DAFTAR ISI

DAFTAR ISI.......................................................................................................................................................1
PENDAHULUAN...............................................................................................................................................2
ISI........................................................................................................................................................................3
2.2 Teknik Pemisahan dengan HPLC............................................................................................................4
2.3 Komponen-Komponen Penting Dari HPLC............................................................................................5
SISTEM PERALATAN HPLC...........................................................................................................................6
2.4 Pengolahan Data (Data Handling) (Analisa Kualitatif dan Kuantitatif).................................................11
2.5 Prinsip Kerja HPLC...............................................................................................................................11
2.6 Kelebihan Dan Kekurangan Metode Analisis Dengan HPLC................................................................12
3.1 Kesimpulan............................................................................................................................................14
3.2 Saran......................................................................................................................................................14
 PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Kimia analitik adalah cabang ilmu kimia yang berfokus pada analisis material untuk
mengetahui komposisi, struktur, dan fungsi kimiawinya. Secara tradisional, kimia analitik dibagi
menjadi dua jenis, kualitatif dan kuantitatif. Analisis kualitatif bertujuan untuk mengetahui
keberadaan suatu unsur atau senyawa kimia, baik organik maupun anorganik, sedangkan analisis
kuantitatif bertujuan untuk mengetahui jumlah suatu unsur atau senyawa dalam suatu cuplikan.

Kimia analitik modern dikategorisasikan melalui dua pendekatan, target dan metode.
Berdasarkan targetnya, kimia analitik dapat dibagi menjadi kimia bioanalitik, analisis material,
analisis kimia, analisis lingkungan, dan forensik. Berdasarkan metodenya, kimia analitik dapat
dibagi menjadi spektroskopi, spektrometri massa, kromatografi dan elektroforesis, kristalografi,
mikroskopi, dan elektrokimia.

Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan fisik dengan unsur-unsur yang akan
dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa- fasa ini membentuk suatu lapisan
stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang merembes
lewat atau melalui lapisan yang stasioner. Fasa stasioner/diam dapat berupa zat padat atau suatu
cairan, dan fasa gerak dapat berbentuk cairan ataupun gas. Maka semua jenis kromatografi yang
dikenal, terbagi menjadi empat golongan: cair-padat,gas-padat, cair-cair, dan gas-cair (Day dan
Underwood, 2002). Fase diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan
melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan
tertinggal. Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat.
Sekarang ini, kromatografi sangat diperlukan dalam memisahkan suatu campuran senyawa.

Berbagai usaha telah dilakukan untuk menambah laju aliran tanpa mengubah tinggi
piringan teoritis kolom. Penurunan ukuran partikel penunjang stasioner tidak selalu
menguntungkan. Kromatografi cair kinerja tinggi atau high performance liquid chromatography
(HPLC) berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC menggunakan kolom dengan diameter
umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran partikel penunjang 50 nm; sedangkan laju aliran
dipertinggi dengan tekanan yang tinggi (Khopkar, 2003).

HPLC didefinisikan sebagai kromatografi cair yang dilakukan dengan memakai fase
diam yang terikat secara kimia pada penyangga halus yang distribusi ukuranya sempit ( kolom )
dan fase gerak yang dipaksa mengalir dengan laju alir yang terkendali dengan memakai tekanan
tinggi sehingga menghasilkan pemisahan dengan resolusi tinggi dan waktu yang relative singkat.
HPLC atau KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan
pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, antara lain : farmasi;
lingkungan; bioteknologi; polimer; dan industri- industri makanan.
2.1 Perkembangan Kromatografi

Kromatografi pada hakekatnya merupakan metode pemisahan dimana komponen yang

akan dipisahkan terdistribusi diantara dua fase yang saling tidak bercampur yaitu fasa diam dan
fasa gerak. Kromatografi juga didefinisikan sebagai proses pemisahan zat terlarut oleh suatu
proses migrasi diffferensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua fase atau lebih, salah satu
diantaranya bergerak secara berkesinambungan dalam arah tertentu dan didalamnya zat-zat itu
menunjukkan adanya perbedaan dalam adsorpsi, partisi, kelarutan tekanan uap, ukuran molekul
atau kerapatan tekanan uapnya (Bahti, 1998).

