada 40% (167/416) tumor TMA (Gambar 2),
sedangkan 60% kasus menunjukkan intensitas pewarnaan negatif. Ekspresi ALDH1 tinggi
dibedakan dalam 4 (2,7%) tumor berdiferensiasi baik, 3 (1,3%) tumor berdiferensiasi sedang
dan tidak ada tumor yang terekspresi tinggi menunjukkan pola berdiferensiasi buruk. Tujuh
kasus dengan metastasis menunjukkan ekspresi ALDH1 yang tinggi. Hanya 1,3%, 2,1% dan
1,7% tumor dengan intensitas pewarnaan yang tinggi masing-masing mengembangkan
kelenjar getah bening, saraf dan vaskular (Tabel 2). Ekspresi ALDH1 (intensitas dan skor-H)
tidak berhubungan bermakna dengan usia, jenis kelamin, kelenjar getah bening, dan invasi
vaskular (P>0,05). Tumor dengan ukuran lebih dari 5 cm menunjukkan skor H lebih tinggi
dari 200 pada 22,5% kasus (Tabel 2). Korelasi positif yang cukup besar ditemukan antara
ukuran tumor dan skor-H ekspresi ALDH1 dalam sel tumor (P=0,001). Korelasi tren
marginal juga diamati antara invasi saraf dan intensitas pewarnaan ALDH1 (P=0,07).
Gambar 2. Pola ekspresi ALDH1 dalam jaringan CRC. (A) Lemah (B) Sedang; dan (C)
Intensitas pewarnaan yang kuat.
Tabel 2. Hubungan antara intensitas dan H-score ekspresi ALDH1 dengan karakteristik
klinikopatologi pada Karsinoma Kolorektal
Patients and
tumor H-score of ALDH1 expression No. (%) P Intensity of ALDH1 expression No. (%) P
characteristics
Expression
<100 100-200 <200 Negative Weak Moderate Strong
Pattern
Cytoplasmic 405(96.9) 11(2.6) 2(0.5) 249(60) 126(30) 34(8) 7(2)
Gender
Male
Cytoplasmic 207(95.4) 9(4.1) 1(0.5) 0.09 126(58) 69(32) 17(8) 4(2) 0.88
Female
Cytoplasmic 196(98.5) 2(1) 1(0.5) 123(61) 57(29) 17(8) 3(2)
Age
23-40
Cytoplasmic 40(95.2) 2(4.8) 0(0) 0.44 19(45.2) 17(40.5) 4(9.5) 2(4.8) 0.11
41-60
Cytoplasmic 170(98.3) 3(1.7) 0(0) 100(57.8) 56(32.4) 16(9.2) 1(0.6)
>60
Cytoplasmic 195(96.1) 6(3) 2(1) 130(64.7) 53(26.4) 14(7) 4(2)
Tumor size
≤5
Cytoplasmic 276(95.8) 2(3.4) 1 (0.8) 0.001 163(59.4) 88(32) 20(7.3) 4(1.5) 0.66
>5
Cytoplasmic 129(93.3) 9(5.9) 1(0.8) 82(60.7) 37(27.4) 13(9.6) 3(2.2)
Vascular
invasion
Yes
56(96.6) 2(3.4) 0(0) 0.75 36(62.1) 15(25.9) 6(10.3) 1(1.7) 0.85
Cytoplasmic
No
339(96.9) 9(2.6) 2(0.6) 207(59.5) 107(30.7) 28(8) 6(1.7)
Cytoplasmic
Neural invasion
Yes
Cytoplasmic 79(98.6) 1(1.4) 0(0) 0.79 53(72.6) 17(23.3) 3(44.1) 0(0) 0.07
No
Cytoplasmic 326(96.4) 10 (3) 2(0.6) 190(57.4) 104(31.4) 30(9.1) 7(2.1)
Lymph node
involvement
Yes
82(97.1) 3(2.1) 1 (0.8) 0.88 82(54.3) 53(35.1) 14(9.3) 2(1.3) 0.32
Cytoplasmic
 No
256(96.6) 7(2.6) 1(0.8) 166(26.9) 73(27.7) 20(7.6) 5(1.9)
Cytoplasmic
Metastasis
Yes
Cytoplasmic 31(95.8) 1(4.2) 0(0) 0.55 16(66.7) 7(29.2) 1(4.2) 0(0) 0.93
No
Cytoplasmic 374(96.8) 10(2.6) 2(0.5) 225(59.8) 122(29.8) 32(8.5) 7(1.9)
