VALIDASI METODE ANALISIS ASESULFAM-K DAN

ASPARTAM DALAM MINUMAN SERBUK INSTAN DENGAN

METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
(KCKT)

SKRIPSI

Disusun oleh :
MUFIDAH
08613141

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS ISLAM INDONESIA
YOGYAKARTA
JUNI 2012
 VALIDASI METODE ANALISIS ASESULFAM-K DAN
ASPARTAM DALAM MINUMAN SERBUK INSTAN DENGAN
METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
(KCKT)

SKRIPSI
Diajukan untuk memenuhi salah satu syarat mencapai gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Islam Indonesia

Disusun oleh :
MUFIDAH
08613141

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS ISLAM INDONESIA
YOGYAKARTA
JUNI 2012

i
ii
iii
 PERNYATAAN

Dengan ini saya menyatakan bahwa dalam skripsi ini tidak terdapat karya
yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu Perguruan
Tinggi dan sepanjang pengetahuan saya, juga tidak terdapat karya atau pendapat
yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain kecuali yang secara tertulis
diacu dalam naskah ini dan diterbitkan dalam daftar pustaka.

Yogyakarta, Mei 2012

Penulis,

Mufidah

iv
 HALAMAN PERSEMBAHAN
Bismillahirrohmanirrohim...
Alhamdulillahirobbil’alamin.. Ya Allah terima kasih atas segala nikmat dan
karuniaMu, akhirnya kewajibanku dijenjang perkuliahan S1 dapat
terselesaikan dan atas ridhoMu akan ku lanjutkan studi ku menuju ke
jenjang yang lebih tinggi lagi..

Karya skripsiku ku persembahkan untuk......

Orang tua tercinta, mamah, jideh, jidi, chal, ati terima kasih atas doa,
pengorbanan, segala kasih sayang, dan motivasi yang diberikan, sehingga
dapat menyelesaikan studiku di S1. Untuk kakak2 ku Hana dan Najmah,
adik2ku Nafilah, Iman, dan Fifi yang selalu memeberikan semangat dan
motivasi untuk mengerjakan menyelesaikan kuliahku dalam menuju
keberhasilanku...
Thanks for All... insyaAllah I will do better and better...

Terima kasih juga untuk....

Sohib-sohibku tesayang Selly, Iya, Ida, Koto, Icha, Er, Rani, Adel, Witry,
Endah, Ayu, Moya, Nungki, Diyah, yang selalu menemani, memberi
dukungan, semangat, keceriaan,dan telah membuat hidupku indah menjadi
lebih indah,, :) Mengenal kalian adalah suatu kebahagian dalam hidupku... :)
Patner ngelabku Ilham yang telah membantu dalam penelitian ini.

“Man jadda wa jadda...

“Siapa yang bersungguh-sungguh pasti dapat”

“Choirunnas yanfau linnas”

Sebaik-baiknya manusia adalah yang bermanfaat bagi manusia lainnya..

v
 KATA PENGANTAR

Alhamdulillah segala rasa syukur penulis kehadirat Allah SWT, berkat

rahmat dan inyah-Nya yang dilimpahkan sehingga penulis memperoleh kekuatan
tenaga dan fikkiran, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini dengan
segala kenikmatan-Nya. Shalawat serta salam penulis haturkan pada Nabi akhir
zaman, Nabi Muhammad SAW yang senantiasa menuntun seluruh umat manusia
ke jalan Allah SWT.
Skripsi ini ini disusun berdasarkan hasil penelitian penulis dengan judul
“VALIDASI METODE ANALISIS ASESULFAM-K DAN ASPARTAM
DALAM MINUMAN SERBUK INSTAN DENGAN METODE
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)” untuk memenuhi
salah satu syarat mencapai gelar sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Farmasi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Islam Indonesia
Yogyakarta.
Dalam menyusun Skripsi ini penulis menyadari telah banyak mendapat
bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu penulis mengucapkan terima kasih
kepada:
1. Bapak Yandi Syukri, S.Si., M.Si., Apt, selaku Dekan FMIPA Universitas Islam
Indonesia Yogyakarta.
2. Bapak M. Hatta Prabowo, M.Si., Apt, selaku ketua Program Studi Farmasi
FMIPA Universitas Islam Indonesia Yogyakarta dan selaku pembimbing I,
terima kasih untuk semua ilmu, nasehat dan sarannya.
3. Bapak Ari Wibowo, S.Farm., Apt, selaku pembimbing II, terima kasih untuk
semua ilmu, kritik dan sarannya.
4. Ibu Dr. RR. Endang Lukitaningsih, M.Si., Apt, selaku penguji, terima kasih
untuk semua ilmu, kritik dan sarannya.
5. Bapak Dr. Abdul Rohman, M.Si., Apt, selaku penguji, terima kasih untuk
semua ilmu, kritik dan sarannya.

vi
6. Dosen-dosen Program Studi Farmasi FMIPA UII, yang telah telah memberikan
ilmu kepada penulis selama ini.
7. Orang tua, kakak, dan adik penulis yang telah memberi motivasi dalam
menyelesaikan skripsi ini.
8. Semua pihak yang telah membantu dalam pelaksanaan dalam penyusunan
skripsi.

Dalam penyusunan skripsi ini penulis menyadari masih terdapat banyak

kekurangan sehingga penulis mengharapkan masukan dan saran dalam perbaikkan
skripsi ini. Sehingga skripsi ini dapat bermanfaat bagi penerapan ilmu farmasi di
masyarakat.

Yogyakarta, Mei 2012

Penulis,

Mufidah

vii
 DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL........................................................................................ i
HALAMAN PENGESAHAN PEMBIMBING ............................................... ii
HALAMAN PENGESAHAN PENGUJI ....................................................... iii
HALAMAN PERNYATAAN ........................................................................ iv
HALAMAN PERSEMBAHAN ..................................................................... v
KATA PENGANTAR ................................................................................... vi
DAFTAR ISI .................................................................................................. viii
DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... xi
DAFTAR TABEL .......................................................................................... xii
DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................. xiii
INTISARI ...................................................................................................... xiv
ABSTRACT .................................................................................................... xv
BAB I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang Masalah ............................................................... 1
B. Perumusan Masalah ...................................................................... 3
C. Tujuan Penelitian .......................................................................... 3
D. Manfaat Penelitian ....................................................................... 3
BAB II. STUDI PUSTAKA
A. Tinjauan Pustaka .......................................................................... 4
1. Pemanis buatan ........................................................................ 4
2. Asesulfam-K (ACS) ................................................................ 4
3. Aspartam (ASP) ....................................................................... 6
4. Metode analisis ACS dan ASP ................................................. 7
a. Spektrofotometri UV-Vis ................................................... 7
b. Spektrofotometri inframerah .............................................. 8
c. Metode elektroforesis ......................................................... 8
d. Metode voltametri ............................................................. 8
e. Metode KCKT .................................................................. 8
5. Teori kromatografi ................................................................. 9
a. Prinsip kerja KCKT ........................................................... 9

viii
 b. Mekanisme pemisahan ...................................................... 9
c. Instrumen KCKT ............................................................... 10
6. Validasi metode......................................................................... 12
a. Definisi .............................................................................. 12
b. Kategori uji yang terdapat dalam USP dan ICH .............. 13
7. Parameter validasi .................................................................... 16
a. Akurasi ............................................................................... 16
b. Presisi ................................................................................. 16
c. LOD dan LOQ .................................................................... 17
d. Spesifitas ............................................................................ 17
e. Linieritas dan rentang ........................................................ 17
f. Kekerasan .......................................................................... 17
g. Ketahanan .......................................................................... 18
B. Landasan Teori .............................................................................. 19
C. Hipotesis ........................................................................................ 19
BAB III. METODE PENELITIAN ........................................................... 20
A. Alat dan Bahan ............................................................................. 20
1. Alat .......................................................................................... 20
2. Bahan ...................................................................................... 20
B. Cara Penelitian............................................................................... 21
1. Pembuatan fase gerak ........................................................... 21
2. Penetapan waktu retensi ........................................................ 21
3. Kondisi KCKT ...................................................................... 21
4. Pembuatan larutan stok .......................................................... 21
5. Pembuatan kurva baku ........................................................... 22
6. Validasi metode ..................................................................... 22
7. Preparasi sampel dan penetapan kadar ................................... 23
C. Analisis Hasil ............................................................................... 24
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................... 26
A. Uji Kesesuaian Sistem .................................................................. 26
1. Faktor kapasitas ..................................................................... 27
2. Resolusi .................................................................................. 28

ix
 3. Faktor tailing .......................................................................... 28
4. Jumlah plat teoritis ................................................................. 29
B. Validasi Metode ............................................................................ 30
C. Penetapan kadar sampel minuman serbuk .................................... 37
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan .................................................................................. 40
B. Saran ............................................................................................. 40
DAFTAR PUSTAKA .................................................................................... 41
LAMPIRAN ................................................................................................... 43

x
 DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Struktur kimia ACS ................................................................... 5

Gambar 2. Struktur kimia ASP .................................................................... 6
Gambar 3. Instrumen KCKT ........................................................................ 10
Gambar 4. Kromatogram standar (ACS, ASP) dan sampel (minuman serbuk
instan yang mengandung ACS dan ASP) ........................................ 27
Gambar 5. Grafik kurva baku ACS ............................................................. 31
Gambar 6. Grafik kurva baku ASP .............................................................. 32

xi
 DAFTAR TABEL

Tabel I. Elemen-elemen data yang dibutuhkan untuk uji validasi ........... 15

Tabel II. Karakteristik validasi dan jenis prosedur analisisnya ................. 15
Tabel III. Data jumlah plat teoritis sampel ................................................ 29
Tabel IV. Parameter uji kesesuaian sistem metode KCKT yang digunakan
pada analisis ACS dan ASP dalam sampel ................................. 29
Tabel V. Luas area kurva baku ACS ........................................................ 30
Tabel VI. Luas area kurva baku ASP ......................................................... 31
Tabel VII. Nilai linieritas (r) dan Vx0 ACS dan ASP ................................... 32
Tabel VIII. Persyaratan RSD pada konsesntrasi tertentu ............................. 33
Tabel IX. Nilai presisi (intraday) luas area ACS dan ASP ......................... 33
Tabel X. Nilai akurasi ACS ...................................................................... 34
Tabel XI. Nilai akurasi ASP ....................................................................... 35
Tabel XII. Nilai LOD- LOQ senyawa ACS dan ASP .................................. 36
Tabel XIV. Hasil perhitungan kadar ACS dalam minuman sebuk rasa jeruk dan
jambu ......................................................................................... 37
Tabel XV. Hasil perhitungan kadar ASP dalam minuman serbuk rasa jeruk dan
jambu ......................................................................................... 37

xii
 DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Perhitungan faktor kapasitas ................................................... 43

Lampiran 2. Perhitungan resolusi ................................................................ 45
Lampiran 3. Perhitungan faktor tailing ....................................................... 47
Lampiran 4. Perhitungan jumlah plat (N) .................................................... 59
Lampiran 5. Perhitungan pengenceran seri kadar kurva baku campuran ACS
dan ASP .................................................................................... 51
Lampiran 6. Perhitungan stok pembuatan sampel ....................................... 53
Lampiran 7. Perhitungan nilai Vx0 ACS danASP ......................................... 54
Lampiran 8. Perhitungan LOD dan LOQ ACS dan ASP ........................... 56
Lampiran 9. Perhitungan presisi ACS dan ASP ......................................... 57
Lampiran10. Perhitungan akurasi ACS dan ASP .......................................... 58
Lampiran 11. Penetapan kadar ACS dan ASP ............................................. 60
Lampiran 12. Kromatogram standar ACS danASP ....................................... 62
Lampiran 13. Kromatogram presisi standar ACS dan ASP ........................... 64
Lampiran 14. Kromatogram akurasi ACS dan ASP ...................................... 65
Lampiran15. Kromatogram sampel standar ACS dan ASP .......................... 66

xiii
 VALIDASI METODE ANALISIS ASESULFAM-K DAN ASPARTAM
DALAM MINUMAN SERBUK INSTAN DENGAN METODE
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

