Nama : Pespi Yupa PJP : Dr. Ir.

Ence Darmo Jaya Supena, MS

NIM : Nama Asisten :
Hari, tanggal : Rabu, - Nur Habibah (A24170063)
KEL/LAB : - Ester Ayu Nadeak (D24170086)
- Meli Wulandari (E14170076)

- Lu’lu Musarofah (G34170032)

ISOLASI DNA, ELEKTROFORESIS GEL, DAN POLYMERASE

CHAIN REACTION

A. TUJUAN PRAKTIKUM
Mempelajari teknik isolasi DNA untuk mendapatkan DNA yang dapat digunakan sebagai
template PCR. Mempelajari teknik elektroforesis gel agarose untuk memisahkan fragmen DNA.

B. PENDAHULUAN
Deoxyribo Nucleic Acid (DNA) merupakan biomolekul yang sangat penting, sebab
menyimpan informasi dan menyandi instruksi-instruksi genetika setiap organisme. Sifat tersebut
dimanfaatkan untuk mengidentifikasi suatu organisme atau individu. Metode yang biasa
dilakukan adalah dengan menggunakan analisis DNA. Terdapat beberapa penanda tipe yang
dijadikanacuan untuk mengidentifikasi suatu organisme, seperti gen amelogenin, SRY dan Y-
STRs untuk mengidentifikasi jenis kelamin (Syafitri et al. 2013).
Elektroforesis merupakan suatu metode pemisahan yang memanfaatkan medan listrik
yang dihasilkan dari elektroda-elektroda untuk memisahkan senyawa-senyawa yang memiliki
muatan berupa kation ataupun anion. Elektroforesis membutuhkan media pemisah berupa fase
diam seperti sel Agarosa yang tercampur larutan buffer untuk menjaga kondisi keasaman sampel
saat proses pemisahan. Alat ini sangat mendukung keterbaruan penelitian khususnya dibidang
teknologi rekayasa genetika. Hasilnya akan memberikan rekam jejak berupa pita-pita pemisahan
senyawa. Kecepatan gerak molekul tergantung pada nisbah (rasio) muatan terhadap massanya,
serta tergantung pula pada bentuk molekulnya (Harahap 2018).
PCR merupakan metode perbanyakan DNA secara enzimatik tanpa organisme yang
mampu menghasilkan jumlah besar dalam waktu relatif singkat. PCR pertama kali
dikembangkan pada tahun 1984 oleh seorang biokimiawan bernama Kary Mullis Tahapan siklus
PCR meliputi danturasi, pemisahan kedua untai DNA pada temperatur tinggi. Beberapa faktor
yang menentukan tingkat keberhasilan teknik amflikasi DNA menggunkan PCR diantaranya
adalah, deoksiribonukleotida triphosphat (dNTP), oligonukleutida primer, DNA cetak (template),
komposisi larutan buffer, jumlah siklus reaksi, enzim yang digunakan. Selain itu, terdapat
kontaminasi yang mempengaruhi biasanya disebut faktor non-teknis. PCR memiliki keunggulan
yaitu mampu melipatgandakan suatu fragmen DNA sehingga mencapai 109 kali lipat. Oleh
karena itu, adanya kontaminasi dalam jumlah sangat sedikit sekalipun dapat mengakibatkan
terjadinya kesalahan dengan menghasilkan produk amplifikasi yang tidak diharapkans (Forensia
2016).

C. HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolasi DNA

Gambar : Bagan Prosedur Isolasi DNA

Jawaban pertanyaan :
1. Apa fungsi dari buffer lisis?
Jawab :
Fungsi larutan buffer adalah untuk menjaga struktur DNA selama proses lisis dan pemurnian
(Iqbal et al. 2016).
2. Mengapa campuran buffer lisis dan sampel perlu diinkubasi pada suhu tertentu?
Jawab :
Campuran buffer lisis dan sampel perlu diinkubasi pada suhu tertentu agar tidak terjadi
proses pengendapan dan proses pemecahan sel dapat bekerja dengan baik.
3. Apa fungsi sentrifugasi dalam percobaan ini?
Jawab :
Pada proses ini terdapat sentrifugasi yang berfungsi untuk memisahkan kotoran.
4. Apa fungsi ethanol dingin?
Jawab :
Terdapat etanol dingin100% untuk mengendapkan DNA dari supernatan menjadi pellet dan
etanol 70% untuk membersihkan kotoran yang masih ada di DNA.
5. Pada tahapan setelah pemberian ethanol dingin dan disentrifugasi, di bagian mana DNA
berada?
Jawab :
Setelah sentrifugasi kedua serta pemberian etanol dingin dan disentrifugasi menyebabkan
DNA berada dibagian bawah tabung.
 Elektroforesis Gel

