Desain Eksperimental PCR Waktu Nyata

Desain eksperimental yang tepat adalah kunci untuk setiap studi ekspresi gen. Karena
transkripsi mRNA dapat peka terhadap rangsangan eksternal yang tidak terkait dengan proses
yang dipelajari, penting untuk bekerja di bawah kondisi yang dikontrol dengan ketat dan
terdefinisi dengan baik. Meluangkan waktu untuk menentukan prosedur eksperimental,
kelompok kontrol, jenis dan jumlah ulangan, kondisi percobaan, dan metode penanganan
sampel dalam setiap kelompok sangat penting untuk meminimalkan variabilitas. Masing-
masing parameter ini harus dicatat dengan cermat sebelum melakukan eksperimen PCR
waktu nyata untuk memastikan reproduktifitas biologis yang baik untuk data yang
dipublikasikan.

Koleksi Sampel Desain Eksperimental

Untuk mengukur ekspresi gen, bahan sampel harus sehomogen mungkin. Jika sampel
jaringan Anda terdiri dari banyak jenis sel yang berbeda, menentukan pola ekspresi gen target
Anda mungkin sulit. Jika Anda memiliki sampel yang heterogen, gunakan salah satu dari
banyak metode yang tersedia untuk memisahkan dan mengisolasi jenis sel tertentu. Metode
ini termasuk diseksi jaringan, biopsi jarum, dan mikrodiseksi penangkapan laser. Sel-sel yang
dikumpulkan kemudian dapat digunakan untuk mendapatkan sampel RNA.
 

Ekstraksi RNA
Baik RNA total atau poli(A+) dapat digunakan untuk sebagian besar aplikasi RT-qPCR
waktu nyata. Satu pertimbangan penting dalam bekerja dengan RNA adalah untuk
menghindari RNase dalam solusi, bahan habis pakai, dan labware Anda. Solusi siap pakai
yang bebas RNase dapat dibeli. Sebagai alternatif, obati larutan dengan dietil pirokarbonat
(DEPC), lalu autoklaf. RNase pada labware juga dapat dinonaktifkan dengan perlakuan
DEPC, atau dengan memanggang pada suhu 250 °C selama 3 jam.
Sampel RNA yang disiapkan mungkin memerlukan perawatan DNase untuk mencegah
potensi amplifikasi dari setiap DNA genom yang terkontaminasi, yang dapat menyebabkan
perkiraan jumlah salinan mRNA yang terlalu tinggi. Ketika bahan awal terbatas,
bagaimanapun, pengobatan DNase mungkin tidak disarankan, karena manipulasi tambahan
dapat mengakibatkan hilangnya RNA. Amplifikasi DNA genomik kontaminasi potensial
dapat dicegah dengan merancang primer transkrip-spesifik, misalnya, primer yang merentang
atau memperkuat melintasi sambungan sambatan.
 

Menganalisis Kuantitas dan Kualitas Asam Nukleat

Kuantifikasi asam nukleat yang akurat sangat penting untuk analisis ekspresi gen, terutama
jika jumlah total RNA digunakan untuk menormalkan ekspresi gen target. Konsentrasi dan
kemurnian RNA biasanya ditentukan dengan mengukur rasio absorbansi UV pada 260 nm
dan 280 nm. Sensitivitas keseluruhan metode ini rendah, terutama untuk sampel yang relatif
encer, dan tidak menunjukkan kualitas RNA. Untuk menentukan kualitas dan kuantitas
sampel Anda, sebaiknya gunakan sistem elektroforesis otomatis Experion™ . Contoh
preparasi RNA total berkualitas tinggi dan preparasi RNA total berkualitas buruk ditunjukkan
pada Gambar 1.

Gambar 1. Kualitas RNA dinilai oleh sistem elektroforesis otomatis Experion. A ,

contoh preparasi RNA total berkualitas tinggi yang menunjukkan puncak berbeda untuk
rRNA 18S dan 28S; B , contoh persiapan RNA total berkualitas buruk di mana hanya
fragmen kecil yang terdegradasi yang diamati.
 