INTISARI

Asesulfam-K (ACS) dan aspartam (ASP) merupakan jenis pemanis buatan yang
banyak digunakan pada produk minuman di pasaran. Kedua pemanis tersebut
dapat menyebabkan efek yang merugikan kesehatan ketika dikonsumsi pada dosis
tinggi. Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian untuk menjamin kadar ACS dan
ASP yang terkandung dalam minuman serbuk instan masih memenuhi persyaratan
acepptable daily intake (ADI). Metode KCKT merupakan metode yang
direkomendasikan oleh British Standard untuk menganalisis ACS dan ASP dalam
campuran makanan dan minuman. Pada British Standard versi EN 12856 tahun
1999 menunjukan waktu retensi untuk masing-masing ACS dan ASP adalah 5 dan
30 menit, dengan menggunakan fase diam C18, fase gerak bufer fosfat : asetonitril
(90 : 10), dan flow rate 0,8 ml/menit, sehingga perlu dilakukan pengembangan
metode analisis untuk memperoleh waktu retensi dan resolusi yang lebih baik.
Metode ini menggunakan fase diam C18, fase gerak bufer fosfat : asetonitril
(80:20), dan flow rate 1 ml/menit. Hasil penelitian menunjukkan perubahan waktu
retensi untuk ACS (3,7 menit) dan ASP (6,4 menit) nilai resolusi 3,17 (ACS) dan
7,60 (ASP). Hasil parameter validasi berupa presisi RSD ACS (0,371%) dan ASP
(0,014%), rata-rata akurasi 101,06% (ACS) dan 101,11% (ASP), linieritas (ACS)
0,9997 dan (ASP) 0,99992, LOD (ACS) 4,78 ppm dan (ASP) 0,74 ppm, LOQ
ACS (14,51 ppm) dan ASP ( 2,2405 ppm) memenuhi persyaratkan oleh AOAC.
Kadar rata-rata pada sampel rasa jambu ACS (20,05 mg ± 0,00) dan ASP
(50,89 mg ± 0,00). Pada sampel rasa jeruk ACS (27,25 mg ± 0,00) dan ASP
(75,95 mg ± 0,00). Kadar ACS dan ASP yang tekandung dalam sampel masih
dibawah nilai yang diperbolehkan oleh ADI (WHO).

Kata kunci: asesulfam-K, aspartam, KCKT, minuman, dan validasi metode.

xiv
 VALIDATION OF METHOD ANALYSIS ACESULFAME-K AND
ASPARTAME IN POWDER INSTANT BEVERAGE USED HIGH
PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

ABSTRACT

Acesulfame-K (ACS) and aspartame (ASP) are part of artificial sweeteners that
used in beverage products at market. ACS and ASP have several dangers effect
when consumed in high dosage, so it need to research concerned amount in
beverage products at the market. HPLC methods are recommended by British
Standard to analysis ACS and ASP in compound food and beverages. British
Standard versi EN 12856 ; 1999. ASP has retention time 30 minute and 5 minute
for ACS, with stasionary phase C18, mobile phase buffer phosphat : acetonitril
(90:10), and flow rate 0,8 ml/menit. Finaly to get short time, its necessary to
developed methods with modification mobile phase composition and flow rate
1 ml/minute, stasionary phase used in method is C18 column, and mobile phase
that consists of buffer phosphoric acid : acetonitrile (80:20), with UV detector at
217 nm (ASP) and 227 nm (ACS). The result of methods validation provide that
are, the precision RSD (ACS) 0,371% and (ASP) 0,014%, accuracy (ACS)
101,06% and (ASP) 101,11%, liniearity (ACS) 0,99970 and (ASP) 0,99992, LOD
ACS (4,78 ppm) and ASP (0,74 ppm), and LOQ (ACS) 14,51 ppm dan (ASP)
2,24 ppm. That result is based on AOAC recommendation value. Avarage amount
in the sampel guava taste is ACS (20,05 mg ± 0,00) and ASP (50,89 mg ± 0,00).
Orange taste is ACS (27,25 mg ± 0,00) and ASP (75,95mg ± 0,00) This amount
fulfill to the requirement are allowed in ADI (WHO).

Key word : acesulfame-K, aspartame, HPLC, Bevarage, and validation of method

xv
 BAB I
PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Masalah

Keamanan pangan adalah upaya yang diperlukan untuk mencegah pangan
dari kemungkinan cemaran biologis, kimia, dan benda lain yang dapat
mengganggu, merugikan dan membahayakan kesehatan manusia. Pangan yang
aman, bermutu, dan bergizi sangat penting peranannya bagi pertumbuhan,
pemeliharaan, peningkatan derajat kesehatan dan kecerdasan masyarakat. Oleh
karena itu, masyarakat perlu dilindungi dari pangan yang dapat merugikan atau
membahayakan kesehatan, termasuk dalam penggunaan pemanis buatan yang
berlebih sebagai tambahan pangan(1). Bahan tambahan pangan merupakan bahan
yang sengaja ditambahkan ke dalam makanan(2).
Pemanis buatan merupakan bahan tambahan pangan yang sering
digunakan untuk memberikan rasa manis pada makanan atau minuman. Pemanis
buatan sedikit atau tidak mempunyai nilai gizi. Pemanis buatan hanya boleh
ditambahkan ke dalam produk pangan dalam jumlah tertentu(3), sehingga perlu
dilakukan penelitian terkait dengan kadar pemanis buatan yang digunakan pada
produk-produk yang beredar dipasaran. Hal ini dilakukan untuk mengetahui
tingkat keamanan dari produk yang banyak beredar di pasaran. Bahan-bahan
pemanis yang sering digunakan diantaranya adalah Na sakarin, Na siklamat,
aspartam dan asesulfam-K.
Asesulfam-K (ACS) dan aspartam (ASP) merupakan pemanis buatan yang
paling dominan digunakan pada makanan dan minuman yang beredar di pasaran
khususnya minuman instan. ACS 200 kali lebih manis daripada gula, sedangkan
aspartam memiliki tingkat kemanisan relatif sebesar 60 - 220 kali. ASP
merupakan pemanis buatan yang paling kontroversial karena potensi
toksisitasnya(4). Selain itu penggunaan ASP berbahaya bagi penderita penyakit
fenilketonurik, karena penderita penyakit ini tidak dapat memetabolisme fenil
alanin. Fenil alanin merupakan hasil metabolit dari ASP. Penimbunan fenil
piruvat yang terbentuk dari fenil alanin dalam otak yang akhirnya dapat

1
 2

menyebabkan kerusakan otak dan kecatatan mental(4), sedangkan ACS tidak

dapat dicerna, bersifat non glikemik dan non karsinogenik. Namun, percobaan
pada tikus dengan menggunakan ACS dosis tinggi dapat menyebakan kerusakan
genetik pada tikus. JECFA (Join Expert Committe on Food Additives)
mengijinkan ASP dan ACS sebagai pemanis buatan dengan nilai ADI ASP 50
mg/kg berat badan dan ACS 15 mg/kg berat badan(4,5) .
Sampai saat ini beberapa metode yang digunakan untuk menganalisis ASP
dan ACS yaitu metode voltametri, kapiler elektroforesis, dan FTIR
(spektrofotometri infrared), akan tetapi metode tersebut memerlukan proses
preparasi sampelnya cukup panjang dengan penambahan beberapa reagen dan
kurang sensitif(6,7,8). Metode KCKT (kromatografi cair kinerja tinggi) merupakan
metode analisis yang direkomendasikan oleh British Standard (BS EN) untuk
menganalisis ASP dan ASP dalam campuran makanan dan minuman karena
metode ini memiliki kemampuan pemisahan senyawa yang cukup baik, penyiapan
sampel relatif mudah, lebih selektif dan sensitif. Oleh karena itu metode KCKT
sangat cocok digunakan untuk menganalisis pemanis buatan ASP dan ACS dalam
produk minuman yang menggunakan pemanis buatan(8).
Pada penelitian ini akan dilakukan perubahan pada flow rate (kecepatan
alir) dari 0,8 ml/menit menjadi 1 ml/menit sehingga akan mempercepat proses
elusi dan waktu retensi ACS dan ASP. Selain itu untuk mendapatkan penyerapan
yang maksimal, ACS dan ASP akan dilakukan pembacaan pada panjang
gelombang yang maksimal untuk masing-masing senyawa yaitu dengan panjang
gelombang 227 nm untuk ACS dan 217 nm untuk ASP, karena dilakukan
perubahan prosedur analisis diantaranya yaitu flow rate 1 ml/menit, komposisi
fase gerak, serta proses preparasi sampel, oleh karena itu perlu dilakukan validasi
metode untuk memastikan metode analisis yang digunakan akurat, spesifik,
reprodusibel, dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis. Parameter
validasi yang diukur pada penelitian ini adalah akurasi, presisi, linieritas, LOD,
dan LOQ. penelitian ini penting dilakukan supaya ditemukan metode penetapan
kadar ACS dan ASP yang lebih baik. Sehingga dapat diterapkan dalam analisis
penetapan kadar ACS dan ASP.

2
 B. Rumusan Masalah
Berdasakan latar belakang masalah diatas, maka dirumuskan suatu permasalahan
sebagai berikut:
1. Apakah parameter validitas metode analisis yang dikembangkan memenuhi
parameter AOAC ?
2. Apakah metode analisis yang digunakan dapat menentukan untuk kadar ACS
dan ASP dalam minuman serbuk instan?
3. Apakah kadar ACS dan ASP yang ada pada minuman serbuk instan sudah
memenuhi persyaratan Acceptable Daily Intake (ADI) ?

C. Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan :
1. Untuk mengetahui apakah parameter validitas metode analisis yang
dikembangkan memenuhi parameter AOAC.
2. Untuk mengetahui metode analisis yang digunakan dapat menentukan kadar
ACS dan ASP dalam minuman serbuk instan.
3. Untuk mengetahui kadar ACS dan ASP yang terkandung dalam minuman
serbuk instan memenuhi persyaratan Acceptable Daily Intake (ADI)?

D. Manfaat Penelitian
Penelitian ini bermanfaat :
1. Penggunaan metode KCKT untuk menganalisis ACS dan ASP yang
terkandung dalam minuman serbuk instan.
2. Dapat menjadi masukkan kepada BPOM dalam menetapkan kadar pemanis
buatan dengan metode KCKT yang validitasnya baik.
3. Memberikan jaminan informasi kepada masyarakat mengenai kewaspadaan
terhadap pemanis buatan yaitu kadar ACS dan ASP pada minuman serbuk
instan.
 BAB II
STUDI PUSTAKA

A. Tinjauan Pustaka
1. Pemanis
Pemanis buatan atau pengganti gula adalah zat kimia yang sering
digunakan dari pada sukrosa (gula pasir) untuk memaniskan makanan dan
minuman. Karena pemanis buatan beberapa kali lebih manis daripada sukrosa,
pemanis buatan hanya membutuhkan jumlah yang lebih kecil untuk memberikan
rasa yang manis pada tingkat yang sama(11).
Pemanis buatan diperoleh secara sintesis melalui reaksi-reaksi kimia di
laboratorium maupun skala industri. Karena diperoleh melalui proses sintesis
dapat dipastikan bahan tersebut mengandung senyawa-senyawa sintesis.
Penggunaan pemanis buatan perlu diwaspadai karena dalam takaran yang berlebih
dapat menimbulkan efek samping yang merugikan kesehatan manusia. Hasil
penelitian menunjukkan bahwa beberapa jenis pemanis buatan berpotensi
menyebabakan tumor dan bersifat karsinogenik. Oleh karena itu Organisasi
Kesehatan Dunia World Health Organization (WHO) telah menetapkan batas-
batas yang disebut Acceptable Daily Intake (ADI) atau kebutuhan per orang per
hari, yaitu jumlah yang dapat dikonsumsi tanpa menimbulkan risiko. Sejalan
dengan itu di negara-negara Eropa, Amerika dan juga indonesia telah ditetapkan
standar penggunaan pemanis buatan pada produk makanan(11).

