“Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay”

Abstrak
Telur ayam pada awal pemuliaan antara sistem in vitro dan in vivo dan menyediakan
lingkungan uji vaskular tidak hanya untuk mempelajari angiogenesis tetapi juga untuk
mempelajari tumorigenesis. Setelah chickhen chorioallantoic membran (CAM)
berkembang, jaringan pembuluh darahnya dapat dengan mudah diakses,
dimanipulasi, dan diamati dan oleh karena itu memberikan pengaturan yang optimal
untuk uji angiogenesis. Karena sistem limfoid tidak sepenuhnya berkembang sampai
tahap akhir inkubasi, embrio ayam berfungsi sebagai inang alami yang kekurangan
kekebalan yang mampu mempertahankan jaringan dan sel yang dicangkokkan tanpa
batasan spesifik spesies. Selain memelihara pengembangan allo dan xenografis,
jaringan pembuluh darah CAM menyediakan lingkungan unik yang mendukung untuk
intravasasi sel tumor, penyebaran, dan penangkapan vaskular dan penyimpanan di
mana sel yang ditahan ekstravasasi untuk membentuk fokus metastatik mikro.

Untuk tujuan eksperimental, dalam sebagian besar studi terbaru, CAM diekspos
dengan memotong jendela melalui kulit telur dan eksperimen dilakukan secara in
ovo, menghasilkan keterbatasan yang signifikan dalam aksesibilitas CAM dan
kemungkinan untuk observasi dan dokumentasi foto efek. Ketika kultur tanpa
cangkang dari embrio ayam digunakan, tidak ada rincian eksperimental yang
diberikan dan, jika dipublikasikan sama sekali, tingkat kelangsungan hidup kultur ini
rendah. Kami menyempurnakan metode kultur ex ovo embrio ayam secara signifikan
dengan memperkenalkan ekstrusi konten telur yang dikontrol secara rasional. Kultur
ex ovo ini meningkatkan aksesibilitas CAM dan embrio ayam, memungkinkan
dokumentasi efek in vivo yang mudah dan memfasilitasi manipulasi eksperimental
embrio. Ini memungkinkan aplikasi yang berhasil untuk sejumlah besar pertanyaan
ilmiah: (1) sebagai uji angiogenesis yang ditingkatkan, (2) pengaturan eksperimental
untuk injeksi yang difasilitasi di vitreus mata embrio ayam, (3) sebagai lingkungan uji
untuk penyebaran dan intravasasi sel tumor yang tersebar dari garis sel mapan yang
diinokulasi pada CAM, (4) sebagai sistem penopang yang lebih baik untuk
keberhasilan transplantasi dan kultur tunas tungkai ayam dan tikus serta (5) untuk
penyusunan, perbanyakan, dan pencangkokan ulang jaringan tumor primer padat
yang diperoleh dari biopsi pada permukaan CAM.

Protokol:
Bagian 1: Inkubasi telur
1. Telur yang telah dibuahi dapat disimpan pada suhu 13oc hingga satu minggu
2. Telur diinkubasi selama 72 jam, diletakkan mendatar dalam inkubator dengan
nampan bergerak, memutar telur 12 kali sehari terus menerus. Kelembaban
dijaga pada 60-62%, suhu inkubasi pada 37,5oc

Bagian 2: Budaya ex ovo

1. Setelah inkubasi, telur dikeluarkan dari inkubator
2. Sisi atas telur ditandai dengan pensil
3. Telur berada secara horizontal dengan tanda pensil di atas dan retak pada
tepi batang pengaduk magnet segitiga 80 mm yang diletakkan tegak lurus
dengan sumbu panjang telur
 4. Telur disimpan dekat dengan bagian bawah cawan petri untuk menghindari
kebocoran lebih lanjut dari putih telur
5. Dengan memberikan tekanan lembut pada meridian yang mengalir melalui
celah dan ekuator telur dengan ibu jari dan jari tengah, dimungkinkan untuk
mengatur vakum. Isi telur kemudian dapat dipindahkan ke cawan petri tanpa
rusak
6. Kultur ex ovo dikembalikan ke inkubator dan disimpan pada suhu 37,5 oc dan
kelembaban 60%

Bagian 3: Aplikasi zat untuk uji angiogenesis

1. Kertas saring terlipat yang diautoklaf (diameter 5,5 mm) dilubangi dengan
pelubang kertas dan digunakan sebagai bahan pendukung (pembawa) untuk
zat cair yang diaplikasikan pada CAM
2. Ketika CAM dikembangkan sepenuhnya, hingga 6 sampel berbeda dapat
diterapkan dan efeknya dapat dibandingkan pada satu CAM
3. Untuk menghindari pengeringan filter, dosis tambahan atau buffer harus
diterapkan kembali setiap hari
4. Dari hari ke 3 setelah aplikasi, pembuluh darah berorientasi pada zat
angiogenik pada filter, sedangkan pola pembuluh darah di sekitar kontrol
tidak berubah.

Bagian 4: Inokulasi sel ke CAM

4.1 persiapan sel
1. Sel konfluen dipindahkan dari labu kultur ke tabung falcon menggunakan
pipet plastik 25 ml steril menggunakan alat bantu pipet
2. Untuk memperkirakan jumlah sel, 15 mikroliter suspensi sel dipindahkan ke
ruang neubauer dan sel dihitung secara manual di bawah mikroskop
3. Tabung falcon disentrifugasi selama 3 menit dengan kecepatan 1000 rpm
pada suhu kamar dan supernatan dibuang
4. Untuk pelacakan sel hidup, sel diencerkan dengan pbs ke konsentrasi yang
diinginkan dan diwarnai dengan kit pelabelan membran sel hidup fluoresen
merah.

