Kepada YTH : Tutorial Imunologi

Rencana Baca :
Tempat :

PEMERIKSAAN ANTIBODI IgM DAN IgG COVID-19 DENGAN

METODE FLUORESCENCE IMMUNOASSAY (FIA)
St. Rahma, Asvin Nurulita, Uleng Bahrun
Program Pendidikan Dokter Spesialis-1 Ilmu Patologi Klinik FK UNHAS Makassar

I. PENDAHULUAN
Pada awal tahun 2020 muncul penyakit pneumonia baru yang
mengagetkan dunia dan menjadi pandemik global yait u Coronavirus disease
2019 (COVID-19) yang disebabkan oleh virus Severe Acute Respiratory
Syndrome Coronavirus-2 (SARS-CoV-2). SARS-CoV-2 merupakan salah satu
dari jenis dari coronavirus. Coronavirus adala h virus RNA yang memiliki 4 jenis
virus yaitu Alpha coronavirus, Beta coronavirus, Gamma coronavirus dan Delta
coronavirus. Alpha dan Beta coronavirus yang menginfeksi manusia sedangkan
Gamma dan Delta coronavirus yang menginfeksi hewan, termasuk di antaranya
adalah kelelawar dan unta. Sebelum terjadinya wabah COVID-19, ada 6 jenis
coronavirus yang dapat menginfeksi manusia, yaitu Alpha coronavirus 229E,
Alpha coronavirus NL63, Beta coronavirus OC43, Beta coronavirus HKU1,
Severe Acute Respiratory Illness Coronavirus (SARS-CoV), dan Middle East
Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV). Coronavirus yang menjadi
etiologi COVID-19 termasuk dalam genus Beta coronavirus. Hasil analisis
filogenetik menunjukkan bahwa virus ini masuk dalam subgenus yang sama
dengan coronavirus yang menyebabkan wabah Severe Acute Respiratory Illness
(SARS) pada 2002-2004 silam, yaitu Sarbecovirus. Atas dasar ini, International
Committee on Taxonomy of Viruses mengajukan nama SARS-CoV-21,2,3,4.
Coronavirus memiliki kapsul, partikel berbentuk bulat atau elips, sering
pleomorfik dengan diameter sekitar 50-200 nm seperti yang terlihat pada gambar
satu. Coronavirus merupakan virus RNA strain tunggal positif dan tidak
bersegmen. Terdapat 4 struktur protein utama pada Coronavirus yaitu: protein N
(nukleokapsid), glikoprotein M (membran), glikoprotein spike S (spike), protein E
(selubung). Struktur coronavirus membentuk struktur seperti bola dengan protein
S berlokasi di permukaan virus dan protein N (nucleocapsid) yang menutupi

Tutorial Imunologi 1
RNA. Protein S atau spike protein merupakan salah satu protein antigen utama
virus dan merupakan struktur utama untuk penulisan gen. Protein S ini berperan
dalam penempelan dan masuknya virus kedalam sel host (interaksi protein S
dengan reseptornya di sel inang)2,5,6,7.

Gambar 1. Struktur coronavirus7

Berdasarkan beratnya kasus, COVID-19 dibedakan atas beberapa

kelompok yaitu tanpa gejala, ringan, sedang, berat dan kritis. Kondisi tanpa gejala
merupakan kondisi teringan karena tanpa adanya gejala. Pasien yang memiliki
gejala ringan/tidak berkomplikasi memiliki gejala tidak spesifik seperti demam,
lemah, batuk (dengan atau tanpa produksi sputum), anoreksia, malaise, nyeri otot,
sakit tenggorokan, sesak, kongesti hidung, sakit kepala. Meskipun jarang, pasien
dapat dengan keluhan diare, mual atau muntah. Gejala sedang / moderat pasien
remaja atau dewasa dengan pneumonia tetapi tidak ada tanda pneumonia berat dan
tidak membutuhkan suplementasi oksigen. Gejala berat /pneumonia berat pasien
remaja atau dewasa dengan demam atau dalam pengawasan infeksi saluran
napas/pneumonia, ditambah satu dari: frekuensi napas > 30 x/menit, distress
pernapasan berat, atau saturasi oksigen (SpO2) < 93 pada udara kamar. Keadaan
kritis apabila pasien dalam keadaan gagal napas, Acute Respiratory Distress
Syndrome (ARDS), syok sepsis dan/atau multiple organ failure3,5.