2. Asesulfam-K (ACS)
ACS dengan rumus kimia C4H4KNO4S atau garam kalium dari 6-methyl-
1,2,3-oxathiazin-4(3H)-one-2,2-dioxide atau garam Kalium dari 3,4-dihydro-6-
methyl-1,2,3-oxathiazin-4-one-2,2-di-oxide merupakan senyawa yang tidak
berbau, berbentuk tepung kristal berwarna putih, mudah larut dalam air dan
berasa manis dengan tingkat kemanisan relatif sebesar 200 kali tingkat
kemanisan sukrosa tetapi tidak berkalori. ACS stabil pada larutan encer pH 3,0-
3,5 dalam suhu 20°C. Penggunaan ACS dikombinasi dengan asam aspartat dan

4
 5

natrium siklamat bersifat sinergis dalam mempertegas rasa manis gula(12) .

berikut gambar struktur kimia ACS dibawah ini:

K+
O

O
S
O CH3
O

Gambar 1. Struktur kimia ACS

ACS ditemukan pada tahun 1967 oleh kimiawan Karl Clauss. Dia
melihat rasa manis ketika dia menjilat jarinya saat bekerja di laboratorium. ACS
disetujui di Amerika Serikat pada tahun 1988 untuk keperluan tertentu, termasuk
pemanis tablet. Pada tahun 1998, FDA menyetujui ACS untuk digunakan dalam
minuman. Secara khusus, ACS telah digunakan untuk mengurangi rasa pahit
dari ASP dan dapat ditemukan dalam produk yang mengandung Nutrasweet.
Pada tahun 2003, telah disetujui untuk penggunaan umum dalam makanan,
termasuk daging atau unggas(4) .

Stabilitas ACS
Stabilitas dan Kondisi Penyimpanan ACS memiliki stabilitas yang
baik. Dalam bentuk bulk tidak menunjukkan tanda dekomposisi pada suhu
lingkungan selama bertahun-tahun. Dalam larutan berair pKa 2,2 (pH 3,0-3,5
pada 20°C) tidak ada penurunan manis diamati selama jangka waktu sekitar 2
tahun. Stabilitas pada temperatur tinggi yang baik, meskipun beberapa
dekomposisi tercatat penyimpanan berikut pada 40°C selama beberapa bulan.
Sterilisasi dan pasteurisasi tidak mempengaruhi rasa ACS. Bahan massal
harus disimpan dalam wadah tertutup baik dalam tempat kering dan
terlindung dari cahaya(12) .
 6

3. Aspartam (ASP)
ASP atau aspartil fenilalanin metil ester (APM) dengan rumus kimia
C14H18N2O5 atau 3-amino-N(α-carbomethoxy-phenethyl)succinamic acid, N-L-α-
aspartyl-L-phenylalanine-1-methyl ester merupakan senyawa yang tidak berbau,
berbentuk tepung kristal berwarna putih, sedikit larut dalam air, berasa manis dan
stabil dalam kondisi kering dan larutan encer. ASP memiliki tingkat kemanisan
relatif sebesar 60 sampai dengan 220 kali tingkat kemanisan sukrosa, dengan nilai
kalori sebesar 0,4 kkal/g atau setara dengan 1,67 kJ/g. Kombinasi penggunaan
ASP dengan pemanis buatan lain dianjurkan terutama untuk produk-produk
pangan dalam mempertegas cita-rasa buah(11,12). Berikut struktur kimia ASP dapat
dilihat pada gambar 2.
O O
O

NH2
N
H

OH

Gambar 2. Struktur kimia ASP

ASP pertama kali disetujui oleh FDA pada tahun 1981 sebagai table top,
pada tahun 1996, itu disetujui sebagai pemanis umum tujuan dalam semua
makanan dan minuman. Sejak persetujuan, ASP telah digunakan lebih dari 6.000
produk oleh ratusan juta orang di negara-negara di seluruh dunia(5).
Ketika ASP dikonsumsi maka akan dihidrolisis di lumen usus ke dalam
komponen-komponennya yaitu menjadi, asam aspartat, fenilalanin, dan metanol.
Komponen ini kemudian diserap ke dalam darah dan masing-masing
dimetabolisme. Telah dihipotesiskan bahwa baik ASP maupun komponen lain
yang terakumulasi dalam tubuh,akan digunakan oleh tubuh dengan cara yang
sama. Dosis tunggal ASP 34 mg/kg. Salah satu metabolit, metanol, telah terbukti
untuk lebih dimetabolisme menjadi formaldehyde dan asam formiat.
Perkembangan asidosis metabolik telah terjadi dengan tingkat darah yang
signifikan dari asam formiat(5) .
 7

Penelitian baru dari Soffritti pada tahun 2007 memberikan bukti potensi
karsinogenik dari senyawa ini. Penelitian ini dilakukan menggunakan tikus
Sprague Dawley, hasil penelitian ini telah menunjukkan peningkatan yang
signifikan dari tumor ganas pada laki-laki, peningkatan insiden limfoma dan
leukemia pada laki-laki dan perempuan, dan peningkatan kejadian kanker
payudara pada wanita. Hasil ini memperkuat dan mengkonfirmasi penelitian
sebelumnya yang juga menunjukkan potensi karsinogenisitas ASP dan potensi
karsinogenik meningkat jika paparan terjadi selama kehamilan. Hal ini dicatat
bahwa dosis diuji didekati ADI untuk manusia(4).

Stabilitas ASP
ASP memiliki pH 4,5-6 dalam air. ASP stabil dalam kondisi kering.
ASP akan terdegradasi pada kondisi suhu yang tinggi, pH yang tinggi dan
dalam kodisi lembab, ASP akan terhidrolisis membentuk produk degradasi
membentuk fenilalanin, asam aspartat dan metanol. ASP stabil dalam larutan
bufer dan pelarut organik pada suhu 25oC dengan pH 3,5-4,5 dan pKa 3,9.
ASP juga terdegradasi selama suhu panas. ASP harus disimpan dalam wadah
tertutup baik, di tempat yang sejuk dan kering. ASP tidak kompatibel dengan
kalsium fosfat pada suasana basa dan juga dengan pelumas magnesium stearat,
aspartam juga bereaksi dengan gula alkohol(11) .

4. Metode analisis ACS dan ASP

Terdapat beberapa metode yang digunakan untuk menganalisis aspartam

antara lain spektrofotometri UV-Vis, FTIR, kapiler elektroforesis, dan
potensiometri.
a. Spektrofotometri UV-Vis
Metode ini digunakan untuk menganalisis ASP dalam minuman
berkarbonasi. Spektrofotometri UV-Vis merupakan metode analisis yang
cepat, efektif dan efisien, namun metode ini memiliki kekurangan yaitu
kurang sensitif, dan tidak dapat memisahkan campuran senyawa sehingga
kurang selektif(19).
 8

b. Spektrofotometri Inframerah (FTIR)

Metode FTIR digunakan untuk menganalisis ACS dan ASP dalam
tabletop. Metode FTIR memiliki beberapa kekurangan yaitu kurang sensitif
dan kurang selektif sehingga tidak cocok digunakan untuk menganalisis
senyawa dalam campuran karena dapat menyebabkan interfensi spektrum(8).
c. Kapiler Elektroforesis
Metode ini digunakan untuk menganalisis ACS dan ASP. Metode
kapiler elektroforesis merupakan metode analisis yang cepat dan efisien,
namun metode ini memiliki beberapa kekurangan antara lain detektornya
kurang sensitif, matriks sampel dapat menyebabkan pergeseran dalam waktu
retensi dan variasi respon luas puncak(7).
d. Metode Voltametri
Motode ini digunakan untuk menganalisis ACS dan ASP dalam
bentuk campuran. Metode ini memerlukan proses ektraksi khusus dalam
proses preparasi sampel dengan penambahan beberapa reagen sehingga
metode ini memerlukan waktu yang cukup lama untuk preparasi sampel
dengan resiko analisis yang cukup tinggi, sehingga metode voltametri
kurang praktis(6).
e. Metode KCKT

Analisis bahan tambahan di dalam minuman pada penelitian ini

menggunakan metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT), karena
analisis dengan KCKT cepat, daya pisah baik, peka, penyiapan sampel
relatif mudah, dan dapat dihubungkan dengan detektor yang sesuai.
Beberapa pustaka menunjukkan bahwa metode KCKT fase terbalik
merupakan metode terpilih untuk analisis campuran bahan tambahan
tersebut, karena zat-zat tersebut bersifat polar dan larut dalam air sehingga
sulit dipisahkan menggunakan KCKT fase normal yang menggunakan
kolom polar dan fase gerak yang bersifat non polar(10) .
 9

5. Teori Kromatografi

KCKT adalah bentuk modern dari kromatografi cair. Kromatografi cair

(Teknik pemisahan fisik yang dilakukan dalam fase cair) sampel dipisahkan
menjadi komponen-komponen penyusunnya (analit) dengan mendistribusikan
antara fase gerak (cairan mengalir) dan fase stasioner (sorbent dikemas dalam
kolom )(14) .
KCKT (Kromatografi cair kinerja tinggi) atau biasa disebut dengan HPLC
(high performance liquid chromatography) dikembangkan pada akhir tahun 1960-
an dan awal tahun 1970-an. Saat ini KCKT merupakan teknik pemurnian yang
diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu
sampel pada sejumlah bidang, antara lain: farmasi, lingkungan, bioteknologi,
polimer, dan industri makanan. Kegunaan umum KCKT adalah untuk pemisahan
dan penentuan senyawa organik dan anorganik dalam suatu sampel khususnya
sampel-sampel yang berkaitan dengan biologi, farmasi, makanan, lingkungan,
industri, dll. KCKT paling sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa-
senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat, dan protein-protein
dalam fisiologis, menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil
samping proses sintesis atau produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi(10).
a. Prinsip kerja KCKT
Prinsip kerja KCKT adalah perbedaan kekuatan interaksi antara solut-
solut terhadap fase diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan
fase diam akan keluar dari kolom lebih dahulu. Sebaliknya, solut-solut yang
kuat berinteraksi dengan fase diam maka solut-solut tersebut akan keluar dari
kolom lebih lama. Setiap komponen campuran yang keluar kolom dideteksi
oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram(15).
b. Mekanisme Pemisahan
Berdasarkan Mekanisme retensi kromatografi cair kinerja tinggi
dikelompokan menjadi :
(1) Adsorpsi Fase terikat (bonded phase chromatography)
(2) Penukar ion (ion exchange)
(3) Eksklusi ukuran (size exclusion)
(4) Partisi (partition)
 10

Analisa kadar ACS dan ASP dapat menggunakan mekanisme partisi.

Retensi solut dan pemisahan dalam kromatografi partisi analog dengan proses
ekstraksi cair-cair dalam sistem kromatografi fase terbalik (reversed phase
chromatography). Biasanya fase gerak lebih polar dari pada fase diam (10).
c. Instrumen KCKT
Pada dasarnya terdiri atas 8 komponen pokok yaitu: wadah fase gerak,
sistem penghantar fase gerak, alat untuk memasukkan sampel, kolom,
detektor, wadah penampung buangan fase gerak, tabung penghubung, dan
suatu komputer atau integrator atau perekam(15). Beberapa instrumen akan
dijelaskan dibawah ini
Pemasukan
sampel
Kolom analitis

Waduk pelarut
Perekam data

Filter

Penunjuk tekanan
dan flow
Pemroses data

Pompa

Detektor

Gambar 3. Instrument HPLC(10) .