Istilah kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-daerah yang

berwarna yang bergerak kebawah kolom. Pada waktu yang hampir bersamaan, D.T. Day juga
menggunakan kromatografi untuk memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett lah yang
pertama diakui sebagai penemu dan yang menjelaskan tentang proses kromatografi. Penyelidikan
tentang kromatografi kendor untuk beberapa tahun sampai digunakan suatu teknik dalam bentuk
kromatografi padatan cair (LSC).

Kemudian pada akhir tahun 1930 an dan permulaan tahun 1940 an, kromatografi mulai
berkembang. Dasar kromatografi lapisan tipis (TLC) diletakkan pada tahun 1938 oleh Izmailov
dan Schreiber, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada tahun 1958. Hasil karya yang baik
sekali dari Martin dan Synge pada tahun 1941 (untuk ini mereka memenangkan Nobel) tidak
hanya mengubah dengan cepat kromatografi cair tetapi seperangkat umum langkah untuk
pengembangan kromatografi gas dan kromatografi kertas. Pada tahun 1952 Martin dan James
mempublikasikan makalah pertama mengenai kromatografi gas. Diantara tahun 1952 dan akhir
tahun 1960 an kromatografi gas dikembangkan menjadi suatu teknik analisis yang canggih
(Sudjadi, 1986).

Kromatografi cair kolom klasik merupakan prosedur pemisahan yang sudah mapan
dimana fase cair yang mengalir perlahan-lahan melewati kolom akibat gaya gravitasi dan terjadi
proses pemisahan di kolom tersebut. Metode itu dicirikan dengan efisiensi kolom yang rendah
dan waktu pemisahan yang lama. Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian dalam teknik
kolom cair kembali dilirik dengan dikembangkannya sistem kolom bertekanan tinggi oleh
Kirchland dan Huber, yang mampu bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 107 Nm-2 (3000p.s.i).
Dalam metode ini digunakan kolom berdiameter kecil (1-3 mm) dengan partikel pendukung
berukuran sekitar 30 nm dan eluen dipompakan ke dalamnya dengan laju alir yang tinggi (sekitar
1-5 cm3m-1). Pemisahan dengan metode ini dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih
cepat) daripada dengan kromatografi cair yang biasa (Bassett et. all., 1994).

Kromatografi cair, dalam praktek ditampilkan dalam kolom gelas berdiameter besar, pada
dasamya dibawah kondisi atmosfer. Waktu analisis lama dan segala prosedur biasanya sangat
membosankan. Pada akhir tahun 1960 an, semakin banyak usaha dilakukan untuk pengembangan
kromatografi cair sebagai suatu teknik mengimbangi kromatografi gas. High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) atau Kromatografi Cair Penampilan Tinggi atau High Preformance =
Tekanan atau Kinerja Tinggi, High Speed= Kecepatan Tinggi dan Modern = moderen) telah
berhasil dikembangkan dari usaha ini. Kemajuan dalam keduanya instrumentasi dan pengepakan
kolom terjadi dengan cepatnya sehingga sulit untuk mempertahankan suatu bentuk hasil keahlian
membuat instrumentasi dan pengepakan kolom dalam keadaan tertentu. Tentu saja, saat ini
dengan teknik yangsudah matang dan dengan cepat HPLC mencapai suatu keadaan yang
sederajat dengan kromatografi gas (Putra, 2004).

Umumnya metode kromatografi seperti adsorpsi, partisi, dan penukar ion adalah contoh-
contoh dari kromatografi kolom. Pada metode kromatografi cair ini digunakan kolom tabung
gelas dengan bermacam diameter. Partikel dengan dimensi yang bervariasi digunakan sebagai
penunjang stasioner. Banyaknya cairan pada kolom jumlahnya sedemikian rupa sehingga hanya
cukup menghasilkan sedikit tekanan untuk memelihara aliran fase gerak yang seragam. Secara
keseluruhan pemisahan ini memakan waktu lama. Berbagai usaha telah dilakukan untuk
menambah laju aliran tanpa mengubah tinggi piringan teoritis kolom. Penurunan ukuran partikel
penunjang stasioner tidak selalu menguntungkan. Kromatografi cair kinerja tinggi atau high
performance liquid chromatography (HPLC) berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC
menggunakan kolom dengan diameter umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran partikel
penunjang 50 nm; sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan yang tinggi (Khopkar,
2003).