Differentiation
Cytoplasmic
Well 140(94.6) 7(4.8) 1(0.7) 0.33 82(56.2) 45(30.8) 15(10.3) 4(2.7) 0.61
Moderate 237(97.9) 4(1.7) 1(0.4) 145(61.2) 73(30.8) 16(6.8) 3(1.3)
Poor 28(100) 0(0) 0(0) 18(66.7) 6(22.2) 3(11.1) 0(0)

Korelasi Antara Ekspresi CD133/ALDH1 dan Karakteristik Klinikopatologi CRC

Hubungan antara ekspresi CD133 dan ALDH1 imunohistokimia diukur dalam 283 kasus
yang cocok menggunakan chi-square Pearson. Hubungan timbal balik yang signifikan
ditemukan antara ekspresi CD133 dan ALDH1 (P<0,001). Berdasarkan analisis gabungan,
ekspresi CD133/ALDH1 dibagi menjadi 4 fenotipe, antara lain CD133-Tinggi/ALDH1-
Tinggi (8,8%) menunjukkan ekspresi tinggi dari kedua penanda, CD133-Rendah/ALDH1-
Rendah (8,8%) menunjukkan ekspresi rendah dari kedua penanda. CD133-Tinggi/ALDH1-
Rendah (81,3%), dan CD133-Rendah/ALDH1-Tinggi (1,1%). Korelasi antara fenotipe
CD133/ALDH1 dan karakteristik klinikopatologis pasien CRC dievaluasi menggunakan
ANOVA satu arah dan analisis post hoc Tukey (Tabel 3). Korelasi positif yang nyata hanya
diamati antara fenotipe CD133-Tinggi/ALDH1-Rendah dan invasi saraf yang menunjukkan
bahwa fenotipe ini lebih dominan pada pasien CRC dibandingkan dengan fenotipe lain
(P=0,037).
Tabel 3. Hubungan Fenotip CD133/ALDH1 dengan Karakteristik Klinikopatologi pada
Karsinoma Kolorektal
CD133/ALDH1 phenotypes
Patients and tumor
P
characteristics
CD133High/ CD133Low/ALDH CD133High/ CD133Low/
ALDH1High 1Low ALDH1Low ALDH1High
Gender
Male 13(8.3) 17(10.9) 125(80.1) 1(0.6) 0.49
Female 12(9.4) 8(6.3) 105(82.7) 2(1.6)
Age
≤60 14(9.4) 13(8.7) 121(81.2) 1(0.7) 0.90
>60 11(8.2) 12(9) 109(81.3) 2(1.5)
Tumor size
≤5 14(7.3) 16(8.3) 160(82.9) 3(1.6) 0.32
>5 11(12.2) 9(10) 70(77.8) 0(0)
Vascular invasion
Yes 4(12.1) 2(6.1) 27(81.8) 0(0) 0.76
No 21(8.4) 23(9.2) 203(81.2) 3(1.2)
Neural invasion
Yes 0(0) 1(2.3) 42(95.5) 1(2.3) 0.03
No 25(10.5) 24(10.1) 188(78.6) 2(0.8)
Lymph node involvement
Yes 9(9.4) 7(7.3) 80(83.3) 0(0) 0.56
No 16(8.6) 18(9.6) 150(80.2) 3(1.6)
Metastasis
 Yes 1(5.6) 2(11.1) 15(83.3) 0(0) 0.90
No 24(9.1) 23(8.7) 215(81.1) 3(1.1)
Differentiation
Well 11(10.2) 9(8.3) 85(78.7) 3(2.8) 0.14
Moderate & Poor 14(8) 16(9.1) 145(82.9) 0(0)

PEMBAHASAN
Kanker kolorektal adalah salah satu kanker viseral paling umum dan penyebab utama
kematian di seluruh dunia (27). Meskipun tren proses diagnostik dan terapeutik membaik,
sebagian besar pasien CRC mengalami penyakit prognostik yang buruk yang sering
dimanifestasikan oleh resistensi obat, kekambuhan, dan metastasis (30). Diyakini bahwa
kanker dapat diatur secara bertahap oleh CSC mereka sendiri sebagai sub-populasi sel kanker
yang langka dan kecil dengan potensi menyebabkan metastasis dan kekambuhan (42-45).