(1) Fase gerak

Fase gerak dalam KCKT adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen
atau pelarut. Fungsi fase gerak adalah membawa komponen-komponen
campuran menuju fase diam dan juga berinteraksi dengan solut-solut. Pada
KCKT fase gerak merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses
pemisahan. Zat cair yang akan digunakan sebagai fase gerak KCKT harus
memenuhi beberapa persyaratan sebagai berikut:
 11

(a) Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan
yang akan dianalisis.
(b) Zat cair harus murni untuk menghindarkan masuknya kotoran yang
dapat mengganggu interpretasi kromatogram.
(c) Zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan
pada kolom. Biasanya pelarut disaring dengan saringan nilon
berukuran diameter pori 0,45 µm. Pompa vakum biasanya
digunakan untuk menyaring partikel kotoran sekaligus
menghilangkan gas dari pelarut karena gas dapat mengganggu base
line.
(d) Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan
tidak beracun.
(e) Zat cair tidak kental. Umumnya kekentalanya tidak melebihi 0,5 cP
(centi poise).
(f) Sesuai dengan detektor. Contoh untuk detektor UV pelarut tidak
boleh menyerap cahaya pada panjang gelombang yang dipakai.
(2) Pompa
Pada KCKT pompa dapat dianologikan dengan jantung pada
manusia berfungsi mengalirkan fase gerak cair melalui kolom yang berisi
serbuk halus. Pompa yang digunakan dalam KCKT harus memenuhi
persyaratan: tekanan sampai 6000 psi (pons/in2), keluaran bebas pulsa,
kecepatan alir berkisar antara 0,1-1,0 mL/menit dan bahan tahan korosi.
(3) Pemasukan cuplikan
Kadang kala faktor ketidaktepatan pengukuran KCKT terletak pada
keterulangan pemasukan cuplikan ke dalam kolom. Masalahnya, terlalu
banyak pemasukan cuplikan ke dalam kolom dapat menyebabkan band
broadening. Oleh karena itu cuplikan yang dimasukkan harus sekecil
mungkin, yaitu beberapa puluh mikroliter. Selain itu, perlu diusahakan
tekanan tidak menurun ketika memasukkan cuplikan ke dalam aliran fase
gerak.
 12

(4) Kolom
Kolom KCKT biasanya terbuat dari stainless steel walaupun ada
yang terbuat dari gelas berdinding tebal. Kolom utama berisi fase diam,
tempat terjadinya pemisahan campuran menjadi komponen-
komponennya bergantung pada keperluanya kolom utama dapat
digunakan untuk analisis preparatif. Untuk keperluan preparatif, setiap
komponen yang keluar kolom ditampung pada tabung yang berbeda dan
keluaran KCKT dihubungkan dengan fraction collector. Selain kolom
utama dikenal pula kolom pengaman (guard colum)(15).
(5) Detektor
Berbagai detektor untuk KCKT tersedia walaupun demikian
detektor harus memenuhi persyaratan berikut: cukup sensitif, stabilitas,
dan keterulangan tinggi, respon linier terhadap solut, waktu respon
pendek sehingga tidak bergantung kecepatan alir, reliabilitas tinggi dan
mudah digunakan dan tidak merusak cuplikan(15) .

6. Validasi Metode
a. Definisi
Validasi metode merupakan proses peninjauan ulang prosedur
analisis secara berkala untuk memastikan bahwa prosedur tersebut masih
sesuai bila dipergunakan untuk menyajikan hasil tes yang dapat dipercaya.
Menurut United State Pharmacopeia (USP) validasi metode dilakukan untuk
menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik, reprodusibel, dan tahan
pada kisaran analit yang akan dianalisis(10) .
Validasi metoda analisa adalah suatu tindakan penilaian terhadap
parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan
bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya(18) .
 13

b. Kategori uji yang terdapat dalam USP dan International Conference on

Harmonization (ICH) :
(1) Kategori I
Metode untuk kuantifikasi komponen mayor dalam produk obat
ruahan Active Pharmaceutical Ingredient (API), termasuk senyawa-
senyawa pengawet dalam produk akhir obat, diklasifikasikan dalam
kategori I. Metode uji dan keseragaman kandungan masuk dalam kategori
ini. Metode kategori I menunjukan bahwa klaim kandungan produk obat
memenuhi persyaratan yang dikehendaki. Metode-metode pengujian
biasanya dilakukan dengan menggunakan sampel komplit (misalkan 20
sampel), sementara penentuan keseragaman kandungan dilakakukan
dengan satu unit sampel sediaan obat(20) .
Analisis kelumit tidak disyaratkan pada uji keseragaman
kandungan ini, karenanya penentuan Limit Of Detection (LOD) dan Limit
Of Quantitation (LOQ) dalam uji ini tidaklah penting. Meskipun demikian,
nilai LOD dan LOQ penting dilakukan jika penentuan keseragaman
kandungan terhadap suatau produk obat yang mengandung zat aktif kedua
yang mempunyai kandungan relatif 0,5% atau lebih kecil terhadap
kandungan zat aktif mayor(20).
(2) Kategori II
Metode kategori II ditujukan untuk menentukan pengotor atau
pengganggu impurities dalam ruahan obat (bulk), produk-produk degradasi
dalam produk obat akhir atau dalam proses pembersihan (cleaning
process). Metode ini lebih lengkap dibagi menjadi dua yaitu ke dalam uji
kuantitatif dan uji batas (limit test)(20).
(a) Kuantitatif
Penetuan pengotor (impurities) dan produk-produk degradasi
melibatkan analisis sekelumit yang mana komponen-komponen ini
berada pada level kurang dari 1% terhadap konsentrasi senyawa aktif
obat atau dari klaim label yang tertera dalam produk akhir obat.
Semua parameter yang dibutuhkan untuk diuji pada kategori I dan
nilai LOQ harus ditentukan untuk metode-metode jenis ini. Metode-
 14

metode pembersihan (cleaning method) merupakan suatu kasus

khusus yang mana metode ini dapat dimasukkan ke dalam uji
kuantitatif ataupun ke dalam uji batas(20).
(b) Uji batas ( limit test )
Dalam kasus uji batas, tidak ada proses kuantifikasi yang
terlibat. Sampel dikerjakan terhadap standar yang disiapkan pada
level tertentu. Respon sampel ditentukan baik di atas atau di bawah
jumlah standar, dan hasilnya dinyatakan apakah memenuhi atau
tidak terhadap spesifikasi yang ditentukan. Nilai LOQ tidak
diperlukan dalam metode ini, akan tetapi LOD diperlukan. Spesivitas
merupakan parameter lain selain ruggedness yang diperlukan untuk
validasi jenis metode ini, meskipun akurasi dan kisaran mungkin
juga ditentukan tergantung pada sifat metode(20) .
(3) Kategori III
Metode-metode yang digunakan untuk menentukan karakteristik
kinerja produk akhir jatuh pada kategori III. Uji disolusi (tidak termasuk
pengukurannya) dan uji-uji pelepasan obat merupakan contoh metode
yang masuk kategori ini. Presisi merupakan parameter yang
dipersyaratkan untuk kategori III ini, meskipun parameter-parameter
validasi yang lain juga dapat ditentukan sesuai dengan tujuan yang
diinginkan(20) . Elemen-elemen data yang dibutuhkan untuk uji validasi
yang dapat dilihat pada Tabel I.
 15

Tabel I. Elemen-elemen data yang dibutuhkan untuk uji validasi

Parameter Pengujian Pengujian kategori II Uji

Kinerja Analisis Kategori I kuantitatif Uji batas Kategori III

Akurasi Ya Ya * *

Presisi Ya Ya Tida Ya

Spesifitas Ya Ya Ya *

LOD Tidak Tidak Ya *

LOQ Tidak Ya Tidak *

Linieritas Ya Ya Tidak *

Kisaran (range) Ya Ya * *

Ruggedness Ya Ya Ya Ya

*mungkin dibutuhkan tergantung pada uji spesifiknya

(4) Kategori IV
Uji identifikasi dalam kategori IV hanya membutuhkan uji
spesifisitas untuk validasinya. Karakteristik validasi dan jenis prosedur
analisisnya dapat dilihat pada tabel II .

Tabel II. Karakteristik validasi dan jenis prosedur analisisnya

Jenis Uji kemurnian
prosedur
Analisis identifikasi kuantitatif Uji batas pengujian
Akurasi Tidak Ya Tidak Ya
Presisi
Repeatibilitas Tidak Ya Tidak Ya
Persisi antara Tidak Ya Tidak Ya
Spesifisitas Ya Ya Ya Ya
LOD Tidak Tidak Ya Tidak
LOQ Tidak Ya Tidak Tidak
Linieritas Tidak Ya Tidak Ya
 16

7. Parameter Validasi
a. Akurasi
Akurasi merupakan ketelitian metode analisis atau kedekatan antara
nilai terukur dengan nilai yang diterima baik nilai konvensi, nilai sebenarnya,
atau nilai rujukan. Akurasi diukur sebagai banyaknya analit yang diperoleh
kembali pada suatu pengukuran dengan menggunakan spiking atau addisi pada
suatu sampel(10). Secara umum akurasi didefinisikan sebagai ukuran yang
menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis dengan kadar analit yang
sebenarnya. Kecermatan dinyatakan sebagai persen perolehan kembali
(recovery) analit yang ditambahkan(18) .

% Recovery = x 100 %

Keterangan :
CF : konsentrasi total sampel hasil pengukuran
CA: konsentrasi sampel sebenarnya
C*A : konsentrasi analit yan ditambahkan

b. Presisi
Presisi merupakan ukuran keterulangan metode analisis dan biasanya
diekspresikan sebagai simpangan baku relatif dari sejumlah sampel yang
berada secara statistik. Presisi terdiri atas 3 tingkat yaitu: keterulangan
(repeatability), presisi antara (intermediate precision), dan ketertiruan
(reproducibility)(10) .

