METODE

1. Capillary Electrophoresis
Elektroforesis zona kapiler (CZE) telah diterapkan untuk menentukan EA dan beberapa epimer
menggunakan β- dan γ-siklodekstrin, urea dan poli (vinil alkohol) dalam buffer fosfat pada pH
2,5 dengan kapiler silika-menyatu pada 25 kV. Pemisahan yang baik dapat diterima, tetapi untuk
sejumlah alkaloid yang minimal. Metode deteksi UV dan fluoresensi dapat digunakan untuk
metode deteksi. CZE telah digunakan untuk menentukan asam lisergat, asam iso-lisergat dan
asam paspalat terkait dalam campuran reaksi. Metode ini dibuat kompatibel dengan deteksi
spektrofotometri massa Time of Flight (TOF) serta UV dengan mengoptimalkan running
background electrolytes (BGEs) yang terdiri dari metanol dengan asparagin, natrium tetraborat,
atau amonium asetat pada pH basa. LOD di bawah 0,5 mg · L-1 dengan deteksi UV dan di bawah
0,1 mg · L-1 dengan TOF. LoD ini lebih rendah dari LoD metode berbasis LC-MS / MS.

2. Gas Chromatography-Mass Spectrometry

Ergopeptida tidak mudah menguap dan rentan terhadap panas, oleh karena itu metode
kromatografi gas tidak bisa digunakan di EA secara langsung. Namun GC-MS dapat diterapkan
untuk analisis amida asam lisergat dan klavin dengan berat molekul rendah mengikuti reaksi
kimia (derivatisasi) untuk meningkatkan volatilitas dan stabilitas dengan memblokir kelompok
kutub. Turunan Trifluoroacetyl (TFA) dari LSD dan iso-LSD disiapkan dengan memanaskan
sampel kering dengan trifluoroacetic anhydride atau dengan trifluoroacetylimidazole pada 70–
80 ° C selama sekitar 30 menit. Turunan N-Trimethylsilyl (TMS) dibuat dengan cara yang sama
dengan memanaskan sampel kering dengan N, O-bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide (BSTFA)
yang mengandung 1% trimethylchlorosilane (TMCS), atau dengan
methyltrimethylsilyltrifluoroacetamide (MSTFA). Campuran reaksi dari masing-masing prosedur
derivasi ini dapat diinjeksikan langsung ke GC. Turunan TFA dari iso-LSD dan LSD menjadi coelute
sampai batas tertentu, membuat identifikasi dan kuantifikasi menjadi sulit ketika keduanya ada.
Namun, turunan TMS diselesaikan secara baseline. Untuk contoh penentuan LSD dengan GC-MS
pembaca dirujuk ke publikasi yang relevan.
Metode GC-MS mencakup ionisasi dampak elektron (EI) di mana sejumlah ion fragmen
berada dihasilkan dari analit terionisasi, dan metode tandem (GC-MS / MS) di mana ionisasi
kimia (CI) dalam mode positif atau negatif digunakan untuk memberikan ion molekul yang kuat
yang kemudian terfragmentasi dengan tumbukan untuk memberikan lebih sedikit ion spesifik
dengan intensitas tinggi. GC-MS dalam mode EI dari turunan TMS dari LSD dan nor-LSD
menghasilkan ion yang sesuai untuk sistem pemantauan ion (SIM) yang dipilih berikut ini nilai
m / z: LSD-TMS: m / z 395, 293, 268 dan 253; nor-LSD-TMS: m / z 381, 279 dan 254. Namun
disosiasi yang disebabkan oleh teknik GC-MS / MS memberikan sensitivitas yang jauh lebih besar
yang dikombinasikan dengan kesempatan untuk mengkonfirmasi identitas puncak. Jalur
fragmentasi dalam GC-MS / MS telah dilaporkan secara rinci. Ionisasi kimia digunakan dalam
percobaan MS / MS karena menghasilkan lebih banyak ion prekursor kuat daripada ionisasi
elektron karena fragmentasi jauh berkurang.
Fragmentasi ion-ion negatif amonia dan ion prekursor CI metana dari LSD dan N-
demethyl-LSD sebagai turunan TFA dan juga fragmentasi CI ion positif dari TMS mereka derivatif
telah dibandingkan [48]. Turunan TFA dari LSD, iso-LSD dan standar referensi lysergic acid
methylpropylamide (LAMPA) terutama kehilangan fragmen 97 mu, sesuai dengan kehilangan
 trifluoroasetil dari posisi N-1 dengan hanya perbedaan kecil dalam ion produk relative
kelimpahan. Sinyal pada m / z 404 (hilangnya trifluoroacetyl) adalah 10-20 kali lipat lebih tinggi
untuk turunan TF dari N-demethyl-LSD daripada sinyal yang sesuai untuk LSD (m / z 322),
memungkinkan N-demetil-metabolit akan diukur pada tingkat yang lebih rendah, biasanya turun
hingga 50 pg / mL dalam urin. Untuk Namun turunan TMS senyawa induk dapat dideteksi pada
tingkat yang lebih rendah daripada N-demetil-LSD, mungkin karena derivasi yang tidak efisien
dari yang terakhir. Eliminasi utama dari disosiasi LSD terprotonasi dan LSD-TMS melibatkan
hilangnya radikal CH3, CH3NH2, CH2NCH3, dietilamina, dietilformamida ((CH3 – CH2) 2NCHO),
dan N-dietilpropenamat dari protonat ion molekuler.