4.2 inokulasi sel ke CAM

1. Cincin dipotong dari ujung pipet 1 ml atau tabung kateter vena perifer dengan
satu potong menggunakan pisau bedah baru yang sangat tajam dan
diterapkan pada CAM embrio ayam e6-e14 yang dikultur secara ex ovo
2. Tergantung pada ukuran cincin 20 mikroliter sel 3x10^6 sel/ml dipipet secara
total ke dalam satu cincin atau sebagai volume terpisah menjadi beberapa
cincin.

Bagian 5: Injeksi sel intravitreous

1. Spuit hamilton mikroliter dibilas beberapa kali dengan etoh 70% dan terakhir
dengan pbs steril
2. Jarum suntik mikro diisi dengan suspensi sel bernoda atau tidak bernoda
yang disiapkan
3. Di bawah kendali mikroskop, hati-hati tapi cepat menembus CAM dan lapisan
mata dengan jarum suntik dan terus menerus menyuntikkan 10 hingga
 maksimal 20 mikroliter suspensi sel ke dalam vitreous embrio ayam yang
dikultur ex ovo
4. Jarum harus tetap 1-2 detik ke dalam mata untuk menghindari hilangnya
suspensi sel yang disuntikkan karena kebocoran

Bagian 6: Pembedahan tunas tungkai ayam

1. Telur dikeluarkan dari inkubator setelah 3-4 hari masa inkubasi
2. Telur dipecah pada tepi batang pengaduk magnet segitiga dan dipindahkan
ke cawan petri dan embrio dibedah dari pembuluh kuning telur yang
terhubung dengan memotong lingkaran menggunakan gunting pegas
3. Embrio dipindahkan ke cawan petri kecil segar yang diisi dengan pbs yang
dingin dan steril dengan menggunakan sendok kecil dan dicuci dengan
pengadukan yang baik.
4. Embrio dipindahkan ke cawan petri kecil dengan pbs steril dan dibebaskan
dari membran sekitarnya, hati-hati merobeknya dengan forsep halus
5. Tunas tungkai dipisahkan dengan forsep bedah mikro sedekat mungkin
dengan tubuh, digenggam dan dipindahkan ke CAM ayam inang umur 8-10
hari yang dibudidayakan secara ex ovo

Bagian 7: Persiapan tunas tungkai tikus

1. Waktu kawin hamil diatur dan pagi hari di mana sumbat vagina terdeteksi
pada betina kawin ditetapkan hari kehamilan 0
2. Wanita hamil dikorbankan dengan dislokasi serviks ketika perkembangan
embrio mencapai hari embrionik (e) 10-13 dan difiksasi pada papan lilin
3. Dinding perut dibasahi dengan etoh 70%, dipotong sepanjang garis tengah
dan lipatan kulit difiksasi secara lateral dengan peniti
4. Kedua tanduk rahim dikeluarkan dari perut, terlepas dan dipindahkan ke
gelas kimia dengan pbs dingin
5. Embrio dipisahkan, dipindahkan ke cawan petri dan dinding rahim dan
selaput embrio dikeluarkan dengan hati-hati dengan menggunakan forsep
6. Tunas tungkai dipotong dengan gunting pegas atau dipisahkan dengan
forsep halus sedekat mungkin dengan tubuh, digenggam dan dipindahkan ke
CAM ayam inang umur 8-10 hari budidaya ex ovo

Bagian 8: Pengumpulan sampel tumor

1. Biopsi tumor dikumpulkan dalam tabung eppendorf 2 ml yang diisi dengan
media kultur spesifik sel tumor dan disimpan pada suhu kamar
2. Biopsi tumor dipotong menjadi 1-2 mm 3 bagian dengan pisau bedah steril
3. Sepotong dari inti sampel biopsi dicangkokkan ke CAM ayam inang berumur
8-10 hari yang dibudidayakan secara ex ovo

Bagian 9: Prosedur pencangkokan

1. Untuk pencangkokan tunas tungkai atau spesimen tumor, digunakan CAM
embrio ayam umur 8-10 hari yang telah berkembang penuh yang dikultur
secara ex ovo.
2. Cangkokan idealnya ditempatkan pada CAM dekat bifurkasi y dari pembuluh
darah
 3. Di lokasi aplikasi yang diinginkan, CAM secara selektif mengalami trauma
dengan pengikisan lembut (forceps) bagian peridermal atas dari lapisan epitel
ganda, membiarkan lapisan basal tetap utuh
4. Cangkok ditransfer ke CAM dengan pbs minimal terpasang
5. Cangkok digenggam dengan forsep halus dan dilapiskan ke CAM

Bagian 10: Pencangkokan kembali

1. Embrio ayam inang dibunuh dengan pemenggalan kepala
2. CAM yang telah dicangkokkan dicabut dengan memotong melingkar dengan
gunting runcing dan dipindahkan ke cawan petri yang diisi dengan pbs
3. CAM yang berlebihan dipotong dari cangkok dengan gunting pegas, kecuali
untuk bekas tempat perlekatan
4. Dalam kasus sampel tumor yang lebih besar, cangkok dipotong menjadi dua
atau beberapa bagian yang lebih kecil dan dicangkokkan kembali dengan
ujung tombak menghadap CAM baru dari inang kedua