Keterangan :
= nilai dari masing-masing pengukuran sampel
= rata-rata dari pengukuran sampel
n = jumlah sampel
 17

c. LOD dan LOQ

LOD (limit of detection) didefinisikan sebagai konsentrasi analit
terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu
dapat dikuantifikasikan. LOD adalah kadar analit yang memberikan respon
sebesar respon blangko (yb) ditambahkan dengan 3 simpangan baku blangko
(3Sb). LOQ (limit of Quantitation) didefinisikan sebagai konsentrasi analit
terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang
dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan. Menurut ICH
(International Conference on Harmonization) untuk menghitung nilai LOD
dan LOQ dapat digunakan 2 metode yaitu metode non instrumental visual dan
dengan metode perhitungan. Metode non instrumental visual digunakan pada
kromatografi lapis tipis dan metode titrimetri. LOD dapat juga dihitung
berdasarkan standar deviasi (SD) respon dan kemiringan (slope) kurva baku
pada level yang mendeteksi LOD sesuai dengan rumus LOD = 3,3 (SD/S).
Untuk LOQ = 10 (SD/S)(10).
d. Spesifitas
Spesifitas adalah kemampuan untuk mengukur analit yang dituju secara
tepat dan spesifik dengan adanya komponen-komponen lain dalam matrik
sampel seperti ketidakmurnian, produk degradasi, dan komponen matriks(10).
e. Linieritas dan rentang
Linieritas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh
hasil-hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit
pada kisaran yang diberikan. Linieritas suatu metode merupakan ukuran
seberapa kurva kalibrasi yang menghubungkan antara konsentrasi (X) dan
respon (Y). Rentang adalah konsentrasi tertinggi dan terendah yang mana suatu
metode analisis menunjukkan akurasi, presisi dan linieritas yang mencukupi
(10,18)
.
f. Kekasaran
Kekasaran (ruggedness) merupakan tingkat reprodusibel hasil yang
diperoleh pada kondisi yang bermacam-macam yang diekspresikan sebagai
standar deviasi relatif (%RSD). Kondisi ini meliputi laboratorium, analisis,
alat, reagen, dan waktu percobaan yang berbeda(10).
 18

g. Ketahanan
Ketahanan merupakan kapasitas metode untuk tetap tidak terpengaruh
oleh adanya variasi parameter metode yang kecil. Ketahanan dievaluasi dengan
melakukan variasi parameter-parameter metode seperti : persentasi pelarut
organik, pH, persentase fase gerak, suhu kolom dan sebagainya kemudian
dilihat efeknya terhadap nilai presisi dan akurasi(18) .
 19

B. Landasan Teori
Penggunaan pemanis buatan seperti ACS dan ASP yang melebihi
batas acceptable daily intake (ADI) dapat menimbulkan efek berbahaya,
seperti tumor, kanker payudara, dan limfoma. Oleh karena itu, pengujian
pemanis buatan dalam produk minuman yang beredar di pasaran perlu
dilakukan secara rutin. Selain dapat memberikan informasi kadar pemanis
buatan, hal ini juga sebagai bentuk pengawasan terhadap produk yang
menggunakan pemanis buatan. Penelitian ini menggunakan metode KCKT
yang direkomendasikan oleh british standard untuk menetapkan kadar ACS
dan ASP. Metode ini perlu dikembangkan karena memiliki waktu retensi
yang lama untuk kedua pemanis buatan tersebut. Pengembangan yang
dilakukan dalam penelitian ini adalah perubahan komposisi fase gerak dapar :
asetonitril (90 : 10) menjadi (80 : 20) dan perubahan flow rate 0,8 ml/menit
menjadi 1 ml/menit. Meskipun perubahan kenaikan flow rate akan
menurunkan efisiensi pemisahan, namun apabila nilai N > 2000 masih
dikatakan baik. Setiap metode yang baru dikembangkan harus dilakukan
upaya pembuktian kehandalanya sehingga perlu dilakukan proses validasi.

C. Hipotesis

1. Metode yang dikembangkan memenuhi persyaratan parameter validitas

yang baik.
2. Metode yang dikembangkan dapat digunakan untuk menentukan kadar
ACS dan ASP.
3. Kadar ACS dan ASP memenuhi persyaratan Accepable Daily Intake
(WHO).
 BAB III
METODE PENELITIAN

Penelitian ini dilakukan dua tahap pekerjaan, yaitu persiapan analisis

dan validasi metode uji ACS dan ASP yang mengacu pada British Standard versi
EN 12856 tahun 1999. Pada validasi ini dilakukan uji presisi, akurasi, linieritas,
limit deteksi, dan limit kuantitatif metode.

A. Alat dan Bahan

1. Alat
Peralatan yang digunakan adalah seperangkat alat KCKT (Waters®
e2695, USA), Detektor UV-Vis (Waters® 2489, USA), kolom C18 (300
mm x 3,9 mm) 10 µm (phenomenex®, USA), timbangan analitik semi
mikro (0,01mg), makrobalance (0,1mg) (Mettler Toledo®, USA), ultrasonic
bath (Branson®, USA), seperangkat alat gelas (Iwaki pyrex) (labu takar
500ml, 200 ml, 100 ml, 50 ml, dan 10 ml. Pipet ukur 5 ml, dan1 ml, Gelas
ukur 250 ml, 200 ml, 100 ml), penyaring, kertas saring 0,45 µm, vakum
penyaring.

2. Bahan
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah standar ACS, (pro
analisis, supeleco, USA) standar ASP (pro analisis, supeleco, USA), Kalium
dihidrogen ortofosfat (KH2PO4) (pro analisis, Merck, Germany), akuabides
(PT. Ikapharmindo Putramas, Indonesia), sampel produk minuman serbuk
instan, acetonitril (HPLC grade, Merck, Germany) larutan carrez I (pro
analisis, Merck, Germany), larutan carrez II (pro analisis, Merck, Germany),
asam phosfat (pro analisis Merck, Germany).

20
 21

B. Cara Penelitian

1. Pembuatan Fase Gerak

a. Larutan Dapar fosfat (KH2PO4) pH 3,5
Dilarutkan 0,85 g kalium dihidrogen ortofosfat dengan 500 mL
aquabidest di dalam gelas beker 500 mL, disesuaikan pH nya menjadi
3,5 menggunakan asam fosfat, kemudian ditambahkan akuabides
sampai tanda batas.
b. Fase Gerak, Dapar phosfat dan acetonitril (80:20)
Larutan dapar fosfat sebanyak 400 mL dimasukan dalam labu
ukur 500 mL, ditambahkan acetonitril sebanyak 100 mL dan dicampur
sampai homogen. fase gerak yang telah dibuat disaring menggunakan
membran filter 0,45 µm dan dilakukan degas selama 5 menit
menggunakan ultrasonic bath.
2. Penetapan Waktu Retensi (RT)
Dibuat campuran larutan baku ACS dan ASP masing-masing 10
ppm sebanyak 10 ml dilarutkan dengan fase gerak diinjeksi sebanyak
10 µL pada KCKT kemudian ditentukan waktu retensi dari ACS dan
ASP.
3. Kondisi HPLC
Kolom : C18 300 x 3,9 mm, 10 µm (phenomenex®)
Detektor : UV diatur panjang gelombangnya, ACS 227 nm dan
ASP 217 nm.
Volume injeksi : 10 µl
Flow : 1 ml/min
Fase gerak : larutan dapar fosfat: acetonitril (80:20)

4. Pembuatan Larutan Stock 500 ppm

Ditimbang seksama 250,0 mg standar ACS, dan 250,0 mg ASP
dimasukkan kedalam labu ukur 500 ml, kemudian dilarutkan dengan
aquabidest sampai tanda batas (larutan ini masing-masing mengandung
500 ppm ACS dan ASP).
 22

5. Pembuatan Kurva Baku

Dibuat larutan ACS dan ASP dengan konsentrasi seri kadar 20
ppm, 40 ppm, 80 ppm, 100 ppm, dan 200 ppm dengan menggunakan
labu ukur ukuran 10 mL. Masing-masing konsentrasi tersebut diperoleh
dengan memipet 0,2 ml, 0,4 ml, 0,8 ml, 2,0 ml, dan 4,0 ml dari larutan
stock 500 ppm, kemudian dimasukkan dalam labu ukur ukuran 10 ml
ditambahkan aquabides sampai tanda batas. diinjeksi sebanyak 10 µL
pada KCKT. Masing-masing nilai AUC yang diperoleh untuk
asesulfam-K dan aspartam digunakan untuk membuat persamaan garis
Y= bx + a

6. Validasi Metode
(1) Penetapan batas deteksi (LOD) dan batas kuantitatif (LOQ).
LOD dan LOQ ditentukan melalui kurva baku yang didapat Nilai
LOD setara dengan 3,3 x (Sy/x)/b sedangkan nilai LOQ setara
dengan 10 x (Sy/x)/b.
(2) Penentuan Presisi (Keseksamaan)
Uji presisi dilakukan untuk melihat kesesuaian antara hasil uji
yang dilakukan secara berulang pada sampel yang diambil dari
campuran yang homogen. Pengujian dilakukan dengan metode
ripitabilitas (keterulangan). Dibuat konsentrasi 40 ppm campuran
ACS dan ASP, dengan mempipet 0,8 ml dari larutan stok 500
ppm, dimasukkan dalam labu ukur 10 ml dan ditambahkan
akuabides sampai batas, diinjeksikan 10 µl pada KCKT sebanyak
6 kali, kemudian dari nilai luas area yang diperoleh, ditentukan
nilai rata-rata luas area, SD, dan RSD.
(3) Penentuan Linieritas
Uji linieritas diperoleh dari persamaan baku y = bx+a yang
dihasilkan. Dilihat nilai r nya.
(4) Akurasi / perolehan kembali
 23

Akurasi dilakukan dengan metode standar adisi. Sampel yang

dianalisis adalah sampel ASP dan ACS. Tercantum kadar
aspartam dan asesulfam-K adalah 32 ppm dan 93 ppm. Analit
yang akan ditambahkan ke dalam sampel adalah 80%, 100%, dan
120%
(a) Perolehan kembali konsentrasi 80 %

Dimasukkan 4,5 mL sampel ke dalam labu ukur 50 mL

(masing-masing mengandung ACS dan ASP dengan
konsentrasi 36,5/91,4 ppm). Ditambahkan larutan standar
ACS dan ASP dengan konsentrasi 29 / 73 ppm.

(b) Perolehan kembali konsentrasi 100 %

Dimasukkan 4,5 mL sampel ke dalam labu ukur 50 mL

(masing-masing mengandung ACS dan ASP dengan
konsentrasi 36,5/91,4 ppm). Ditambahkan larutan standar
ACS dan ASP dengan konsentrasi 35,5/91 ppm.

(c) Perolehan kembali konsentrasi 120 %

Dimasukkan 4,5 mL sampel ke dalam labu ukur 50 mL

(masing-masing mengandung ACS dan ASP dengan
konsentrasi 36,5/91,4 ppm). Ditambahkan larutan standar
ACS dan ASP dengan konsentrasi 43/ 110 ppm.

7. Preparasi Sampel dan penetapan kadar

Ditimbang satu bungkus (10,940g) sampel dimasukkan ke dalam
labu ukur 50 ml, kemudian dilarutkan dengan aquabides, dan
ditambahkan sampai tanda batas. Diambil 4,5 ml larutan sampel
dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml ditambahkan aquabides lalu
ditambahkan 0,6 ml larutan carrez I dan ditambahkan 0,6 ml larutan
carrez II, disaring dengan membran filter pori 0,45 µm.
C. Analisis Hasil
 24

Data yang diperoleh pada penetapan kadar dari sampel di bandingkan

dengan kadar ACS dan ASP yang disyaratkan ADI. Analisis hasil parameter
validasi dapat dibandingkan dengan nilai parameter validasi yang
direkomendasikan AOAC. Untuk perhitungan parameter validasi dapat dilakukan
dengan rumus matematika dibawah ini :

1. Linieritas
Linieritas dapat ditentukan dengan menghitung koefisien korelasi
(r) dari data kurva baku yang diperoleh.
2. Penetapan Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitatif (LOQ)

LOD =

LOQ =

Sy/x =

Keterangan :
Sy/x = simpangan baku residual
b = respon dari kemiringan (slope pada persamaan garis y= bx+a)

3. Akurasi

% Recovery = x 100 %

Keterangan :
CF : konsentrasi total sampel hasil pengukuran
CA: konsentrasi sampel sebenarnya
C*A : konsentrasi analit yang ditambahkan.

4. Presisi
 25

RSD (%) =

Keterangan :
= nilai dari masing-masing pengukuran sampel
= rata-rata dari pengukuran sampel
N = jumlah sampel
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

Pemanis buatan merupakan bahan tambahan pangan. ACS dan ASP

merupakan pemanis buatan yang sering digunakan dalam produk-produk
minuman yang beredar dipasaran, untuk mengetahui keamanan minuman instan
yang mengadung pemanis buatan maka perlu dilakukan penelitian dengan metode
yang sensitif dan akurat yaitu metode KCKT. Metode KCKT merupakan metode
yang direkomendasikan oleh British Standard, sehingga untuk diterapkan di
indonesia maka perlu dilakukan uji kesesuaian sistem dan verifikasi metode agar
metode yang digunakan terbukti memiliki validitas yang baik.

