TUGAS ENZIMOLOGI

Isolasi dan aktivitas nitrogenase vesikel dari Frankia SP. strain EANlpec

Oleh:

Kelompok : 2 (Dua

Anggota Kelompok : 1. Azizah

2. Azizah Munita
3. Alfina Yuliana
4. Rendi Ananda

Dosen : Drs.Iswendi, M.Si

JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI PADANG
2020
CARA MENGISOLASI ENZIM DARI MIKROORGANISME

1. PERSIAPAN SAMPLE
Kultur tumbuh dan dipelihara dalam medium pertumbuhan basal dengan NH4Cl

Budaya batch largescale diperoleh dengan sel tumbuh pada 25 ' C selama 21 hari di carboy
dengan 15 liter ofmedium yang mengandung 20 mM Suksinat dengan sumber nitrogen
terbatas (0,5 mM NH4Cl).

Aliran udara konstan menggelitik melalui budaya, yang gelisah dengan pengaduk magnet.

Suksinat segar (konsentrasi akhir, 2,0 mM) ditambahkan ke budaya 2 hari sebelum panen.

Sel dipanen oleh sentrifugasi dan digunakan segera atau disimpan dalam nitrogen cair.

Sel habis pasokan awal NH4 pada sekitar 7 sampai 8 hari dan tumbuh dengan N2 sebagai
sumber nitrogen ketika dipanen.

2. INDUKSI VESICLE.
Untuk menginduksi perkembangan vesikle dan aktivitas nitrogenase
sel dipanen setelah 14 hari pertumbuhan media yang mengandung 5,0 mM NH4Cl

dicuci tiga kali dengan buffer yang mengandung asam morpholinepropanesulfonic 20 mM

(MOPS) dan 10 mM KH2PO4 buffer pada pH 6,8.

Sel yang dicuci diinokulasi menjadi medium pertumbuhan yang kekurangan sumber nitrogen
gabungan dan diininasi selama 4 hari pada 25 ° c.

Medium pertumbuhan mengandung 20 mM fruktosa atau Suksinat sebagai sumber karbon.

3. TEKNIK ANAEROBIK.
Untuk memastikan teknik anaerobik,
botol disegel dengan sumbat neoprene diadakan di tempat dengan topi Crimp.

Tabung Centrifuge disegel dengan topi yang mengandung Septa karet.

Tabung, buffer, dan larutan yang dipicu dengan gas N2 selama 15 menit sebelum menyegel.

Wadah yang disegel dievakuasi dan diberi regassed dengan Argon beberapa kali.

Gas yang digunakan dimurnikan dengan melewati mereka melalui katalis tembaga dipanaskan
hingga 180 ° c, dan dalam beberapa kasus, 1,0 mm natrium dithionite

ditambahkan secara dihancurkan ke buffer dan solusi lain sebagai perlindungan tambahan
terhadap paparan
terhadap 02to mentransfer solusi dihancurkan, 18- mengukur jarum dan alat suntik yang
memerah beberapa kali dengan gas Argon atau dibilas dengan buffer anaerobik yang
mengandung dithionite sebelum digunakan.

4. ISOLASI DAN PEMURNIAN VESICLE.

Semua prosedur dilakukan secara anaerobically.

Sel yang baru dipanen atau beku ditempatkan di bawah atmosfer Argon dan dicuci dua kali

5. AKTIVITAS NITROGENASE FRANKIA VESICLES 5055

kali dengan 25 mM Tris hydrochloride-0,5 M mannitol-10 mM sodium dithionite buffer, pH
7,4 (TMD buffer), di 200C.
Sel tersebut kemudian dilewati melalui sel tekanan Perancis pada 10.000 hingga 12.000
lb/IN2 pada 40C di bawah atmosfir Argon.
 Pemeriksaan mikroskopis mengungkapkan gangguan hampir lengkap dari mycelia tanpa
kerusakan jelas pada vesikel.

Suspensi sel puing dan vesikel disentrifugasi pada 6.000 x g selama 5 menit pada 20 ° c.

Fraksi pelet yang mengandung semua vesikel dan beberapa puing sel ditangguhkan di TMD
buffer oleh pusaran pencampuran untuk 30 s.

Suspensi ini disentrifugasi di 3.000 x g selama 5 menit pada 200C.

Pecahan pelet yang mengandung vesikel dan sejumlah kecil serpihan sel ditangguhkan dalam
buffer TMD dan disentrifugasi pada 1.000 x g selama 5 menit pada 20 ° c.

Vesikel yang pelet kemudian diresuspended seperti di atas dan disentrifugasi pada 400 x g
selama 4 menit pada 20 ° c.
Vesikel yang berpelet sepenuhnya bebas dari serpihan sel atau mycelia yang utuh.

Untuk beberapa percobaan, vesikel dimurnikan lebih lanjut oleh gradien kerapatan isopycnic
sentrifugasi dalam 0 sampai 100% Linear Gradient dari Renografin (E. R. Squibb & Sons)
dalam sebuah rotor SORVALL HB-4 di 20.000 x g untuk 60 menit di 200C.

6. NITROGENASE ASSAY.
Aktivitas nitrogenase diukur oleh assay pengurangan asetilena.
Aktivitas sel utuh terassayed pada tekanan parsial atmosfer oksigen dengan mentransfer
sampel 1,0-ml sel tumbuh N2 ke dalam botol serum (volume total, 8,0 ml).

Vial disegel dengan stopper serum, asetilena ditambahkan ke konsentrasi akhir 10%
(Vol/Vol),

dan campuran reaksi diintuasi pada 250C dengan gemetar konstan.