Beberapa penelitian telah dilakukan dalam hal ini untuk mengidentifikasi penanda spesifik
untuk CRC CSC tetapi masih ada kontroversi mengenai penanda khusus untuk membedakan
populasi CSC yang berbeda (12, 18, 32, 46). Oleh karena itu, penemuan penanda CSC yang
lebih tepat akan membantu dalam diagnosis dini, klasifikasi prognostik dan terapi CRC yang
ditargetkan dengan baik dan untuk meningkatkan prognosis melalui metastasis dan
pencegahan kekambuhan lokal. Studi saat ini dilakukan untuk menilai pola ekspresi CD133
dan ALDH1 sebagai penanda sel induk kanker diduga di CRC menggunakan teknik TMA
dan IHC di antara populasi Iran untuk pertama kalinya. Kami menunjukkan peningkatan
ekspresi CD133 di sebagian besar sampel tumor CRC dibandingkan dengan ALDH1.
Kelenjar getah bening, vaskular, dan invasi saraf lebih sering terjadi pada kasus dengan
ekspresi CD133 yang lebih tinggi daripada kasus dengan ekspresi CD133 negatif atau rendah,
yang secara statistik signifikan (P<0,05). Sejalan dengan temuan kami, metaanalisis
berdasarkan 37 penelitian melaporkan peningkatan ekspresi CD133 di CRC sebagai faktor
prognostik yang buruk pada pasien CRC dan itu berkorelasi positif dengan invasi limfatik
dan vaskular, metastasis jauh, dan tumor kategori T (47) . Li dan rekan menunjukkan bahwa
peningkatan persentase sel tumor positif CD133 dikaitkan dengan prognosis buruk pada
pasien CRC dengan stadium yang lebih tinggi (48). Kami mengamati overekspresi CD133
pada kasus CRC dengan stadium lanjut (III & IV) tetapi perbedaannya tidak signifikan secara
statistik (P>0,05). Sebaliknya, penelitian lain melaporkan korelasi antara tahap awal (stadium
I) dan hasil yang lebih buruk pada pasien CRC sebagai faktor prediktor yang kuat (49).
Mengenai pola ekspresi CD133, teknik imunohistokimia telah diterapkan dalam berbagai
penelitian untuk menunjukkan bahwa CD133 terutama diekspresikan pada permukaan
luminal dan membran sel tumor (47-54), sementara penelitian lain mendeteksi bahwa CD133
dapat diekspresikan baik pada sitoplasma dan membran sel tumor. sel tumor (44, 55).
Perbedaan signifikansi klinikopatologis penanda sel induk tumor termasuk CD133 sebagian
besar dipengaruhi oleh pola ekspresi penanda ini. Transisi epitel ke mesenkim (EMT) dan
akhirnya fenotipe invasif dan metastatik sangat terkait dengan pergeseran sitoplasma ke
membran dalam lokalisasi CD133 (49). Ekspresi CD133 pada permukaan luminal kelenjar
tumor CRC telah dilaporkan sebagai penanda prediktif independen CRC (55). Temuan IHC
kami mengungkapkan bahwa CD133 terutama terletak di permukaan luminal sebagian besar
sampel tumor (66,7% sebagai skor-H dan 75,9% sebagai intensitas pewarnaan) yang secara
signifikan berkorelasi dengan invasi saraf CRC (P<0,05). Kojima dkk. melaporkan ekspresi
luminal dan sitoplasma CD133 pada kanker kolorektal terutama pada tumor yang
berdiferensiasi baik dan sedang tetapi tidak dalam bentuk yang berdiferensiasi buruk yang
secara signifikan berkorelasi dengan metastasis jauh (56). Kami mengamati ekspresi CD133
tidak hanya pada tumor yang berdiferensiasi baik dan sedang, tetapi juga pada sel yang
berdiferensiasi buruk yang berkorelasi dengan metastasis (P<0,05). Hasil ini konsisten
dengan penelitian Horst et al., yang menemukan ekspresi CD133 pada permukaan luminal
kelenjar CRC dengan pelepasan lumina sebagai penanda prediksi prognosis buruk (57).
ALDH1 adalah sejenis enzim detoksifikasi dan penanda CSC potensial telah dikenali pada
kanker yang berbeda termasuk kepala dan leher (30) dan payudara (58) dan beberapa
penelitian telah berfokus pada signifikansi prognostiknya pada kanker yang berbeda (30).
