Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.

com

Sistem Mutasi Refraktori

Amplifikasi (ARMS)
Mayjen (kanan) Suhaib Ahmed, HI (L)

Sistem Mutasi Refraktori Amplifikasi (ARMS) adalah aplikasi PCR di mana DNA diamplifikasi
oleh primer spesifik alel. Dalam ketidakcocokan PCR pada ujung 3' primer dapat secara
dramatis mengurangi anil dan karenanya amplifikasi. Hal ini disebabkan tidak adanya
aktivitas proofreading eksonuklease 3' sampai 5' dari Taq polimerase. Polimerase DNA
fidelitas tinggi, yang memiliki aktivitas ini, tidak dapat digunakan dalam ARMS. Ini adalah
metode yang sangat berguna untuk identifikasi mutasi titik atau polimorfisme.
Karena ARMS PCR sebagian besar dilakukan untuk mengidentifikasi mutasi atau polimorfisme,
penting juga untuk dapat mengidentifikasi apakah perubahan DNA itu heterozigot atau
homozigot. Heterozigot atau homozigot dibedakan dengan menggunakan primer ARMS untuk
alel mutan/polimorfik dan alel normal (tipe liar). Reaksi untuk mutan dan alel normal biasanya
dilakukan dalam tabung terpisah. Tetapi ini dapat dilakukan dalam tabung yang sama setelah
memberi label pada dua primer dengan pewarna fluoresen yang berbeda.

Desain primer ARMS

Prinsip umum merancang primer PCR seperti yang dibahas dalam bab 3 juga berlaku
untuk primer ARMS. ARMS PCR membutuhkan sepasang primer termasuk primer
umum dan ARMS. Primer umum seperti primer PCR lainnya. Tetapi primer ARMS
memiliki fitur khusus berikut:
1. Primer biasanya panjangnya 30 basa.
2. Nukleotida pada ujung 3' primer harus komplementer dengan nukleotida target yaitu
G untuk C atau C untuk G dan T untuk A atau A untuk T. Ketidakcocokan pada posisi
ini dapat secara dramatis mengurangi amplifikasi. Ketidaksesuaian A:G, G:A, dan C:C
memiliki efek terburuk sedangkan ketidaksesuaian lainnya memiliki tingkat efek
yang bervariasi. Misalnya pada mutasi dengan substitusi AT primer ARMS untuk alel
mutan harus memiliki nukleotida terakhir yang melengkapi nukleotida T yaitu harus
memiliki A. Primer untuk alel normal pada posisi yang sama harus komplementer
dengan nukleotida A yaitu itu harus memiliki T (Gbr. 7.1).

3. Ketidakcocokan tambahan pada salah satu dari lima nukleotida terakhir dari primer ARMS semakin
meningkatkan spesifisitasnya.

4. Merupakan kebiasaan untuk memasukkan kontrol PCR internal dalam reaksi ARMS. Sepasang
primer dirancang untuk mengamplifikasi wilayah gen yang diinginkan yang biasanya bebas
dari mutasi. Sebuah amplifikasi wilayah kontrol internal dan tidak ada amplifikasi oleh primer
ARMS menunjukkan negatif yang sebenarnya. Dalam hasil negatif palsu baik primer ARMS
maupun kontrol internal tidak menunjukkan amplifikasi apapun. Mungkin ada beberapa
alasan untuk hasil negatif palsu, misalnya terlalu sedikit atau terlalu banyak DNA, buruk

Sistem Mutasi Refraktori Amplifikasi (ARMS)

 kualitas template DNA, kegagalan untuk menambahkan primer, Taq, atau reagen lainnya
dan adanya inhibitor PCR.