Tutorial Imunologi
2
 Pneumonia COVID-19 didiagnosa melalui anamnesa, pemeriksaan fisik dan
untuk memastikan diagnosis COVID-19, dapat dilakukan pemeriksaan lanjutan
diantaranya (1) pemeriksaan Hematologi Lengkap dengan sampel darah untuk
melihat angka Leukosit (sel darah putih) dan hitung jenis (Diff Count) sel
Limfosit, (2) pemeriksaan Rontgen Dada atau Thorax untuk mendeteksi adanya
infiltrat atau cairan di paru-paru serta mendeteksi adanya perselubungan yang
menandakan adanya peradangan di paru-paru akibat infeksi dari virus, (3)
Pemeriksaan CT  Scan  Dada atau  Thorax  untuk mendeteksi adanya gambaran 
ground glass opacity di paru-paru yang merupakan gambaran khas pada pasien
yang terinfeksi virus Corona di dalam paru-paru. (4) Pemeriksaan Rapid
Test Antibodi untuk melihat adanya Antibodi terhadap virus SARS-CoV2, (5)
Pemeriksaan RT-PCR (Real Time-Polymerase Chain Reaction) Test dengan
sampel swab tenggorokan untuk mendeteksi adanya virus SARS-CoV2.
Pemeriksaan ini memiliki tingkat akurasi yang lebih tinggi untuk mendiagnosis
kondisi terpapar COVID-19 karena sekali virus corona menginfeksi tubuh, maka
virus akan terdeteksi melalui swab yang diambil dari bagian belakang hidung dan
tenggorokan yang selanjutnya sampel swab tersebut akan diperiksa menggunakan
metode PCR, (6) Tes serologi antibodi SARS CoV2 berbasis lab adalah tes untuk
mendeteksi antibodi baik Imunoglobulin M (IgM) dan Imunoglobulin G (IgG)
terhadap SARS-CoV-2 dalam darah5,.
Pemeriksaan serologi antibodi SARS CoV2 berbasis lab saat ini dilakukan
dengan beberapa metode seperti metode fluorescence immunoassay (FIA),
Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), chemiluminescence
immunoassay (CLIA), Immunochromatography (ICT). Pengambilan sampel
untuk pemeriksaan Antibodi Ig M dan Ig G SARS Cov2 adalah dengan
mengambil sampel darah pasien. Pengambilan sampel darah dapat melalui darah
kapiler (ujung jari) maupun dari darah vena (misal darah di bagian lengan). Jika di
dalam tubuh terdapat infeksi virus, maka tubuh akan membentuk antibodi IgM
dan IgG terhadap virus SARS-Cov2 dan antibodi tersebut akan terdeteksi pada
pemeriksaan terhadap sampel darah pasien. Pembentukan antibodi IgM dan IgG
terhadap infeksi virus memerlukan waktu dan IgM terhadap SAR-Cov2 hilang

Tutorial Imunologi
3
pada akhir minggu ke-12 dan IgG dapat bertahan jangka panjang. IgM akan
terdeteksi 3-7 hari setelah infeksi dan IgG akan terdeteksi setelah 8-10 hari setelah
infeksi.3

II. TUJUAN
Tutorial ini bertujuan untuk menjelaskan pemeriksaan serologi antibodi IgM
dan IgG COVID-19 dengan metode Fluorescence Immunoassay (FIA)
menggunakan alat AFIAS-6 Immunoanalyzer.