HPLC telah digunakan di Indonesia sejak tahun 1997 oleh Wiadnyana dalam
penelitiannya yang bertema menguji dan menentukan kadar toksisitas berbagai macam
fitoplankton di perairan laut. Selain digunakan untuk uji toksisitas, dalam bidang Biokimia
HPLC kerap digunakan untuk menghitung kadar vitamin dan protein dari suatu makanan atau
sampel. Singkatnya, HPLC merupakan sebuah metode analisa modern yang multifungsi dan
sudah ada di Negara kita Indonesia. Oleh karena itu ijinkan penulis untuk bercerita sedikit
tentang High Perfomance Liquid Chromatography.

2.2 Teknik Pemisahan dengan HPLC

Tehnik pemisahan dalam kromatografi melibatkan dua fasa, yakni fasa diam yaitu padat
atau cairan yang terikat pada padatan pendukung, dan fasa gerak yang berupa gas dan cair.
Proses pemisahan dalam kromatografi di dasarkan pada perbedaan laju migrasi masing- masing
komponen dalam sistem kromatografi. Perbedaan laju migrasi dari masing-masing komponen
merupakan akibat dari perbedaan keseimbangan distribusi masing-masing komponen diantara
fasa gerak dan fasa diam. Metode kromatografi dibedakan dalam beberapa macam, berdasar pada
fasa gerak, fasa diam, mekanisme, dan tehnik yang digunakan dan salah satu diantaranya adalah
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC).

Dalam kromatografi cair Kinerja tinggi ini fasa gerak yang digunakan berupa cairan,
sedangkan fasa diamnya berupa padatan (silica gel) yang ditempatkan pada kolom tertutup
(melekat secara kimia dalam kolom tersebut). Maksud dan tujuan analisis dengan kromatografi
yaitu didapatnya pemisahan yang baik demikian halnya dalam HPLC diharapkan pemisahannya
baik dan dalam waktu proses yang relative singkat. Untuk mencapai Tujuan analisis ini, maka
dipilih pelarut pengembang yang sesuai dengan komponen yang dipisahkan, kolom yang
digunakan juga harus diperhatikan, dan detector yang memadai.
 Parameter baik atau tidaknya suatu kromatografi didasarkan pada lima factor, yaitu
waktu retensi, faktor kapasitas, efisiensi kolom, resolusi, dan factor ikutan.

ü Waktu retensi didefinisikan sebagai waktu yang diperlukan untuk membawa keluar suatu
komponen dari dalam kolom kromatografi sehingga yang keluar dari kolom adalah tepat
konsentrasi maksimum.

ü Faktor kapasitas (k’) juga merupakan ukuran retensi suatu komponen dalam kolom. Jika nilai k’
kecil, maka komponen tertahan sebentar dalam kolom. Dan jika nilai k’ yang lebih besar,
maka pemisahan baik tetapi waktu yang dibutuhkan untuk analisis lebih lama dan dan
puncaknya melebar. Sehingga ditentukanlah nilai k’ optimum, yaitu antara 1 sampai 10.
Kolom dinyatakan baik jika cukup selektif artinya mampu menahan berbagai komponen
dengan kekuatan yang cukup berbeda. Agar terjadi pemisahan yang baik maka nilai
selektivitas (α) harus lebih besar daripada 1., dimana semakin besar nilai α maka
pemisahannya akan semakin baik. Nilai α dapat diubah-ubah dengan cara, mengubah fasa
gerak (misal: memperbesar polaritas); mengubah fasa diam; mengubah temperature, karena
pada umumnya kenaikan temperature akan memperkecil waktu retensi; dan mengubah bentuk
komponen.

ü Efisiensi kolom merupakan kemampuan kolom mengeluarkan hasil yang diinginkan dengan
hasil yang memuaskan dan dalam waktu yang singkat.

ü Keterpisahan antara dua puncak kromatogram dinyatakan dengan resolusi ‘R’ (ukuran besar
kecilnya pemisahan). Jika nilai R ≥ 1,5 maka senyawa terpisah dengan baik.

ü Sedangkan factor terikutan (Tf) merupakan ukuran kesimetrisan suatu puncak. Dengan catatan
nilai Tf < 2,0.