Gambar : Bagan Prosedur Elektroforesis Gel

Jawaban Pertanyaan :
1. Apa yang anda ketahui tentang gel agarose?
Jawab :
Gel agarosa digunakan untuk mendeteksi kompleks-kompleks antigen-antibodi dan untuk
analisis molekul DNA, RNA dan molekul protein.
2. Apa fungsi larutan buffer pada teknik elektroforesis gel agarose?
Jawab :
Pada teknik elektroforesis gel agarosa terdapat larutan buffer yang berfungsi untuk
mempertahankan pH di dalam medium pemisah, dan sebagai media penyedian elektrolit pada
proses pergerakan aliran listrik agar elektroforesis gel agarosa dapat berjalan ke reservoir di
setiap ujung gel ruang.
3. Mengapa sampel DNA harus diletakkan pada sisi negatif?
Jawab :
Sampel DNA harus diletakkan pada sisi katoda karena molekul DNA yang dialiri arus listrik
akan bermigrasi dari kutub negatif ke kutub positif melalui matriks gel.
4. Apa tujuan memberikan arus listrik pada elekroforesis gel agarose?
Jawab :
Pada elektroforesis gel agarosa diberikan arus listrik dengan tujuan fragmen DNA mampu
bermigrasi dari kutub negatif ke kutub positif karena DNA bermuatan negative.
5. Apa yang menyebabkan fragmen DNA dapat terpisah satu sama lain pada gel agarose?
Jawab :
Penyebab fragmen DNA dapat terpisah satu sama lain pada sel agarosa adalah fragmen DNA
memiliki ukuran yang berbeda-beda.
6. Mengapa fragmen DNA yang berukuran lebih besar akan berada dekat dengan kutub positif,
sedangkan yang lebih kecil akan berada ke arah negatif?
Jawab :
Pada proses elektroforesis gel, pil agarosa memiliki kerapatan yang terlalu tinggi. Hal
tersebut menyebabkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar susah untuk bergerak dan
melewatinya maka fragmen tersebut tetap berada di anoda. Sedangkan pada fragmen yang
lebih kecil mudah untuk bergerak dan melewatinya maka fragmen tersebut berada di katoda.
Polymerase Chain Reaction

Gambar : Bagan Prosedur Polymerase Chain Reaction

Hasil simulasi PCR virtual

Tabel 1 Konsentrasi DNA hasil PCR

Waktu Kombinasi Suhu Annealing dan Siklus PCR

Denaturation, Kelompok 45⁰C 56⁰C 68⁰C
No
Annealing, dan (Ulangan)
Extension (sec) 15 25 35 15 25 35 15 25 35
1 10, 10, 20 1
2
3
dst
Rata-rata
2 30, 30, 60 1
2
3
dst
Rata-rata

Jawaban pertanyaan :
1. Fenomena sel mana yang ditiru oleh Teknik PCR?
Jawab : Fenomena sel yang meniru teknik PCR adalah replikasi DNA.
2. Utas DNA mana dari template DNA yang diamplifikasi?
Jawab : Pada teknik PCR, utas DNA dari template DNA yang diamplifikasi mulai dari
posisi primer yang telah menempel di urutan basa nukleotida DNA target akan bergerak
dari ujung 5’ menuju ujung 3’ dari untai tunggal DNA.
3. Apa fungsi primer?
Jawab : Primer tersebut berfungsi untuk menginisiasi reaksi proses polimerisasi
DNA secara in vitro, mengenali dan menandai fragmen sampel DNA (template) yang
akan di amplifikasi.
4. Apa fungsi enzim DNA polimerase?
Jawab : Pada proses ini terdapat bantuan dari enzim DNA polimerase yang berfungsi untuk
meningkatkan laju replikasi DNA dan pengurutan basa-basa DNA dengan memasangkan
basa- basa DNA yang sudah dimodifikasi secara kimia hanya dengan melibatkan
penggunaan satu primer.
5. Pada suhu berapa utas DNA bisa terpisah, dan pada suhu berapa utas DNA bisa disintesis?
Jawab : Pada suhu 93ºC–95ºC utas DNA dapat terpisah dan suhu 60ºC-72ºC utas DNA dapat
disintesis (Budiarto 2015).
6. Berapa molekul DNA yang terbentuk dari satu molekul DNA yang diamplifikasi dengan
PCR setelah 35 siklus ?
Jawab :
Molekul DNA pada siklus 35 dibentuk dari satu molekul DNA yang diamplifikasi dengan
PCR adalah 115500 amplicon. Rumus yang digunakan untuk menghitung jumlah salinan
DNA yang terbentuk setelah sejumlah siklus tertentu adalah Y = (2n- 2n)X dimana Y adalah
jumlah amplicon, n adalah jumlah siklus dan X adalah jumlah molekul DNA template
semula. Pada teknik PCR terdapat tahap denaturasi yang memerlukan suhu optimum maka
tidak bisa terjadi ketika mencapai suhu 50ºC, karena suhu tersebut masih terlalu rendah
untuk memutuskan ikatan hidrogen. Apabila ikatan tersebut tidak diputuskan maka DNA
masih satu rantai dan proses PCR tidak dapat terlaksana (Budiarto 2015).
7. Apa fungsi perubahan suhu pada proses PCR ini?
Jawab :
Pada proses PCR, perubahan suhu berfungsi untuk menentukan keberhasilan PCR.
8. Pada suhu denaturasi berapa tidak terbentuk produk PCR? Mengapa?
Jawab :
Suhu denaturasi yang terlalu tinggi akan menurunkan aktivitas polimerase DNA yang akan
berdampak pada efisiensi PCR. Selain itu juga dapat merusak DNA templat, sedangkan suhu
yang terlalu rendah dapat menyebabkan proses denaturasi DNA templat tidak sempurna.
9. Faktor apa saja yang mempengaruhi keberhasilan PCR?
Jawab :
Pada tahap PCR terdapat beberapa faktor yang dapat mempengaruhi keberhasilan, yaitu
konsentrasi dan kualitas DNA, temperature annealing dari kedua primer, konsentrasi MgCl2,
enzim polimerase, konsentrasi dan kualitas primer, jumlah siklus PCR, deoksinukleotida
triphosphate (dNTP), dan materi pendukung berupa larutan penyangga (buffer PCR)
(Feranisa 2016).
10. Kondisi PCR seperti apa dari simulasi yang anda kerjakan yang menghasilkan produk paling
optimum ?
Jawab :
Kondisi PCR yang memungkinkan mendapatkan hasil yang optimum adalah kondisi dengan
suhu dan jenis polimerase yang sesuai.