III. METODE
A. Pra analitik10
1. Persiapan pasien
Tidak ada persiapan khusus
2. Persiapan sampel
Sampel yang digunakan pada pemeriksaan ini adalah sampel whole blood,
serum atau plasma. Sampel berupa serum dari tabung tanpa antikoagulan
atau plasma dari tabung dengan antikoagulan EDTA, heparin atau sodium
sitrat. Sampel berada pada suhu ruang kurang lebih 30 menit dan
dihomogenkan bila memakai whole blood sebelum diperiksa. Hindari
penggunaan sampel hemolisis berat dan sampel hiperlipidemia.
3. Alat dan bahan
a. Alat:
1. AFIAS-6
2. Operation Manual
3. Set of AFIAS-6 System Check Cartridge and System Check ID
Chip
4. Power Cord
5. Thermal printer paper roll
6. AFIAS OS SD Card (Inserted in the instrument)
7. Barcode Scanner (Optional)
8. USB Key board (86 keys) (Optional)

Tutorial Imunologi
4
 Gambar 2. AFIAS – 6 Manual Immunoanalyzer11

b. Bahan:
1. Sampel plasma/serum sebanyak 100 l, sampel darah kapiler
sebanyak 30 l
2. Cartridge reagen:
Setiap Cartridge yang dikemas dalam kantong aluminium memiliki
dua komponen, bagian detektor dan bagian Cartridge. Bagian
cartridge berisi strip tes, membran yang memiliki antibodi IgM
manusia di jalur uji 1, antibodi IgG manusia di tes baris 2 dan IgY
ayam di baris control. Bagian detektor berisi detektor dan pelarut
detektor. Detektor mengandung konjugat antigen virus yang
berfluoresensi, konjugat antibody IgY ayam yang berfluorosensi
sebagai lyophilized tipe granul, bovine serum albumin (BSA)
sebagai penstabil dan Sodium klorida dalam buffer Tris-HCl.
Pengencer detektor mengandung garam dan deterjen sebagai
penstabil dan natrium azida sebagai pengawet dalam buffer Tris-
HCl.

Tutorial Imunologi
5
 5 4 3 2 1
Keterangan :

1. Untuk meletakan General Tip atau C-Tip. Untuk C-Tip hanya digunakan untuk
sampel darah kapiler atau darah Whole Blood
2. Digunakan untuk meletakan sampel pemeriksaan bisa serum/plasma/whole
blood
3. Buffer reagent
4. Paper pad tempat untuk meletakan sampel yg telah di reaksikan dengan buffer
reagent
5. Proses terjadinya Lateral flow sampel yg telah direaksikan dengan buffer
reagent dimana hasil reaksinya akan di deteksi di area tsb dan di baca secara
Fluorescent

Gambar 3. Cartridge reagen

(Sumber : Dokumentasi pribadi)

B. Analitik
1. Prinsip tes12,11,10
Tes ini menggunakan metode sandwich immunodetection; konjugat
antigen yang berlabel fluoresensi dalam buffer deteksi kering (DB) berikatan
dengan antibodi dalam sampel, membentuk kompleks antigen antibodi, kemudian
bermigrasi ke matriks nitroselulosa yang selanjutnya akan ditangkap oleh antibodi
IgG & IgM pada strip tes. Semakin banyak antibodi dalam sampel akan semakin
banyak kompleks antigen antibodi yang terbentuk sehingga memberikan intensitas
sinyal fluoresensi yang kuat pada antigen detektor, dan akhirnya akan diproses
untuk menunjukkan konsentrasi antibodi IgG dan IgM COVID-19 di sampel
masing-masing.
AFIAS-6 menggunakan laser dioda semikonduktor sebagai sumber
eksitasi cahaya yang dapat menerangi sampel yang dimasukkan ke dalam
cartridge AFIAS pada slotnya sehingga memicu fluoresensi dari akumulasi
kompleks analit yang berlabel fluorosens pada garis tes di membrane nitoseluler
catridge. Cahaya fluorosens dikumpulkan bersama dengan sinar laser yang
tersebar. Fluoresensi murni disaring dari campuran antara cahaya yang tersebar