Pemilihan Gen Referensi

Dalam percobaan qPCR, gen referensi digunakan sebagai kontrol untuk menormalkan data
dengan mengoreksi perbedaan jumlah cDNA yang digunakan sebagai templat. Oleh karena
itu, gen referensi yang sempurna adalah gen yang tidak menunjukkan perubahan ekspresi
antara sampel dari berbagai kondisi eksperimental atau titik waktu. Beberapa gen,
seperti GADPH, ACTB, atau 16S rRNA, sering digunakan sebagai gen referensi. Namun,
sejumlah penelitian telah menunjukkan bahwa ekspresi gen ini dapat sangat bervariasi antara
jaringan atau antara perawatan, dan variabilitas ini mungkin membuatnya tidak cocok untuk
digunakan sebagai gen referensi. Oleh karena itu, gen referensi harus dipilih dengan cermat
berdasarkan data eksperimen. Gen referensi yang baik harus memiliki nilai M di bawah 0,5
pada kumpulan sampel yang homogen, dan di bawah 1 pada kumpulan sampel yang
heterogen (Vandesompele et al. 2002). Biasanya, antara tiga dan lima gen referensi yang baik
diperlukan untuk mencapai normalisasi yang paling akurat.
 

Kuantifikasi mRNA: Relatif vs. Absolut

Kuantifikasi relatif digunakan untuk membandingkan jumlah asam nukleat target dalam
jumlah yang setara dari sampel yang berbeda.
Kuantifikasi absolut digunakan untuk menentukan berapa banyak (jumlah salinan, ng, dll.)
dari gen target yang ada dalam sampel tertentu tanpa referensi ke sampel lain. Kuantifikasi
absolut secara konseptual sederhana dan perhitungan matematisnya mudah dilakukan. Ini
melibatkan membandingkan nilai siklus kuantifikasi (Cq) sampel uji dengan standar kuantitas
yang diketahui yang diplot pada kurva standar. Biasanya, kuantitas dinormalisasi ke jumlah
unit sampel, seperti jumlah sel, volume, atau jumlah total asam nukleat. Untuk menggunakan
metode ini, Anda harus memiliki sumber template yang dapat diandalkan dengan konsentrasi
yang diketahui, dan standar harus diperkuat secara paralel dengan sampel setiap kali
percobaan dilakukan.
 

Perhitungan Tingkat Ekspresi

Setelah nilai Cq diukur, metode yang berbeda dapat digunakan untuk menentukan tingkat
ekspresi gen target dalam sampel uji relatif terhadap sampel kalibrator.
Metode 2 -ΔΔCq (Livak)
Metode Livak untuk analisis ekspresi gen relatif banyak digunakan dan mudah
dilakukan. Metode ini mengasumsikan bahwa gen target dan referensi diperkuat dengan
efisiensi mendekati 100% dan dalam 5% satu sama lain. Sebelum menggunakan metode
Livak, penting untuk memverifikasi asumsi ini dengan menentukan efisiensi amplifikasi gen
target dan referensi.
Setelah Anda menetapkan bahwa gen target dan referensi memiliki efisiensi amplifikasi yang
serupa dan hampir 100%, Anda dapat menentukan perbedaan relatif dalam tingkat ekspresi
gen target Anda dalam sampel yang berbeda menggunakan langkah-langkah di bawah ini:

1. Normalisasi Cq gen target dengan gen referensi (ref) untuk sampel uji dan sampel
kalibrator:
Cq (uji) = Cq (target, uji)  - Cq (ref, uji)

Cq (kalibrator) = Cq (target, kalibrator) - Cq (ref, kalibrator)

2. Normalisasikan Cq sampel uji ke Cq kalibrator:
Cq = Cq (pengujian) - Cq (kalibrator)
3. Hitung rasio ekspresi:
2 -ΔΔCq = rasio ekspresi ternormalisasi

Hasilnya adalah rasio gen target dalam sampel uji dengan sampel kalibrator, dinormalisasi
dengan ekspresi gen referensi. Normalisasi ekspresi gen target dengan gen referensi
mengkompensasi perbedaan jumlah jaringan sampel.
Jika target dan gen referensi tidak memiliki efisiensi amplifikasi yang sama, Anda dapat
mengoptimalkan atau mendesain ulang pengujian, atau Anda dapat menggunakan metode
Pfaffl. Jika, di sisi lain, target dan gen referensi memiliki efisiensi amplifikasi yang identik,
tetapi efisiensinya tidak sama dengan 2, bentuk modifikasi dari metode Livak dapat
digunakan dengan mengganti 2 dalam persamaan dengan efisiensi amplifikasi yang
sebenarnya. . Misalnya, jika efisiensi amplifikasi target dan gen referensi adalah 1,95,
persamaan berikut harus digunakan:
Rasio = 1,95 -ΔΔCq