5. Sensitivitas dan spesifisitas reaksi ARMS dapat dikontrol dengan kondisi reaksi yang
ketat. Desain primer yang baik, suhu annealing yang lebih tinggi dan jumlah siklus
yang terbatas penting untuk menghindari hasil yang salah. Jumlah siklus harus
cukup untuk memberikan hasil positif yang jelas. Meningkatkan jumlah siklus yang
tidak perlu dapat menyebabkan positif palsu. Panjang primer ARMS yang biasa
adalah 30 basa. Primer dengan panjang ini memiliki Tm dan suhu anil yang tinggi
sehingga lebih spesifik.

Gambar 7.1 ARMS primer untuk alel normal dan mutan dari mutasi titik, IVSI-5 (GC), pada
gen -globin. Segmen A menunjukkan primer ARMS yang cocok untuk mutasi (C), segmen B
menunjukkan ketidakcocokan antara primer ARMS mutan dan urutan normal (G), segmen C
menunjukkan primer ARMS yang cocok untuk urutan normal (G), segmen D menunjukkan
ketidakcocokan antara primer ARMS normal dan mutasi (C). Ketidakcocokan yang disengaja
(T:T) juga ditambahkan pada posisi tertutup oleh kotak biru.

Kondisi PCR untuk ARMS

Tempat: gen -globin
Aksesi GenBank NG_000007.3
Alel: -thalassemia mutasi IVSI-5 (GC) 5'-
HaiMeneruskan primer: ACCTCACCCTGTGGAGCCAC
HaiPrimer terbalik (ARMS)
5'-CTCCTTAAACCTGTCTTGTAACCTTGTTAG

Sistem Mutasi Refraktori Amplifikasi (ARMS)

 HaiProduk yang diperkuat 285 bp
HaiKontrol primer (maju):
5'-CAATGTATCATGCCCTTTGCACC
HaiKontrol primer (terbalik):
5'-GAGTCAAGGCTGAGAGATGCAGGA
HaiProduk yang diperkuat: 861 bp
• Volume reaksi: 25μl
• campuran PCR: 22μl
• Konsentrasi primer: 1μl (masing-masing 5 pmol/μl) (Bab
• Taq polimerase: 3) 0,5 unit (0,1μl)
• DNA pola: 2μl (~300ng)
Bersepeda termal:
HaiDenaturasi awal: 1 menit di 94HaiC
HaiJumlah siklus: 25
HaiDenaturasi: 1 menit di 94HaiC 1
Haianil: menit pada 65HaiC
HaiPerpanjangan: 1 menit 30 detik pada 72HaiC 3
HaiEkstensi akhir: menit pada 72HaiC
Elektroforesis: 10 X 10 cm 6% poliakrilamida, 40 menit pada 150 volt.
Pewarnaan: 0,1% perak nitrat
Hasil: Gambar 7.2

Gambar 7.2. Elektroforesis gel poliakrilamida bernoda perak setelah ARMS PCR. Semua jalur
menunjukkan fragmen kontrol internal 861bp. Jalur 1-3 menunjukkan fragmen 285bp dari
mutasi IVS1-5. Jalur 4-5 negatif untuk mutasi yang sama. Jalur 7 menunjukkan tangga alel untuk
berbagai mutasi talasemia.

Sistem Mutasi Refraktori Amplifikasi (ARMS)

Bibliografi
1. Kwok S, Kellogg DE, McKinney N, Spasic D, Goda L, Levenson C, Sininsky JJ (1989)
Pengaruh ketidakcocokan template primer pada reaksi berantai polimerase:
Studi model human immunodeficiency virus tipe 1. Asam Nukleat Res 18:
999-1005.
2. Newton CP, Graham A, Heptinstall LE, Powell SJ, Summers C, Kalsheker N, Smith
JC, Markham AF (1989) Analisis setiap mutasi titik dalam DNA. Sistem mutasi
refraktori amplifikasi (ARMS).Asam Nukleat Res 17: 2503-2516.
3. Old JM, Varawalla NY, Weatherall DJ (1990) Deteksi cepat dan diagnosis
prenatal -thalassemia: studi pada populasi India dan Siprus di Inggris. Lancet
336: 834-837.

Sistem Mutasi Refraktori Amplifikasi (ARMS)