SIMPULAN
Pengamatan pada DNA dilakukan dengan tiga teknik analisis DNA, yaitu teknik isolasi
DNA, elektroforesis gel agarosa dan teknik PCR. Teknik isolasi DNA dilakukan untuk
mengamati untai DNA secara langsung. Teknik elektroforesis gel dilakukan untuk memisahkan
fragmen DNA dan melakukan pemurnian terhadap sampel DNA. Teknik PCR dilakukan melalui
tiga tahap, yaitu denaturasi, annealing dan ekstensi. Teknik elektroforesis gel agarose untuk
memisahkan fragmen DNA yaitu sangat berperan penting dalam pemisahan fragmen DNA yaitu
melalui Gel agarose yang kemudian dilarutkan dalam suatu buffer yang dialiri arus listrik
sehingga memudahkan dalam proses pemisahan. Selain itu, dalam laju elektroforesis ukuran dan
molekul sangat berpengaruh saat berlangsungnya proses elektrolisis. Dalam isolasi terdapat
buffer yang berperan sebagai pemecah agar DNA dapat keluar. Selain itu, buffer berfungsi
sebagi penjaga struktur DNA selama proses lisis dan pemurniannya. Hal inilah mengapa molekul
DNA dapat dipisahkan tetapi strukturnya tidak mengalami perubahan. Suhu sangat berperan
penting dalam keberhasilan dalam PCR. Sebab suhu yang denaturasi 50 , maka tidak akan ada
produk yang terbentuk karena proses PCR pada umumnya dilakukan pada suhu sekitar 75 ,
kondisi suhu tersebut merupakan suhu optimum polymerase DNA yang biasa digunakan dalam
proses PCR. Selain suhu, terdapat faktor lain yaitu jenis polymerase DNA, konsentrasi dNTPs,
MgCl2 dan DNA plymerase, buffer PCR dan waktu.

DAFTAR PUSTAKA
Budiarto BR. 2015. Polymerase chain reaction (PCR): perkembangan dan perannya dalam
diagnostik kesehatan. BioTrends Journal. 6(2): 29-38.

Feranisa A. 2016. Komparasi antara polymerase chain reaction (PCR) dan loopmediated
isothermal amplification (lamp) dalam diagnosis molekuler. Jurnal Dental ODONTO.
3(2): 145-151.

Harahap MR. 2018. Elektroforesis analisis elektronika terhadap biokimia genetika. Jurnal Ilmiah
Pendidikan Teknik Elektro. 2(1):21-26.

Iqbal M, Buwono ID, Kurniawati N. 2016. Analisis perbandingan metode isolasi DNA untuk
deteksi white spot syndrome virus (WSSV) pada udang vaname (Litopenaeus vannamei).
Jurnal Perikanan Kelautan. 7(1): 54-65.

Syafitri K, Auekarkari E, Suhartono W. 2013. Metode pemeriksaan jenis kelamin melalui

análisis histologis dan DNA dalam identifikasi odontologi forensik. JPDGI. 62(1):11-16.