Fase gerak yang digunakan pada penelitian ini adalah kombinasi buffer
phosphat : acetonitril (80:20) dan menggunakan fase diam C18 (300 x 3,9 mm)
ukuran partikel 10 µm yang diharapkan dapat memisahkan analit yang terdapat
pada yaitu ACS dan ASP.

A. Uji kesesuaian Sistem

Uji kesesuaian sistem merupakan bagian integral dari kromatografi cair(22).
Uji kesesuaian sistem lebih sering diterapkan pada instrumen analisis. Uji
tersebut dirancang untuk mengevaluasi komponen-komponen sistem analisis
secara periodik untuk menunjukkan bahwa kinerja sistem memenuhi standar yang
dipersyaratkan meetode tersebut. Uji kesesuaian sistem yang dilakukan
diantaranya dengan menghitung faktor kapasitas, resolusi, faktor tailing, dan
jumlah plat teoritis (N).

4A. Kromatogram standar ACS dan ASP.

26
 27

4B. Kromatogram sampel (minuman serbuk instan yang mengandung

ACS dan ASP).

Gambar 4. Kromatogram standar (ACS, ASP) dan sampel ( minuman serbuk instan yang
mengandung ACS dan ASP). Metode analisis menggunakan fase gerak bufer
fosfat : asetonitril (80:20), fase diam C18, laju alir 1 mL/menit dan detektor
UV pada panjang gelombang ACS 227 nm dan ASP 217 nm.

1. Faktor kapasitas (k’)

Faktor kapasitas adalah ukuran suatu puncak tertentu berhubungan

dengan void volume, yaitu elusi dari komponen unretained(23) . Nilai faktor
kapasitas menunjukkan indikasi waktu yang dibutuhkan masing-masing
komponen tertahan pada kolom. Faktor kapasitas lebih sering digunakan
sebagai parameter kesesuaian sistem dibandingkan waktu retensi, karena
waktu retensi tidak terlalu sensitif terhadap fluktuasi kondisi kromatografi
seperti laju aliran(24). Nilai k yang dapat diterima antara 0,5-20. Puncak
dengan nilai k = 0 menunjukan bahwa analit tidak tertahan oleh fase diam
dan apabila nilai k > 20 menunjukkan komponen terlalu tertahan oleh fase
diam(14). Hasil perhitungan faktor kapasitas untuk ACS sebesar 0,635
sedangkan ASP sebesar 1,796. Nilai faktor kapasitas yang diperoleh ini
dapat diterima karena masuk range 0,5 – 20. Perhitungan untuk faktor
kapasitas dapat dilihat pada lampiran 1.
 28

2. Resolusi
Resolusi adalah ukuran untuk menentukan seberapa baik pemisahan
dua puncak yang saling berdekatan. Tujuan dari penentuan resolusi ini adalah
agar nilai kuantitasi yang dihasilkan dapat dipercaya. Resolusi setidaknya
dipengaruhi oleh perbandingan antara dua puncak yang terukur(23) . ACS
muncul pada menit ke 3,727 sedangkan ASP muncul pada menit ke 6,65.
Hasil hitungan resolusi dapat dilihat pada lampiran 2.

Nilai resolusi rata-rata puncak ACS adalah 3,175, sedangkan

resolusi rata-rata ASP adalah sebesar 7,606. Menurut FDA, untuk uji
kesesuaian sistem nilai resolusi yang harus dicapai adalah > 2, sedangkan
menurut ICH resolusi yang harus dicapai adalah > 1,5. Berdasarkan data yang
diperoleh, resolusi dari ACS dan ASP sudah termasuk baik.

3. Faktor tailing
Faktor tailing adalah pengukuran keasemetrian puncak. Semakin
tinggi faktor tailing, semakin menurun keakuratan pengukuran. Tailing
terjadi dikarenakan kesulitan yang dialami integrator untuk menetukan kapan
atau di mana puncak tersebut berakhir. Pengaruh dari faktor tailing terhadap
keakuratan pengukuran dikarenakan pengukuran didasarkan pada perhitungan
luas area di bawah puncak(23).

Berdasarkan hasil perhitungan pada lampiran 3, rata-rata faktor tailing

pada senyawa ACS lebih kecil dibandingkan ASP. Faktor tailing pada ACS
dan ASP adalah 0,82 Nilai faktor tailing < 1 menunjukkan bahwa
kromatogram tidak mengalami pengekoran (tailing). Hasil perhitungan dapat
dilihat pada lampiran 3.

4. Jumlah plat teoritis

Jumlah plat teoritis (N) adalah ukuran efesiensi kolom, yaitu
banyaknya puncak yang dapat ditemukan dalam tiap unit run-time dari
kromatogram. Parameter yang dapat mempengaruhi N meliputi posisi
puncak, ukuran partikeldalam kolom, tingkat aliran fase gerak, suhu kolom,
viskositas fase gerak dan berat analit molekuler.
 29

Tabel III. Data jumlah plat teoritis sampel

Jumlah plat teoritis

No. ACS ASP
1. 2065 2939
2. 2371 2819
3. 2345 2644
2260 2801

Berdasarkan hasil perhitungan, rata-rata jumlah plat teoritis untuk

ASP adalah 2801 dan ACS sebesar 12260. Menurut FDA, efsiensi kolom
dikatakan baik apabila nilai N > 2000. Hasil perhitungan ACS dan ASP sudah
baik karena nilai N > 2000 sehingga menunjukkan efisiensi kolom yang
digunakan untuk analisis baik. Hasil perhitungan dapat dilihat pada lampiran
4.

Tabel IV. Parameter uji kesesuaian sistem metode KCKT yang digunakan pada
analisis ACS dan ASP dalam sampel.
No. Variabel Hasil
1. Fase gerak Buffer phosphat: acetonitril (80:20)
2. Fase diam C-18 (300x3,9 mm) 10µm
3. Kecepatan alir 1ml/menit
4. Panjang gelombang 227 nm (ACS); 217 nm ( ASP)
5. Faktor kapasitas 0,63 (ACS) ; 1,79 (ASP)
6. Resolusi 3,17 (ACS) ; 7,60 (ASP)
7. Faktor tailing 0,82 (ACS) ; 0,82 (ASP)
8. Efisiensi kolom 2260 (ACS) ; 2801(ASP)

B. Validasi Metode
Validasi metode analisis merupakan suatu tindakan penilaian terhadap
parameter tertentu. Berdasarkan percobaan pada laboratorium untuk membuktikan
bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya. Validasi
metode menurut United Stated Pharmacopeia (USP) untuk menjamin bahwa
metode analisis yang digunakan akurat, spesifik, reprodusibel, dan tahan tahan
pada kisaran analit yang akan dianalisis(18). Metode KCKT ini perlu divalidasi
karena metode ini digunakan pada di laboratorium yang berbeda, dikerjakan oleh
 30

analis yang berbeda, dan dikerjakan dengan alat yang berbeda. Untuk
membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan dalam
penggunaannya. Parameter-parameter yang perlu diuji antara lain: linieritas, LOD,
LOQ, presisi, dan akurasi.

1. Kurva Baku dan Linieritas

Kurva baku merupakan suatu kurva yang dibuat dengan
membandingkan antar konsentrasi seri kadar dengan luas areanya. Melalui
kurva baku, dapat diketahui linieritas dari metode yang digunakan. Linieritas
merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil-hasil uji yang
secara langsung proposional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang
diberikan. Koefisien relasi (r) yang direkomendasikan oleh AOAC adalah >
0,99(23). Apabila nilai r-nya kurang dari 0,999 masih bisa dikatakan baik
apabila nilai Vx0-nya kurang 5%(18). Vx0 merupakan suatu parameter lain
untuk mengetahui linieritas suatu metode, dengan mengukur kedekatan nilai
luas area yang terukur oleh detektor dengan luas area yang didapat dari
perhitungan persamaan kurva baku. Pada proses pembuatan kurva baku,
dibuat seri kadar campuran dengan konsentrasi ACS dan ASP masing-masing
20, 40, 80, 100, dan 200 ppm. Dapat dilihat pada tabel V.

Tabel V. Luas area kurva baku ACS

No. Kadar Luas area
(ppm) (menit AU)
1.
20 664119
2.
40 1256833
3.
80 2501519
4.
100 2995238
5.
200 6034995
 31

7000000
y = 29794,82053x + 68596,59350
6000000
r = 0,99970
5000000
4000000

Luas Area
3000000
2000000
1000000
0
0 50 100 150 200 250
Kadar (ppm)

Gambar 6. Kurva baku ACS.

Linieritas pada kurva baku dihitung dengan membandingkan antara

konsentrasi senyawa dengan nilai AUC. Untuk mendapatkan nilai linieritas
nilai AUC dan kadar dimasukkan ke dalam persamaan regresi linier.
Perhitungan secara regresi terhadap data tersebut adalah persamaan garis y =
bx + a, y = 29794,82053x + 68596,59350, dengan nilai korelasi 0,99970
dengan y adalah luas area, x adalah konsentrasi, b adalah slope, dan a adalah
intersep.

Tabel VI. Luas area kurva baku ASP

No. Kadar Luas area
(ppm) (menit AU)
1.
20 175170
2.
40 333399
3.
80 664865
4.
100 812226
5.
200 1618792
 32

1800000
y = 8.019,19634x + 15.201,12195
1600000 r = 0,99992
1400000
1200000
luas area 1000000
800000
600000
400000
200000
0
0 50 100 150 200 250
kadar (ppm)

Gambar 7. Grafik kurva baku ASP

Tabel VII. Nilai linieritas asesulfam-K dan aspartam berdasarkan nilai r dan Vxo
No Nama senyawa Persamaan kurva regresi Nilai r Nilai Keterangan
. obat linier Vx0
1. ACS Y = 29794 x + 68596,59 0,9997 0,01648 Memenuhi
syarat
2. ASP Y = 8019,19x+15201,12 0,9999 0,00254 Memenuhi
syarat

Berdasarkan hasil yang tertera di tabel VII menunjukkan bahwa ACS

dan ASP dengan rentang kurva baku 20 sampai 200 ppm dijamin linieritasnya
dengan nilai korelasi (r) 0,9997 untuk ACS dan 0,9999 untuk ASP. Dengan
demikian apabila digunakan untuk menghitung kadar sampel dengan kandungan
ACS dan ASP yang masuk range tersebut dapat dijamin validitasnya.