Perkembangan HPLC berkembang dari asas proses pemisahan adsorpsi dan partisi ke
arah yang lebih luas, yaitu proses pemisahan yang berasaskan afinitas. Filtrasi gel dan ion yang
berpasangan., akan tetapi proses pemisahannya tetap dilaksanakan di dalam kolom disertai
pemakaian pelarut pengembangdengan tekanan tinggi (Ahmad dan Suherman, 1995).

Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair– cair yang dapat digunakan baik
untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan teknik HPLC
didasarkan kepada pengukuran luas atau area puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan
dengan luas atau area larutan standar. Kegunaan umum HPLC adalah untuk pemisahan sejumlah
senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis ; analisis ketidakmurnian (impurities);
analisis senyawa- senyawa mudah menguap (volatile); penentuan molekul- molekul netral, ionic,
maupun zwitter ion; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang
strukturnya hampir sama; pemisahan senyawa- senyawa dengan jumlah sekelumit (trace
elements), dalam jumlah yang banyak, dan dalam skala proses industry.

2.3 Komponen-Komponen Penting Dari HPLC

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau biasa juga disebut dengan Kromatografi
cair kinerja tinggi (KCKT) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an.
Saat ini, HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis bahan
obat, baik dalam bulk atau dalam sediaan farmasetik.

SISTEM PERALATAN HPLC

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk
memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak,
dan suatu komputer atau integrator atau perekam.
Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :

1. Wadah Fase gerak dan Fase gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu
laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung
fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut(1).
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara
keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh
polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk
fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan
meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada
fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.

Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel
kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan
berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan
analisis.

Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama elusi) atau
dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi) yang analog dengan
pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan
resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang
luas.4)

Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran
larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan
fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut
hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol.
Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik.2)

2. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana
syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai
untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan
sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak
dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus
mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses
penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari
gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa
dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh
ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.6)

3. Tempat penyuntikan sampel

Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir
di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan
karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau
eksternal.

Posisi pada saat memuat sampel Posisi pada saat menyuntik sampel

4. Kolom dan Fase diam

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom
merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan
solut/analit.

Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional,
yakni:
  Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan
kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat
(10 -100 μl/menit).
 Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika
digabung dengan spektrometer massa.
 Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom
ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional
dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.3]
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang
tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar
dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH).
Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan.
Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus
fungsional yang lain.

Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena
mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi.
Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika
aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak
dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi
disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan.

5. Detektor HPLC
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu
mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor
indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya
akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi,
dan elektrokimia.

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:

1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.

2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang
sangat kecil.
3. Stabil dalam pengopersiannya.
4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita.
5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas
(kisaran dinamis linier).
6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.2)

Beberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC dengan karakteristik detektor
seperti berikut :
Detektor Sensitifitas Kisaran Karakteristik
(g/ml) linier
 Absorbansi
Uv- vis 5 x 10-10 104 Sensitivitas bagus, paling
Fotometer filter 5 x 10-10 105 sering digunakan, selektif
Spektrofotometer > 2 x 10-10 105 terhadap gugus-gugus dan
spektrometer struktur-struktur yang
photo-diode tidak jenuh.
array
Fluoresensi 10-12 104 Sensitifitas sangat bagus,
selektif, Tidak peka
terhadap perubahan suhu
dan kecepatan alir fase
gerak.
Indeks bias 5 x 10-7 104 Hampir bersifat universal
akan tetapi sensitivitasnya
sedang. Sangat sensitif
terhadap suhu, dan tidak
dapat digunakan pada
elusi bergradien
Elektrokimia
Konduktimetri 10-8 104 Peka terhadap perubahan
Amperometri 10-12 105 suhu dan kecepatan alir
fase gerak, tidak dapat
digunakan pada elusi
bergradien. Hanya
mendeteksi solut-solut
ionik. Sensitifitas sangat
bagus, selektif tetapi
timbul masalah dengan
adanya kontaminasi
elektroda.

JENIS HPLC
Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar
dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar
dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC
dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik.
Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam
dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:
1. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan
kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal
dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90%
kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus
hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas
yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak
yang berekor.3)
2. Kromatografi fase terikat
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau
fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-
hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam
yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan
pemisahannya adalah fase terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan
bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial
karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi.
Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi
lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya
spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.3)

3. Kromatografi penukar ion

KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan
suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang
paling luas penggunaannya adalah polistiren resin.
Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena
sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan
juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak
dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan
kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan
kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.