Tutorial Imunologi
6
dan fluorescent. Intensitas fluoresensi dipindai dan diubah menjadi sinyal listrik
yang berkorelasi dengan intensitas fluoresensi yang dihasilkan pada membran
cartridge. Mikroprosesor yang terpasang akan menghitung konsentrasi analit di
sampel tes berdasarkan kalibrasi yang terprogram yang berasal dari AFIAS ID
Chip yang dimasukkan ke dalam ID Chip Port. Perhitungan dan konversi hasil tes
akan ditampilkan pada tampilan layar AFIAS -6 secara kuantitatif.
Mikroprosesor terpasang menghitung konsentrasi analit dalam sampel uji
berdasarkan kalibrasi pra-program yang berasal dari ‘Chip ID AFIAS 'yang
dimasukkan port chip ID. Hasil tes yang dikomputasi dan dikonversi ditampilkan
pada layar AFIAS-6 secara kuantitatif.

Gambar 4. Prinsip kerja antibodi COVID-19 metode FIA13

Tutorial Imunologi
7
 2. Cara kerja
a. Memakai sampel serum/plasma
1. Pilih “Mode Umum ’dalam instrumen untuk tes AFIAS
2. Ambil 100 μL sampel (darah lengkap / serum / plasma) dengan pipet
dan masukkan ke dalam sumur sampel dengan baik pada cartridge.
3. Masukkan cartridge ke dalam tempat cartridge.
4. Masukkan tip ke sumur tip pada cartridge.
5. Ketuk ikon ‘MULAI’ di layar.
6. Hasil tes akan ditampilkan di layar setelah 10 menit.
b. Memakai sampel darah kapiler
1. Pilih “Mode C-tip” di instrumen untuk tes AFIAS.
2. Masukkan cartridge ke dalam tempat cartridge.
3. Ambil seluruh darah sebanyak 30 μL dengan ujung C-tip.
4. Masukkan ujung C-tip yang berisi darah ke dalam lubang ujung
cartridge.
5. Ketuk ikon ‘MULAI’ di layar.
6. Hasil tes akan ditampilkan di layar setelah 10 menit

C. Pasca analitik
Instrumen untuk tes AFIAS menghitung hasil tes secara otomatis dan
menampilkan Positif / Negatif / Intermedia. Nilai tambahan disajikan dalam
bentuk cut-off index (COI).

1. Nilai rujukan
Tabel 1. Cut Off Index (COI) dari IgG
Cut Off Index (COI) Hasil Keterangan
< 0.9 Negatif Tidak memerlukan tes ulang
0.9 ≤ Titer < 1.1 Indeterminate Perlu untuk tes ulang
≥ 1.1 Positif Perlu untuk tes konfirmasi

Tutorial Imunologi
8
 Tabel 2. Cut Off Index (COI) dari IgM
Cut Off Index (COI) Hasil Keterangan
< 0.9 Negatif Tidak memerlukan tes ulang
0.9 ≤ Titer < 1.1 Indeterminate Perlu untuk tes ulang
≥ 1.1 Positif Perlu untuk tes konfirmasi

2. Sensitivitas dan Spesifitas

AFIAS Covid-19 Ab telah melakukan uji klinis pada 198 orang yang telah
diuji secara RT-PCR dimana didapatkan ada 48 orang yang terdeteksi
adanya virus SARS CoV-2 dan ada 150 yang tidak terdeteksi SARS CoV-
2, kemudian dilakukan pengujian terhadap antibod Covid-19 dengan
memakai alat AFIAS 6 menunjukkan hasil dimana ada 46 orang yang
positif memiliki antibodi Covid-19 dan 145 orang yang negatif memiliki
antibody Covid-19 sehingga dapat didapatkan sensitivitas sebesar 95,8 %
dan spesifitas sebesar 96,7 %.