2. Presisi (keseksamaan)
Presisi merupakan ukuran keterulangan metode analisis dan biasanya
diekspresikan sebagai simpangan baku relatif dari sejumlah sampel yang berbeda
signifikan secara statistik(10). Presisi injeksi dinyatakan sebagai RSD (standar
deviasi relatif) menunjukkan kinerja dari KCKT, termasuk pipa kolom dan
kondisi lingkungan, pada saat sampel dianalisis. Perlu diketahui, persiapan dan
pembuatan sampel dalam hal ini tidak dipertimbangkan(24).
 33

Presisi yang dilakukan yaitu presisi dalam satu hari (repeatibility atau
intraday precision). Kadar yang dipilih adalah masing-masing 40 ppm untuk ACS
dan ASP. Konsentrasi tersebut diinjek sebanyak enam kali. Kadar ini dipilih
karena untuk mewakili kadar terkecil dan terbesar pada seri kadar ACS dan ASP .
Menurut Association of official analytical chemist (AOAC) pada kadar 20-200
ppm, presisi dianggap memenuhi persyaratan apabila RSD > dan RSD AUC-nya
< 6%(25) .
Berikut tabel horwitz dan hasil nilai presisi dariACS dan ASP yang disajikan pada
tabel VII dan IX

Tabel VIII. Persyaratan RSD pada konsentrasi tertentu(25)

Konsentrasi RSD
100 % 1%
10 % 1.5%
1% 2%
0,1% 3%
0,01 % 4%
10 ug/g (ppm) 6%
1 ug/g 8%
10 ug/kg (ppb) 15 %

Tabel IX. Nilai presisi (intraday) luas area ACS dan ASP
No. ACS ASP
1. 1242431 319528
2. 1248186 325677
3. 1250918 328168
4. 1256833 333399
5. 1249232 324272
6. 1249501 323436
1249516,83 325748,33
SD 4637,91 4704,46
RSD 0,371% 0,0144%

Keterangan: contoh perhitungan presisi luas area ACS dan ASP dapat dilihat pada
lampiran 9
 34

3. Akurasi (perolehan kembali)

Akurasi merupakan ketelitian metode analisis atau kedekatan antara nilai
terukur dengan nilai yang diterima baik nilai konversi, nilai sebenarnya, atau nilai
rujukan(10). Metode adisi dapat dilakukan dengan menambahkan sejumlah analit
dengan konsentrasi tertentu pada sampel yang diperiksa, lalu dianalisis dengan
metode tersebut. Persen akurasi ditentukan dengan menentukan berapa persen
analit yang ditambahkan dapat ditemukan(18).
Pada proses akurasi peneliti menggunakan tiga macam konsentrasi standar
ACS dan ASP yang akan ditambahkan kedalam sampel yaitu pada konsentrasi
80%, 100%, dan 120%. Digunakan tiga seri kadar yang berbeda untuk mengetahui
nilai akurasi yang didapat apabila konsentrasi standar yang ditambahkan berbeda-
beda. Menuruat AOAC nilai akurasi yang baik untuk kadar 10-100 ppm adalah
80 – 115%(25) . Penelitian yang dilakukan menghasilkan nilai akurasi ACS dan
ASP seperti pada tabel X dan XI.

Tabel X. Nilai akurasi senyawa ACS pada tiga seri kadar yang berbeda
No. Kadar Kadar Akurasi Rata-rata
Sebenarnya terukur (%) (%)
(ppm) (mg)
1.
67,05 101,29
2. 65,70 101,34
67,06 101,33
3.
67,07 101,38
4.
74,11 99,63
5. 73,00 99,72
74,12 99,64
6.
74,21 99,88
7.
82,23 102,12
8. 80,3 102,12
82,10 101,82
9.
82,37 102,43
101,06
 35

Tabel XI. Nilai akurasi senyawa ASP pada tiga seri kadar yang berbeda
No. Kadar yang Kadar Akurasi Rata-rata
Sebenarnya terukur (%) (%)
(ppm) (mg)*
1.
164,50 102,88
2. 164,52 102,25
163,93 102,06
3.
163,75 101,81
4.
182,77 99,10
5. 182,80 99,24
182,83 99,17
6.
183,10 99,46
7.
202,88 101,56
8. 201,08 101,84
203,42 102,05
9.
203,26 101,90
101,11

*hasil repitasi 3 kali

4. Batas deteksi (limit of detection, LOD) dan batas kuantitasi (limit of

quantitation, LOQ)
LOD didefinisikan sebagai konsentrasi analit terndah dalam sampel yang
masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu dapat dikuantitasi. LOQ
didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat
ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi
operasional metode yang digunakan(10) . LOD dan LOQ menunjukkan kesensitifan
dari suatu metode, semakin kecil nilai LOD dan LOQ maka semakin sensitif pula
metode tersebut begitu pula sebaliknya.
Pada penelitian ini perhitungan nilai LOD dan LOQ dihitung secara
matematik melalui garis regresi linier dari kurva baku. Nilai pengukurannya akan
sama dengan nilai b pada persamaan garis linier y = bx + a, sedangkan simpangan
baku blanko sama dengan simpangan baku residual (sy/x)(10). Setelah dilakukan
penelitian, didapatkan nilai LOD dan LOQ seperti yang tertera pada tabel XII
 36

Tabel XII. Nilai LOD- LOQ senyawa ACS dan ASP

No. Nama senyawa Nilai LOD (ppm) Nilai LOQ (ppm)

1. ACS 4,7870 14,5062
2. ASP 0,7393 2,2405

Berdasarkan tabel di atas dapat diketahui bahwa metode KCKT dapat

mendeteksi keberadaan ACS dalam sampel apabila kadar yang terkandung lebih
dari sama dengan 4,7870 ppm. Untuk kadar ACS terendah dalam sampel yang
dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi
operasional metode ini adalah 14,5062 ppm. Metode KCKT dapat mendeteksi
keberadaan ASP dalam sampel apa bila kadar yang terkandung dilebih dari sama
dengan 0,7393 ppm. Untuk kadar ASP terendah dalam sampel yang dapat
ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi
operasional metode ini adalah 2,2405 ppm.
Nilai LOD dan LOQ yang disebutkan diatas menunjukkan bahwa ASP
memiliki nilai LOD dan LOQ lebih kecil dibandingkan dengan ACS. Ini dapat
diartikan metode KCKT yang dikembangkan lebih sensitif terhadap ASP.

5. Preparasi Sampel
Preparasi sampel dilakukan dengan mengacu pada British Standard versi
EN 12856 tahun 1999. Ditimbang satu bungkus sampel kemudian dimasukkan
ke dalam labu ukur 50 ml dilarutkan dengan aquabidest sampai tanda batas.
Kemudian diambil 4,5 ml sampel setara dengan 1 gram serbuk sampel masukkan
ke dalam labu ukur 50 ml tambahkan aquabidest kemudian tambahkan larutan
carrez I dan carrez II sebagai pembersih larutan untuk mengendapkan lemak.
Sehingga dapat terbentuk endapan. Lalu tambahkan aquabidest sampai tanda batas
lalu di vortex agar homogen setelah itu disentrifuse untuk memisahkan cairan
dengan endapan. Sebelum diinjeksikan kedalam kolom KCKT larutan tersebut
disaring terlebih dahulu dengan microfilter dengan ukuran pori 0,45µ. Volume
sampel yang diinjeksikan sebanyak 10µl.
 37

6. Penetapan kadar sampel minuman serbuk

Pengukuran kadar merupakan tahap akhir yang dilakukan dalam
penelitian, setelah hasil penelitian menunjukkan bahwa metode yang akan
digunakan valid. Metode yang valid akan menghasilkan pengukuran yang sesuai
dengan kadar yang sebenarnya. Hal ini akan menguatkan pada saat menyimpulkan
hasil penelitian. Pengukuran kadar sampel dilakukan dengan memasukkan AUC
sampel, ke dalam persamaan kurva baku. Pengukuran kadar yang dilakukan,
menghasilkan data seperti tertera pada tabel XIII dan XIV.

Tabel XIII. Hasil perhitungan kadar ACS dalam sampel minuman serbuk rasa
jeruk dan jambu.
Kadar ACS Rata-rata / Kadar Rata-rata /
ACS (mg) sachet ACS (mg) sachet
Jeruk (mg) ± SD jambu (mg) ± SD
1. 1,87 1,85
Repitasi 1 2. 1,87 27,33±0,00 1,85 20,28± 0,00
3. 1,86 1,85
1. 1,86 1,77
Repitasi 2 2. 1,86 27,17±0,00 1,78 19,39± 0,01
3. 1,85 1,76
1. 1,85 1,87
Repitasi 3 2. 1,85 27,09±0,00 1,87 20,49± 0,01
3. 1,85 1,87

Tabel XIV. Hasil perhitungan kadar ASP dalam minuman serbuk rasa jeruk
dan jambu.
Kadar ASP Rata-rata/ Kadar Rata-rata/
ASP (mg)/ 1g sachet ASP (mg) sachet
(jeruk) (mg) ± SD jambu (mg) ± SD
1. 5,21 4,73
Repitasi 1 2. 5,12 75,70± 0,05 4,67 51,40± 0,01
3. 5,20 4,73
1. 5,20 4,58
Repitasi 2 2. 5,25 76,41± 0,02 4,58 50,19 ± 0,00
3. 5,22 4,58
1. 5,18 4,69
Repitasi 3 2. 5,18 75,73± 0,01 4,64 51,10± 0,02
3. 5,17 4,65
 38

Berdasarkan hasil yang diperoleh pada penelitian ini kandungan ACS yang
terdapat pada sampel minuman serbuk rasa jeruk sebesar 27,20 mg / 14,62 g dan
ASP sebesar 75,95 mg / 14,62 g kadar ACS dan ASP yang tertera pada bungkus
sampel adalah 32 mg / 14g ACS dan 93 mg / 14g ASP, hal ini menunjukkan kadar
ACS dan ASP yang ada pada sampel lebih kecil dari kadar yang tertera pada
bungkus minuman serbuk tersebut. Sedangkan sampel rasa jambu mengandung
ACS sebesar 20,05 mg /10,96 g, ASP 50,89 mg / 10,96 g. Kadar ACS dan ASP
yang ditambahkan masih dibawah ambang batas maksimal yang diperbolehkan
Menurut Joint Expert Comitte on Food Additive ( JECFA) menyatakan ACS
aman untuk dikonsumsi manusia sebagai pemanis buatan dengan ADI (accept
daily intake) sebanyak 15 mg/kg berat badan. Sedangkan batas aman ASP untuk
dikonsumsi adalah sebanyak 50 mg/kg BB. Jika ACS digunakan melebihi batas
yang diijinkan maka dapat berakibat bahaya ACS tidak dapat dicerna, bersifat non
glikemik dan non karsinogenik, percobaan pada tikus dengan menggunakan ACS
dosis tinggi dapat menyebakan kerusakan genetik pada tikus. Sedangkan ASP
berbahaya bagi penderita penyakit fenilketonurik, karena penderita penyakit ini
tidak dapat memetabolisme fenil alanin. Fenil alanin merupakan hasil metabolit
dari ASP. Penimbunan fenil piruvat yang terbentuk dari fenil alanin dalam otak
yang akhirnya dapat menyebabkan kerusakan otak dan kecatatan mental. Pada
penelitian ini menunjukkan bahwa kadar ASP dan ACS tergolong aman karena
tidak melebihi batas. Jika sampel dikonsumsi dalam sehari dengan berat badan 50
kg maka batas maksimalnya adalah 750 mg perhari sedangkan untuk ASP yaitu
2500 mg perhari. Maka minuman sampel masih aman jika dikonsumsi sekitar tiga
kali sehari atau lebih karena kadar pemanis yang digunakan masih diperbolehkan.
 BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. KESIMPULAN

1. Parameter validasi metode analisis yang digunakan (presisi, akurasi,

linieritas, limit deteksi dan limit kuantitasi) memenuhi parameter
AOAC.

2. Kadar pemanis buatan yang diperoleh dalam minuman serbuk rasa

jambu adalah 20,05 mg ± 0,00 (ACS) dan 57,89 mg ± 0,01 (ASP),
sedangkan untuk rasa jeruk sebesar 27,20 mg ± 0,00 (ACS) dan 75,95
mg ± 0,02 (ASP).

3. Kadar ACS dan ASP yang terkandung dalam minuman serbuk instan
masih memenuhi persyaratan accept daily intake (ADI) oleh WHO.

B. SARAN

1. Perlu dilakukan penelitian dengan jumlah sampel yang representatif dari

produk-produk minuman yang beredar dipasaran.

2. Perlu dilakukan penelitian dengan menggunakan sampel-sampel yang

penggunaan pemanis buatannya dicurigai melebihi syarat yang
ditetapkan oleh ADI.

39
 40

DAFTAR PUSTAKA

(1) BPOM, 2004, Persyaratan Penggunaan Bahan Tambahan Pangan

Pemanis Buatan Dalam Produk Pangan, Kepala Badan Pengawasan
Obat Dan Makanan Republik Indonesia Nomor : HK.00.05.5.1.4547,
Jakarta.

(2) Cahyadi, W, 2008, Analisis dan Aspek Kesehatan Bahan Tambang

Pangan, Bumi aksara, Jakarta 2, 3.