4. Kromatografi Pasangan ion

Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan
mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup
dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.2)

5. Kromatografi Eksklusi Ukuran

Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk
memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton.
Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut
dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut
yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-
molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini
disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara
partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak
terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.

6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat
spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel
jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang
sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).
 Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran
yang sangat kompleks

2.4 Pengolahan Data (Data Handling) (Analisa Kualitatif dan Kuantitatif)

Hasil dari pemisahan kromatografi biasanya ditampilkan dalam bentuk kromatogram

pada rekorder.waktu retensi dan volume retensi dapat diketahui atau dihitung. Ini bisa digunakan
untuk mengidentifikasi secara kualitatif suatu komponen, bila kondisi kerja dapat dikontrol.
Lebar puncak dan tinggi puncak sebanding atau proporsional dengan konsentrasi dan dapat
digunakan untuk memperoleh hasil secara kuantitatif.

2.5 Prinsip Kerja HPLC

Prinsip dasar HPLC (High Performance Liquid Chromatografi) adalah pemisahan

senyawa-senyawa berdasarkan kepolaran, dimana terdapat fase mobile (gerak) dan fase stasioner
(diam). Fase mobilenya adalah sampel dan eluen yang bercampur, dan fase stasionernya adalah
silika gel yang mengandung hidrokarbon. Sehingga senyawa yang memiliki kepolaran yang lebih
tinggi akan tertahan pada fase stasioner yang bersifat polar.

Metode pemisahan umum dalam HPLC tergantung sifat polaritas senyawa dalam eluat;

a. Fasa Normal •Fasa gerak nonpolar •Fasa diam polar

b. Fasa Terbalik •Fasa gerak polar •Fasa diam nonpolar

Resolusi adalah pengukuran secara fisik suatu pemisahan. Resolusi dapat ditingkatkan
dengan mengoptimasi parameter-parameter HPLC yaitu retensi,selektifitas, dan efisiensi. Secara
praktis parameter- parameter HPLC tersebt dapat dioptimalkan dengan mengubah:

1. Komposisi dari fase gerak

2. Laju alir

3. Sifat kimia dari fase gerak

4. Jenis kolom Metode HPLC dapat digunakan untuk analisa kuantitatif dan sekaligus kualitatif.

Untuk analisa kualitatif dengan membandingkan kromatogram sampel dengan kromatogram

baku pembanding berdasarkan waktu retensinya. Sedangkan untuk analisa kuatitatif dapat
digunakan dengan persamaan :

Cx = Ax / Ap X Cp

Keterangan :

A = Peak area = Luas puncak

 C = Konsentrasi X = sampel

P = pembanding

Atau jika ingin mendapatkan data yang lebih valid dapat pula ditentukan dengan
menggunakan kurva kalibrasi larutan standar. HPLC yaitu alat yang berfungsi mendorong analit
melalui sebuah kolom dari fase diam (yaitu sebuah tube dengan partikel bulat kecil dengan
permukaan kimia tertentu) dengan memompa cairan (fase bergerak) pada tekanan tinggi melalui
kolom. Sampel yang akan dianalisis dijadikan dalam volume yang kecil dari fase bergerak dan
diubah melalui reaksi kimia oleh fase diam ketika sampel melalui sepanjang kolom.

Tujuan penggunaan alat ini adalah mengetahui kadar asam organik. Waktu saat analit
keluar dari ujung kolom disebut waktu retensi dan merupakan suatu karakteristik yang unik dari
tiap analit. Penggunaan dari tekanan menaikkan kecepatan linear memberikan lebih sedikit
waktu bagi analit untuk berdifusi, dan menghasilkan chromatogram. Pelarut yang banyak
digunakan yaitu air dan zat-zat organik seperti metanol. HPLC ini digunakan untuk asam
organik, seperti asam formiat dan asam asetat. Jika sampel mula-mula berbentuk padatan harus
di-distruksi dulu kemudian di-treatment sehingga berupa larutan homogen yang tidak terdapat
endapan lagi dan bening karena syarat sampel yang dapat dianalisa menggunakan HPLC adalah
harus tidak ada endapan dan harus bening.