3. Liquid Chromatography
Kromatografi berbasis fase terbalik selalu digunakan untuk pemisahan EA. Sebagian besar
metode digunakan sistem pelarut campuran metanol-air atau asetonitril-air dengan tambahan
amonium hidroksida, amonium karbonat, amonium karbamat atau trietilamina untuk
memberikan kondisi pH basa. Pemisahan dapat dicapai dengan fase gerak isokratik dan gradien.
Fase seluler alkali adalah disukai untuk menjaga stabilitas kedua epimer, untuk menghindari
protonasi dan untuk meningkatkan pemisahan. Itu enam alkaloid C. purpurea utama dan
epimernya dapat dengan mudah dipisahkan dengan kinerja tinggi LC dalam waktu singkat,
dengan masing-masing ergopeptine terelusi tepat sebelum yang sesuai ergopeptinines dalam
fase gerak alkalin. Epimer α- dan β- dari ergocryptinine, dan pasangannya β-ergocryptine dan
ergocristine tidak selalu terpisah meskipun dengan deteksi LC-MS / MS ergocryptine dan
ergocristine dapat dibedakan berdasarkan massa yang berbeda. Penting untuk menginjeksikan
sampel ke dalam larutan dalam pelarut dengan komposisi yang mirip dengan fase gerak awal
sebagai pelarut sampel yang lebih polar daripada fase gerak dapat menyebabkan distorsi puncak
kromatografi [37]. Oleh penggunaan kromatografi cair kinerja ultra-tinggi (UPLC) waktu
menjalankan kromatografi adalah 5 menit.