Metode Cq Menggunakan Gen Referensi

Metode Cq menggunakan gen referensi merupakan variasi dari metode Livak yang lebih
sederhana untuk dilakukan dan pada dasarnya memberikan hasil yang sama. Berbeda dengan
nilai Cq yang diperoleh dengan kuantifikasi relatif yang dinormalisasi terhadap satuan massa,
metode ini menggunakan perbedaan antara nilai Cq referensi dan target untuk setiap
sampel. Terlepas dari kesederhanaan pendekatannya, itu memang ekspresi yang
dinormalisasi. Tingkat ekspresi gen referensi diperhitungkan. Perbedaan utama dalam hasil
adalah bahwa nilai ekspresi sampel kalibrator bukan 1,0. Jika nilai ekspresi yang dihasilkan
yang diperoleh dalam metode ini dibagi dengan nilai ekspresi dari kalibrator yang dipilih,
hasil perhitungan ini sama persis dengan yang diperoleh dengan metode Livak:
 Rasio (referensi/target) = 2 Cq(ref) - Cq(target)
Asumsi matematis untuk pendekatan ini sama dengan asumsi untuk metode Livak.

Metode Pfaffl
Metode Livak untuk menghitung ekspresi gen relatif hanya valid jika efisiensi amplifikasi
gen target dan referensi serupa. Jika efisiensi amplifikasi kedua produk PCR tidak sama,
formula alternatif harus digunakan untuk menentukan ekspresi relatif gen target dalam
sampel yang berbeda. Untuk menentukan rasio ekspresi antara sampel uji dan kalibrator
untuk target yang dinormalisasi ke referensi (ref), gunakan persamaan berikut:
Rasio = (E target ) Cq, target (kalibrator - uji) /(E ref ) Cq, ref (kalibrator - uji)
di mana
E sasaran adalah efisiensi amplifikasi gen target.
E ref adalah efisiensi amplifikasi gen referensi.
Cq, ref (kalibrator - adalah Cq dari gen referensi di kalibrator dikurangi Cq dari gen referensi
tes) dalam sampel uji.
Cq, target (kalibrator - adalah Cq gen target di kalibrator dikurangi Cq gen target dalam sampel
tes) uji.
Persamaan di atas mengasumsikan bahwa setiap gen (target dan referensi) memiliki efisiensi
amplifikasi yang sama pada sampel uji dan sampel kalibrator, tetapi gen target dan referensi
tidak harus memiliki efisiensi amplifikasi yang sama.
 

Statistik
Untuk memahami pentingnya data yang telah dikumpulkan dan dianalisis, nilai statistik perlu
ditentukan. Ukuran spesifik yang digunakan akan bergantung pada bagaimana data
didistribusikan (misalnya, "normal", simetris), ukuran sampel, jumlah faktor yang
dipertimbangkan, dll. Alat yang dapat membantu analisis statistik adalah perangkat lunak
qbase+ ( Biogazelle, Belgia), yang menggabungkan wizard statistik terpandu yang membantu
pengaturan.
 