2.6 Kelebihan Dan Kekurangan Metode Analisis Dengan HPLC

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) atau High Pressure Liquid Chromatography
(HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia. HPLC termasuk metode analisis
terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat.
Banyak kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan metode lainnya. Kelebihan itu antara
lain:

ü Mampu memisahkan molekul- molekul dari suatu campuran

ü Mudah melaksanakannya

ü Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi

ü Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis ü Resolusi yang baik

ü Dapat digunakan bermacam- macam detektor

ü Kolom dapat digunakan kembali

ü Mudah melakukan "sample recovery". Mudah untuk mendapatkan kembali cuplikan, karena
detector pada HPLC tidak merusak komponen zat yang dianalisis.

ü Dapat memisahkan zat-zat yang tidak mudah menguap ataupun tak tahan panas
ü Banyak pilihan fasa geraknya Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak
analisis yang dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit
(uncomplicated), waktu analisi kurang dari 5 menit bisa dicapai

ü Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana interaksi selektif
dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat; pemisahan
terutama dicapai hanya dengan rasa diam.

ü Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan rasa diam dan rasa gerak pada HPLC
memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang diinginkan.

ü Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam HPLC dapat
mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam-macam zat.

ü Detektor- detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-
12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll,
dapat juga digunakan dalam HPLC

ü Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom
HPLC dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom
yang sama sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven
yang digunakan

ü Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik : zat – zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG
karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisis psesies ionik. HPLC
dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat – zat tersebut.

ü Mudah rekoveri sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam HPLC tidak menyebabkan
destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh karena itu komponen
sampel tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati detector.

ü Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukar ion
memerlukan prosedur khusus.

Sedangkan kekurangannya adalah:

ü Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu

ü Hanya bisa digunakan untuk asam organic

ü Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradient elusi

ü Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas

 PENUTUP

3.1 Kesimpulan

a. Komponen utama dari HPLC yaitu, pompa, injector, elusi gradient, kolom, detector,
pengolahan data.

b. Prinsip dasar HPLC (High Performance Liquid Chromatografi) adalah pemisahan senyawa-
senyawa berdasarkan kepolaran, dimana terdapat fase mobile (gerak) dan fase stasioner (diam).
HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa aktif pada obat, produk
hasil samping proses sintesis, atau produk- produk degradasi dalam sediaan farmasi. Contohnya
adalah menganalisis parasetamol dan kafein dalam suatu campuran.

c. HPLC sebagai suatu metode pemisahan memiliki beberapa keuntungan yaitu menghasilkan
pemisahan yang sangat cepat, dapat memisahkan zat-zat yang tidak mudah menguap ataupun tak
tahan panas, banyak pilihan fasa geraknya, mudah untuk mendapatkan kembali cuplikan, karena
detector pada KCKT tidak merusak komponen zat yang dianalisis, dan dapat dirangkai dengan
instrumen lain untuk meningkatkan efisiensi pemisahan. Sedangkan kekurangannya adalah
larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu, hanya bisa digunakan untuk asam organic,
harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradient elusi, harganya
mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas

3.2 Saran

Penulis berharap kromatografi gas yang telah disajikan dalam bab isi dapat dijadikan
referensi ataupun tambahan wawasan bagi pembaca sehingga dapat membedakannya dan dapat
menerapkannya secara tepat dengan tujuan memajukan pendidikan di Indonesia.
 DAFTAR PUSTAKA

Ahmad, M., dan Suherman 1995. Analisis Instrumental. Airlangga University Press. Surabaya.

Ahmad, M., dan Suherman. 1991. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Airlangga University
Press. Surabaya.

Bahti. 1998. Teknik Pemisahan Kimia dan Fisika. Universitas Padjajaran. Bandung.

Bassett, J., R.C. Denney, G.H. Jeffery, dan J. Mendham, 1994, Kimia Analisis Kuantitatif
Anorganik, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.

Day, R.A dan Underwood, A.L., 2002, Analisis Kimia Kuantitatif, Erlangga, Jakarta.

Khopkar, S.M., 2008, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI Press, Jakarta.

Putra,Effendy D. L., 2004. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi. Jurusan
Farmasi Fakultas Dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara :3

Sudjadi, 1986. Metode Pemisahan. Kanisius. Yogyakarta.