4. Ultraviolet and Fluorescence Detection

5. Mass Spectrometry
1. Pengantar
Dalam teknik ini, alkaloid yang dipisahkan secara individual oleh HPLC diionisasi dalam
antarmuka electrospray (ESI) untuk menghasilkan ion molekuler terprotonasi yang dibuat untuk
bertabrakan dengan molekul gas untuk menginduksi fragmentasi menjadi "ion produk"
bermuatan lebih lanjut yang dapat dipisahkan dan diidentifikasi di tahap deteksi akhir. EA lebih
mudah terionisasi dalam antarmuka semprotan listrik sumber spektrometri massa daripada di
ionisasi kimia tekanan atmosfer alternatif (APCI) karena sifat polar mereka. Operasi dalam mode
ESI-positif (ESI +) biasanya memberikan ion yang lebih kuat (ion molekul terprotonasi [M + H] +)
daripada ion molekul yang terdeprotonasi ([M − H] -) yang diperoleh dalam mode ESI-negatif
(ESI-). Seperti halnya protonasi (secara formal, hasil tambahan proton) ionisasi MS sering
disertai dengan pembentukan hasil adisi dengan kation lain seperti natrium [M + Na] + yang ada
dalam fase gerak air dan / atau komponen amonium [M + NH4] + buffer. Namun dalam ionisasi
EA hasil adisi ini memiliki intensitas yang lebih rendah dibandingkan dengan ion molekuler
terprotonasi. Metode canggih digunakan untuk mengidentifikasi fragmen dan alkaloid utuh yang
tidak diketahui. Ion utama dihasilkan oleh fragmentasi EA penting telah diidentifikasi dengan
cukup baik menggunakan eksperimen fragmentasi bertahap (MSn) di LC-MS / MS, dan
strukturnya telah dijelaskan.
Dalam analisis kuantitatif, pemilihan dan pemantauan ion fragmen yang relatif intens
dan spesifik dalam LC-MS / MS digunakan untuk mengkonfirmasi identitas EA, dan
mengonfirmasi kuantifikasi. Ion molekuler terprotonasi atau terdeprotonasi digunakan untuk
proses penghitungan primer karena biasanya paling intens. Rasio ini untuk ion fragmen yang
dipilih (ion transisi) memberikan konfirmasi bila dibandingkan dengan rasio standar. Jika rasio ini
tidak sesuai, dalam toleransi tertentu, dengan rasio yang diperoleh untuk standar otentik, maka
ini menunjukkan: bahwa putative peak bukan EA itu, atau bahwa puncak LC juga mengandung
zat pengganggu lainnya; dan karena itu penghitungannya patut dicurigai.
Spektrometri massa Time of Flight adalah metode deteksi untuk LC (LC-TOF-MS) yang
memberikan resolusi massa sangat tinggi (> 20.000) dan dengan demikian memberikan tingkat
kebisingan latar yang rendah dan tinggi yang terkait. sensitivitas sebagai sinyal yang lebih baik:
rasio kebisingan. Keuntungan lebih lanjut dari metode ini adalah bahwa perolehan data tidak
ditargetkan (seluruh rentang massa dipantau dan dicatat tidak seperti beberapa massa terpilih
yang dipantau dalam LC-MS / MS) sehingga informasi spektral untuk sejumlah besar senyawa
dapat diekstraksi dari satu operasi LC. Karena semua data massa direkam maka teknik ini
memiliki keuntungan tambahan yaitu file dapat diperiksa secara retrospektif dalam mode
penemuan, untuk mencari EA baru, metabolit atau zat lain yang bahkan tidak terpikirkan sejak
awal. Metode ini agak kurang sensitif dibandingkan metode MS / MS dan dengan demikian
hanya terlihat sedikit penerapannya dalam penentuan EA saat ini. Namun, dengan
menggunakan spektrometer massa quadrupole-time-of-flight mass spectrometer (LC-QTOF-MS)
beberapa percobaan MS / MS (MSn) dapat dilakukan untuk memberikan spesifisitas, sensitivitas
dan detail yang lebih tinggi. hasil. Rouah-Martin dkk.

2. Efek Matriks
Deteksi spektrometri massa yang mengikuti LC khususnya rentan terhadap perubahan intensitas
sinyal yang disebabkan oleh adanya senyawa yang diekstraksi bersama dalam instrumen — yang
disebut efek matriks. Senyawa turunan matriks dapat mempengaruhi efisiensi ionisasi dalam LC-
MS, yang mengarah ke peningkatan sinyal, atau biasanya penekanan. Masalah ini dapat diatasi
sampai batas tertentu dengan menggunakan standar kalibrasi yang disiapkan dalam matriks
yang diekstraksi dari sampel "kosong" (kalibrasi pencocokan matriks) tetapi pengoptimalan
ekstraksi dan pembersihan memiliki peran penting. Efek matriks dapat dikompensasikan untuk
sebagian besar dengan menggunakan standar internal berlabel isotop tetapi harus hati-hati
karena interferensi dapat dengan mudah memengaruhi respons untuk nilai m / z dari suatu
analit tetapi tidak dengan nilai m / z yang sedikit berbeda analog berlabel isotop.

Dafpus

Colin Crews. 2015. Analysis of Ergot Alkaloids. UK : Fera Science Ltd., Sand Hutton, North Yorks