3. Limitasi
a. Tes dapat menghasilkan hasil positif palsu karena reaksi silang dan atau
adhesi non spesifik komponen sampel tertentu dengan antibodi.
b. Tes dapat menghasilkan hasil negatif palsu. Ketidakresponsifnya antigen
terhadap antibodi merupakan hal yang paling umum terjadi dimana
epitop ditutupi oleh beberapa komponen yang tidak diketahui, sehingga
tidak dapat dideteksi sebagai antibodi.
c. Faktor-faktor lain yang dapat mengganggu tes dan menyebabkan hasil
yang keliru yaitu seperti kesalahan teknis / prosedural, degradasi dari
komponen uji / reagen atau keberadaan zat yang mengganggu dalam
sampel uji.

Tutorial Imunologi
9
 DAFTAR PUSTAKA

1. Zhu N, Zhang D, Wang W, Li X, Yang B, Song J, et al. A novel

coronavirus from patients with pneumonia in China, 2019. N Engl J Med.
2020;382(8):727–33.
2. Riedel S, Morse S, Mietzner T MS. Jawetz, Melnick, & Adelberg’s
Medical Microbiology. 28th ed. New York: McGraw- Hill
Education/Medical; 2019. 617–22 p.
3. Susilo A, Rumende CM, Pitoyo CW, Santoso WD, Yulianti M, Sinto R, et
al. Coronavirus Disease 2019 : Tinjauan Literatur Terkini Coronavirus
Disease 2019 : Review of Current Literatures. J Penyakit Dalam Indones.
2020;7(1):45–67.
4. Wang Z, Qiang W, Ke H. A Handbook of 2019-nCoV Pneumonia Control
and Prevention. Hubei Sci Technol Press [Internet]. 2020;1–108. Available
from: http://fpmpam.org/files/Handbook_2019nCoV.pdf
5. Li X, Geng M, Peng Y, Meng L, Lu S. Molecular immune pathogenesis
and diagnosis of COVID-19. J Pharm Anal [Internet]. 2020;10(2):102–8.
Available from: https://doi.org/10.1016/j.jpha.2020.03.001
6. Burhan E, Susanto AD, Nasution SA, Ginanjar E, Pitoyo CW, Susilo A, et
al. Protokol Pelaksanaan COVID-19. 2020;1–50.
7. Sugihantono A, Burhan E, Aryati D. Pedoman Pencegahan dan
Pengendalian Coronavirus Disease (COVID-19). In 2020. p. 1–214.
8. Maier HJ, Bickerton E, Britton P. Coronaviruses: An Overview of Their
Replication and Pathogenesis. Coronaviruses Methods Protoc.
2015;1282(1):1–282.
9. Erlina Burhan, Fathiyah Isbaniah, Agus Dwi Susanto , Tjandra Yoga
Aditama, Soedarsono, Teguh Rahayu Sartono, Yani Jane Sugiri, Rezki
Tantular, Bintang YM Sinaga, R.R Diah Handayani HA. PNEUMONIA
COVID-19, DIAGNOSIS & PENATALAKSANAAN DI INDONESIA.
In: Perhimpunan Dokter Paru Indonesia. 2020. p. 1–67.
10. Kemenkes. Pedoman kesiapan menghadapi COVID-19. Pedoman kesiapan

Tutorial Imunologi
10
 menghadapi COVID-19. 2020;0–115.
11. Ins-WH. AFIAS COVID-19 Ab. 2020;2020(1):3–4.
12. Siswa L. Panduan penggunaan AFIAS 6 TM. 2010;1–10.
13. Koczula KM, Gallotta A. Lateral flow assays. Essays Biochem.
2016;60(1):111–20.
14. J.H. R, M. K, J.D. M, M.W. H, J.M. L, K.H. P, et al. Development of a
Rapid Automated Fluorescent Lateral Flow Immunoassay to Detect
Hepatitis B Surface Antigen (HBsAg), Antibody to HBsAg, and Antibody
to Hepatitis C. Ann Lab Med [Internet]. 2018;38(6):578–84. Available
from: http://www.embase.com/search/results?
subaction=viewrecord&from=export&id=L624484155%0Ahttp://
dx.doi.org/10.3343/alm.2018.38.6.578

Tutorial Imunologi
11