Peningkatan proliferasi sel dan kapasitas invasi telah dikaitkan dengan peran ALDH1 dalam
karakteristik CSC dan fitur biologis tumor (58, 59). Zhou dan rekan telah menunjukkan
hubungan antara ekspresi tinggi ALDH1 dan hasil yang buruk pada pasien CRC tetapi tidak
berkorelasi dengan invasi kelenjar getah bening dibandingkan dengan CD133 (59). Lugli
dkk. melaporkan tidak ada korelasi antara ekspresi ALDH1 dan kelangsungan hidup (59).
Mereka mendeteksi ekspresi ALDH1 yang tinggi hanya pada 23,3% kasus CRC tanpa
perbedaan dalam tingkat kelangsungan hidup (30). Meskipun sejumlah besar penelitian telah
menyelidiki peran ekspresi ALDH1 pada hasil pasien CRC, kontroversi mengenai
signifikansi prognostik ALDH1 masih tetap ada. Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian
lebih lanjut untuk mencapai kesimpulan yang pasti. Studi kami menunjukkan bahwa penanda
ALDH1 CSC hanya diekspresikan secara berlebihan pada 40% pasien CRC yang sebagian
konsisten dengan temuan studi Lugli (60). Temuan signifikan lebih lanjut dari penelitian ini
adalah bahwa tumor yang berdiferensiasi baik dan sedang memiliki ukuran tumor yang lebih
kecil dan menunjukkan ekspresi ALDH1 yang lebih rendah dalam hal skor-H dibandingkan
dengan tumor berdiferensiasi buruk yang signifikan secara statistik (P = 0,001). Sementara
itu, sebuah studi meta-analisis tentang nilai prognostik ALDH1, sebagai penanda sel induk
kanker menunjukkan bahwa ALDH1 diekspresikan dalam tingkat yang berbeda di antara
berbagai populasi pasien CRC (18). Namun demikian, perbedaan antara derajat ekspresi
penanda CSC dan mekanisme rumitnya belum jelas. Liu dkk. (2014) menduga ada perbedaan
pola ekspresi ALDH1 dan signifikansi prognostiknya antara orang barat dan timur (61). Chen
dan rekan secara sistematis meninjau populasi besar pasien dari negara barat dan timur dan
menyimpulkan bahwa tingkat ekspresi ALDH1 lebih tinggi di antara populasi barat (52%)
dibandingkan dengan tingkat ekspresi yang rendah di antara populasi timur (39%).
Karena sel CRC yang mengekspresikan salah satu penanda CSC diduga menunjukkan
tumorigenisitas tinggi terutama dalam kombinasi dengan penanda CSC lainnya (62),
penilaian penanda gabungan dapat membantu dalam memahami karakteristik tumor dengan
lebih baik daripada yang dipertimbangkan secara individual. Co-ekspresi CD133 dan ALDH1
telah terlihat pada berbagai sel tumor, termasuk kanker paru-paru (61) dan lambung yang
terlibat dalam invasi tumor, metastasis dan prognosis pasien yang buruk (62). Oleh karena
itu, kami menilai signifikansi prognostik dari kombinasi fenotipe CD133/ALDH1 dengan
faktor klinikopatologis di CRC. Analisis kami mengungkapkan bahwa fenotipe CD133Tinggi
/ ALDH1Rendah lebih sering terjadi pada tumor CRC daripada fenotipe gabungan lainnya.
Ada juga korelasi positif yang signifikan antara fenotipe ini dengan invasi saraf tumor.
Mempertimbangkan perbedaan derajat ekspresi penanda CSC pada beberapa keganasan dan
perbedaan antara berbagai populasi dan lokalisasi penanda, dapat disimpulkan bahwa fenotip
CD133Tinggi/ALDH1Rendah dapat memberikan perilaku progresi tumor pada pasien CRC.
KESIMPULAN
Deteksi gabungan CD133 dan ALDH1, sebagai penanda terkait CSC, kemungkinan akan
berharga dalam memahami signifikansi klinikopatologis dan prognostiknya pada CRC. Lebih
lanjut, klasifikasi pasien dalam fenotipe ekspresi gabungan dari penanda CSC diduga dapat
diidentifikasi sebagai terapi bertarget yang tepat sesuai dengan subkelompok pasien CRC
yang berbeda dan dengan demikian manajemen perkembangan tumor, terutama pada kasus
lanjut.