 Pada interval waktu yang berbeda, sampel telah dihilangkan untuk dianalisis dengan
kromatograf gas untuk menentukan jumlah etilena yang dihasilkan.

Nanomoles etilena diproduksi per waktu unit yang standar untuk sel berat kering atau sel
Total protein.

Vesikel terisolasi adalah diuji anaerobicaily untuk aktivitas nitrogenase. Kecuali dinyatakan
lain, vesikel terisolasi dipasok dengan sistem ATP-

Regenerating yang terdiri dari 2,5 mm ATP, 5,0 mm MgCl2, 30 mm creatine fosfat, 0,2 mg
creatine phosphokinase per ml, dan 25 mm Tris hidroklorida buffer, pH 7,4.

Botol serum (volume total, 8,0 ml) berisi 0,6 ml sistem ATP-Regenerating,

0,1 ml dari 1,0 M natrium dithionite dilarutkan dalam 0,13 N NaOH (konsentrasi akhir, 100
mM dithionite), asetilena pada konsentrasi akhir 10% (Vol/Vol), dan 0,3 ml vesikel terisolasi.

Botol itu diininilasi pada 25 ° c dengan gemetar kecuali dinyatakan lain.

Pada interval waktu yang berbeda, sampel telah dihapus untuk analisis nitrogenase seperti
yang dijelaskan di atas.

7. 7. LYSOZYME PENCERNAAN.
Seluruh sel dicuci dua kali di bawah kondisi anaerobik dengan buffer TMD,

resuspended di TMD dengan 125, g lisozim per ml, dan diinkuatkan pada suhu kamar untuk 3
jam

8. GANGGUAN SONIK.
 Seluruh sel dicuci dua kali di bawah kondisi anaerobik dengan buffer TMD dan terganggu
oleh sonikasi selama 3 sampai 5 menit di bawah aliran gas nitrogen konstan dengan
menggunakan model Braun 350 sonifier pada pengaturan daya dari 3 dengan probe microtip.

Tabung Centrifuge yang mengandung sel yang terganggu kemudian disegel dan digulingkan
dengan Argon.

9. GANGGUAN MANIK KACA.

Vesikel rusak secara dihancurkan oleh agitasi dengan butiran kaca dengan menggunakan
prosedur yang dimodifikasi dari Van Etten dan Freer (22).

Manik kaca asam-dicuci (100 PUM diameter) ditempatkan dalam tabung gelas, memerah
dengan Argon,

dan dicuci dua kali di bawah kondisi anaerobik dengan TMD mengandung 1,0 mM
dithiothreitol.

Vesikel ditambahkan dihancurkan (2,0 g butiran manik kaca per 1,0 ml),

dan campuran itu gelisah dengan mixer Vortex (The Vortex Manufacturing Co) dengan
menggunakan 10-untuk 20-s periode agitasi bersela dengan 30 s pendinginan di es, selama
periode total 3 sampai 5 menit.

Setelah periode menunggu 5 menit untuk memungkinkan manik untuk menetap, fraksi
supernant telah dihapus dengan-jarum suntik.

Butiran kaca digantung pada penyangga TMD dingin dan dibiarkan mengendap, dan cairan
supematant dikumpulkan dengan fraksi sebelumnya.
10. STUDI PERNAPASAN.
Konsumsi oksigen oleh vesikel terisolasi dan seluruh sel diukur dengan elektroda oksigen
Clarke pada 25 ° c.

The 2,0-ml sampel sel atau suspensi vesikula ditangguhkan dalam pertumbuhan,

Medium kurang sumber karbon dicampur dengan kecil (3-mm-panjang) mengaduk magnet.

11. PENGUKURAN EKSTRAKSI ASAM NUKLEAT.

Total kandungan asam nukleat dari vesikel terisolasi dan seluruh sel ditentukan dengan
mengukur A260 setelah ekstraksi dengan asam perklorat panas.

Kandungan DNA Total ekstrak ini diukur dengan assay Diphenylamine .

12. ASSAYS ENZIM.

Ekstrak mentah untuk tes enzim disiapkan dari vesikel terisolasi,

fraksi Mycelial sel N2-tumbuh, dan NH4 +-tumbuh seluruh sel.

Vesikel rusak oleh agitasi dengan butiran kaca seperti yang dijelaskan sebelumnya.
Seluruh sel yang terganggu oleh perjalanan melalui sel tekanan Perancis di 10.000 lb/IN2.

Sel yang terganggu dan vesikel disentrifugasi pada 20.000 x g selama 20 menit untuk
menghilangkan serpihan sel, dan cairan supernant digunakan untuk assays enzim.

Aktivitas isocitrate dehidrogenase dan Malate dehidrogenase ditentukan secara

spektrofotometrically seperti yang dijelaskan sebelumnya (15).

13. VESICLE ANGKA.

Sampel sel disonikasi selama 30 s dalam model Braun 350 sonifier pada pengaturan daya 3
dengan probe microtip.
 Perlakuan ini mengganggu rumpun dari mycelia kusut dan memisahkan beberapa vesikel dari
mycelia.

Jumlah vesikel dihitung dengan menggunakan ruang penghitungan Petroff-Hausser dengan

mikroskop Phase-contrast pada pembesaran x400.

14. PENENTUAN BERAT KERING.

Sampel dikumpulkan pada filter membran Tare (tipe ha, 0,45, ukuran pori; Millipore Corp.).

Filter kemudian ditempatkan dalam hidangan Petri di atas desiccant dan dikeringkan pada 90
° c untuk berat konstan.

15. PENENTUAN TOTAL PROTEIN.

Sampel disolubilisasi oleh pemanasan selama 15 menit pada 90 ° c di 1,0 N NaOH.

Total protein diukur dengan prosedur Bradford