Pedoman MIQE
PCR kuantitatif waktu nyata (qPCR)telah menjadi teknik definitif untuk mengukur perbedaan
tingkat ekspresi gen antara sampel. Selama 10 tahun terakhir, popularitas metode ini telah
tumbuh secara eksponensial, dengan publikasi lebih dari 25.000 makalah yang mengacu pada
data qPCR, dari berbagai bidang ilmu termasuk penelitian pertanian, lingkungan, industri,
dan medis. Terlepas dari penerapan yang luas dari teknik ini, salah satu faktor utama yang
telah mendorong pertumbuhan yang mengesankan ini adalah meningkatnya permintaan dari
panel peninjau jurnal untuk penggunaan qPCR untuk mendukung pengamatan fenotipik
dengan data molekuler kuantitatif. Selanjutnya, analisis ekspresi gen sekarang digunakan
untuk mendukung data ekspresi protein dari pengujian berbasis proteomik. Industri
bioteknologi telah menanggapi adopsi yang cepat dari teknik ini dengan mengembangkan
reagen dan instrumen untuk melakukan eksperimen qPCR. Namun, tanpa pedoman yang
ketat untuk diikuti, peneliti umumnya merancang eksperimen mereka berdasarkan informasi
yang dikumpulkan dari sumber yang berbeda, dan ini menghasilkan data dengan kualitas
yang bervariasi. Sejumlah kekurangan teknis dapat mempengaruhi kinerja pengujian qPCR,
termasuk desain eksperimental yang tidak tepat, kontrol dan ulangan yang tidak memadai,
kurangnya kondisi eksperimental yang terdefinisi dengan baik dan teknik penanganan
sampel, kualitas sampel RNA yang buruk, pilihan primer yang suboptimal untuk transkripsi
balik (RT) dan reaksi qPCR, kurangnya validasi gen referensi, dan metode analisis data yang
tidak tepat. peneliti umumnya merancang eksperimen mereka berdasarkan informasi yang
dikumpulkan dari sumber yang berbeda, dan ini menghasilkan data dengan kualitas yang
bervariasi. Sejumlah kekurangan teknis dapat mempengaruhi kinerja pengujian qPCR,
termasuk desain eksperimental yang tidak tepat, kontrol dan ulangan yang tidak memadai,
kurangnya kondisi eksperimental yang terdefinisi dengan baik dan teknik penanganan
sampel, kualitas sampel RNA yang buruk, pilihan primer yang suboptimal untuk transkripsi
balik (RT) dan reaksi qPCR, kurangnya validasi gen referensi, dan metode analisis data yang
tidak tepat. peneliti umumnya merancang eksperimen mereka berdasarkan informasi yang
dikumpulkan dari sumber yang berbeda, dan ini menghasilkan data dengan kualitas yang
bervariasi. Sejumlah kekurangan teknis dapat mempengaruhi kinerja pengujian qPCR,
termasuk desain eksperimental yang tidak tepat, kontrol dan ulangan yang tidak memadai,
kurangnya kondisi eksperimental yang terdefinisi dengan baik dan teknik penanganan
sampel, kualitas sampel RNA yang buruk, pilihan primer yang suboptimal untuk transkripsi
balik (RT) dan reaksi qPCR, kurangnya validasi gen referensi, dan metode analisis data yang
tidak tepat.
Untuk membantu komunitas ilmiah dalam menghasilkan data yang konsisten dan berkualitas
tinggi dari percobaan qPCR, pedoman untuk informasi minimum untuk publikasi percobaan
PCR waktu-nyata kuantitatif (MIQE) telah diterbitkan baru-baru ini (Bustin et al. 2009). oleh
pengembangan bahasa markup data PCR real-time berbasis XML (RDML) oleh konsorsium
RDML (Lefever et al. 2009) untuk pelaporan data PCR real-time yang konsisten. Konsorsium
ini aktif dalam pengembangan terminologi yang sesuai dan standar, pedoman tentang
informasi minimum untuk penyelidikan biologis dan biomedis, dan struktur file data yang
fleksibel dan universal dengan alat untuk membuat, memproses, dan memvalidasi file RDML
( www.rdml.org ).
Tujuan akhir dari pedoman RDML dan MIQE adalah untuk menetapkan kerangka kerja yang
jelas untuk melakukan eksperimen RT-qPCR dan untuk memberikan tolok ukur yang mapan
bagi pengulas dan editor untuk digunakan dalam evaluasi kualitas teknis naskah yang
dikirimkan. Akibatnya, investigasi yang menggunakan metodologi yang diterapkan secara
luas ini akan menghasilkan data yang lebih konsisten, lebih sebanding, dan pada akhirnya
lebih andal.
 

kutipan
1. Bustin SA dkk. (2009). Pedoman MIQE: Informasi minimum untuk publikasi
eksperimen PCR waktu-nyata kuantitatif. Clin Chem 55, 611–622. PMID: 19246619
2. Lefever S dkk. (2009). RDML: Bahasa terstruktur dan pedoman pelaporan untuk data
PCR kuantitatif waktu nyata. Asam Nukleat Res 37, 2065–2069. PMID: 19223324
3. Vandesompele J dkk. (2002). Normalisasi akurat data RT-PCR kuantitatif real-time
dengan rata-rata geometrik dari beberapa gen kontrol internal. Genom Biol 3,
penelitian0034.1. PMID: 12184808
 

Bacaan lebih lanjut

1. Guenin S dkk. (2009). Normalisasi data qRT-PCR: Perlunya mengadopsi validasi
referensi yang sistematis, spesifik kondisi eksperimental. J Exp Bot 60, 487–
493. PMID: 19264760
2. Dapur RR dkk. (2010). Aspek statistik desain eksperimen PCR real-time
kuantitatif. Metode 50, 231–236. PMID: 20109551
3. Yuan JS dkk. (2006). Analisis statistik data PCR waktu nyata. BMC Bioinformatika
7, 85. PMID: 16504059