(3) Anonim , 2004, Keamanan Mutu dan Gizi Pangan, Peraturan

Pemerintah Republik Indonesia No 28 Http :// www.pom.go.id,
(diakses 29 Desember 2011).

(4) Christina R. Whitehouse, R., C., Boullata J., ,and Linda A.

McCauley, A., L., 2008, The Potential Toxicity of Artificial
Sweeteners, AAOHN Journal, vol. 56, no. 6, 255.

(5) Butchko, H.H., Stargel, W.W., comer, Phil., 2002, aspartame:

Review of safety, Regulatory Toxicology and Pharmacology 35,
Elsevier Science, USA 13, 14.

(6) Herzog, G., Kam, V., Berduque, A., and Arrigan, D., 2008,
Detection of Food Additives by Voltammetry at The Liquid-Liquid
Interface, J. Agric. Food Chem., 56 (12): 4304-4310.

(7) Frazier, R.A., Inns, E.L., Dossi, N., Ames, J.M., and Nursten, H.E.,
2000, Development of a capillary electrophoresis method for the
simultaneous analysis of artificial sweeteners, preservatives and
colours in soft drinks. J. Chromatogr. A, 876, 213-20.

(8) Armenta, S., Garrigues S., 2004, FTIR Determination of Aspartame

and Acesulfame-K in tabletop sweeteners, , J. Agric. Food Chem.,
52 (26): 798-803.

(9) Anonim, 1999 ,Foodstuffs – Determination of acesulfame-K,

aspartame and saccharin – High performance liquid
chromatographic method, BSI.

(10) Gandjar, Ibnu Gholib., Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis,
pustaka pelajar, Yogyakarta, 335-342,378-379.

(11) Anonim, 2009, Artificial Sweeteners and Cancer, National Cancer

Institute, USA, available at http://www.cancer.gov, (Diakses tanggal
19 oktober 2011).
 41

(12) Rowe, R., Sheskey,P.J., quinn M.E., 2009, Handbook of

Pharmaceutical Excipients 6th edition, Pharmaceutical Press and
American Pharmacists Association, USA. 3, 4, 48, 49.

(13) BPOM, 2000, Kajian Keamanan Bahan Tambahan Pangan Pemanis

Buatan, available at http://www.pom.go.id , (diakses 2 november
2011)

(14) Dong, michael.W., 2006, Modern HPLC For Practicing Scientists,

john wiley &sons , inc,canada ,13

(15) Sample, R. H. B., Melvin, R. G.,Martin, B. K., James W. S., 1978,

high presure liquid Chromatographic assay of chloramphenikol in
biological fluid, Departement of clinical of pathology and pediatrics
University school of Medicines Indianapolis, Indiana, available at
http:// www.aac.asm.org (Diakses pada 3 November 2011 ).

(16) Hendayana, S., 2006, Kimia Pemisahan Metode Kromatografi Dan

Elektroforesis Modern, PT Remaja Rosdakarya, Bandung, 69-94.

(17) Harvey,D., 2000, Modern Analytical Chemistry, McGraw-Hill,

America, 579.

(18) Harmita, 2004, Pentujuk Pelaksanakan Validasi Metode Dan Cara

Perhitungan, Indonesian J. Pharm., Vol. I, No.3, 117-121

(19) Alghamdi, A,. Alghamdi,F, Ali,. and Alwarthan, Abdulrahman A,

2005, Determination of Content Levels of Some Food Additives in
Beverages Consumed in Riyadh City, J King Saud univ, vol 18,
100,101.

(20) Anonim, 2009, British Pharmacopoeia, MNRH, London, 93, 438.

(21) Rohman, A, 2009, Kromatografi Untuk Analisis Obat, Graha Ilmu,

Yogyakarta,217-222.

(22) Anonim, 2005, Validation of Analytical procedures:

Methodology,adopted in 1996, International Conference of
Harmonization Q2(R1), Genava.

(23) Anonim, 1994, Reviewer Guidance : validation of chromatographic

Methods, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), 22

(24) Hearn, G. M., 7.1992, A Guide to Validation in HPLC, Perkin-

Elmer Corp. :Norwalk, USA.
 42

(25) Anonim, 2002, AOAC Guidelines for Single Laboratory Validation

of Chemical Methods for Dietary Supplements and Botanicals,
available at http://www.AOAC.org, 25 (diakses pada 5 Maret 2012).
 43

Lampiran 1: perhitungan faktor kapasitas

Faktor kapasitas

Vm = 0,5 x L x dc2

Vm = void volum
L = panjang kolom (cm)
Dc2 = diameter internal kolom (cm)
Vm = 0,5 x (0,30 cm) x (0,39)2
= 2,28 ml

= 2,28 menit

1. ACS

Repitasi 1

= 0,635

Repitasi 2

= 0,635
 44

Lampiran 1 : lanjutan

Repitasi 3

= 0,634

2. ASP

Repitasi 1

= 1,796

Repitasi 2

= 1,796

Repitasi 3

= 1,796
 45

Lampiran 2: perhitungan Resolusi

Perhitungan resolusi

Rs = resolusi

TR1 = waktu retensi puncak 1 (menit)

TR2 = waktu retensi puncak 2 (menit)

Tw1 = lebar puncak 1 (menit)

Tw2 = lebar puncak 2 (menit)

1. ACS

Replikasi 1

= 3,28

Repitasi 2

= 3,167

Repitasi 3

= 3,078
 46

Lampiran 2: lanjutan

2. ASP

Repitasi 1

= 7,795

Repitasi 2

= 7,666

Repitasi 3

= 7,358
 47

Lampiran 3: perhitungan faktor tailing

Faktor tailing (T)

T= faktor tailing

W5% = lebar puncak yang terukur 5% dari tinggi puncak

f = jarak antara titik awal puncak dan titik maksimum puncak

1. ACS
Repitasi 1

= 0,86

Repitasi 2

= 0,76

Repitasi 3

= 0,83
 48

Lampiran 3: lanjutan

2. ASP

Repitasi 1

= 0,78

Repitasi 2

=0,828

Repitasi 3

= 0,84
 49

Lampiran 4: perhitungan jumlah plat ( N)

Jumlah plat (N)

N = jumlah plat teoritis

TR = waktu retensi puncak

Tw = lebar puncak

1. ACS

Repitasi 1

N = 2345,25

Repitasi 2

N = 2371,94

Repitasi 3

N = 2065,44
 50

Lampiran 4: lanjutan

2. ASP

Repitasi 1

N = 2939,00

Repitasi 2

N = 2819,23

Repitasi 3

N = 2644,84
 51

Lampiran 5: perhitungan pengenceran seri kadar kurva baku campuran ACS dan
ASP

Perhitungan pengenceran seri kadar kurva baku campuran ACS dan ASP.

M1 x V1 = M2 x V2

Keterangan : M1 : konsentrasi Stok ACS/ASP (500/500ppm)

V1 : Volume yang dicari

M2 : konsentrasi seri kadar yang diinginkan

V2 : volume seri kadar yang ingin dibuat (10ml)

Kadar 20/20 ppm: M1 X V1 = M2 X V2

500/500 ppm x V1 = 20/20 ppm x 10 ml

V1= 0,4 ml --- ad aquabides 10 ml

Kadar 40/40 ppm: M1 X V1 = M2 X V2

500/500 ppm x V1 = 40/40 ppm x 10 ml

V1= 0,8 ml --- ad aquabides 10 ml

Kadar 80/80 ppm: M1 X V1 = M2 X V2

500/500 ppm x V1 = 80/80 ppm x 10 ml

V1= 1,6 ml --- ad aquabides 10 ml

Kadar 100/100 ppm: M1 X V1 = M2 X V2

500/500 ppm x V1 = 100/100 ppm x 10 ml

V1= 2 ml --- ad aquabides 10 ml

 52

Lampiran 5: lanjutan

Kadar 200/200 ppm: M1 X V1 = M2 X V2

500/500 ppm x V1 = 200/200 ppm x 10 ml

V1= 4 ml --- ad aquabides 10 ml

Kadar 500/500ppm : ditimbang masing-masing 25 mg ACS dan ASP, dimasukkan

ke dalam labu ukur 50 ml. Kemudian dilarutkan dengan aquabides hingga tanda
batas.
 53

Lampiran 6: Perhitungan stok pembuatan sampel

Sampel minuman serbuk rasa jambu

Berat penimbangan = 10,9450 g

Kemudian dicairkan dalam 50ml aquabides agar homogen sehingga memudahkan

proses penyamplingan.

Volume yang dibutuhkan setara dengan 1 g serbuk (Nutri Sari)

= 50ml/10,9450 = 4,57 ml

Kadar aspartam yang tertera pada satu bungkus nutrisari adalah 50mg

= 50mg/10,9450= 4,57mg/1g --- 4,57/50ml = 91,4 ppm

Kadar asesulfam yang tertera pada satu bungkus nutrisari adalah 20mg

=20mg/10,950= 1,827mg/1g---- 1,827/50ml = 36,54 ppm

 54

Lampiran 7: perhitungan nilai Vxo ACS dan ASP

1. ACS

No. X Yr y1 (yr-y1) (yr-y1)2 ∑(yr-y1)2 ∑(yr- sy/x Vxo

y1)2/ (%)

(n-2)

1. 20 6641 6644 -374,004 139878, 5604157 1868052 43220, 0,016

19 93 99 2 736 579 97 48

2. 40 12568 12603 -3556,415 322504130,

33 89 6

3. 80 25015 24521 49336,764 2434115887

19 82

4. 100 29952 30480 - 2792129008

52840,646
38 79

5. 200 60349 60275 7434,301 55268831,36

95 61

88

b 29794,

821

n-2 3
 55

Lampiran 7: lanjutan

2. ASP

No. ∑(y-y1)2/

(n-2)
x Y y1 (y-y1) (y-y1)2 ∑(y-y1)2 sy/x Vxo

1. 20 1751 1755 415,048 1722 96864 322881 1796,7 0,002

70 85 64,8 534 78,02 13 546

2. 40 3333 3359 - 66047

2569,975
99 69 72

3. 80 6648 65673 8128,171 66067

65 6,8 164

4. 100 8122 81712 - 23958

4894,756
26 0,8 636

5. 200 16187 16190 -248,39 6169

92 40 7,59

88

b 8019,1

96

n-2 3

Keterangan:

= rata-rata

b = slope

n = jumlah seri kadar

 56

lampiran 8: perhitungan LOD dan LOQ ACS dan ASP

LOD = 3,3 x LOQ = 10 x

1. ACS

2. ASP
 57

Lampiran 9 : Perhitungan presisi ACS dan ASP

SD =

1. ACS 40 ppm:
Contoh perhitungan presisi AUC 40 ppm

= 4637,910

2. ACS 40 ppm

Contoh perhitungan presisi AUC 40 ppm

 58

Lampiran 10: perhitungan akurasi ACS dan ASP

AUC sampel + standar

No akurasi (adisi) AUC standar
ACS ASP ACS ACS

1. 2066262 1334401 885294 565220

2. 80% 2066633 1329782 888931 565566

3. 2067134 1328317 898490 568141

2066676,3 1330833 890905 566309

1. 2276819 1480850 1113142 739350

2. 100% 2276941 1481349 1113432 737382

3. 2279724 1483465 1124824 730280

2277828 1481888 1117132,6 735670,7

1. 2518725 1642193 1324907 872513

2. 120% 2514653 1646512 1330573 880248

3. 2522770 1645168 1324550 877426

2066262 1644624 1326676,67 876729

Contoh perhitungan asesulfam akurasi 80 ppm :

Rata-rata AUC (sampel + standar ) = 2066676,33
Rata-rata AUC sampel = 1163863
Rata-rata AUC standar = 890905
 59

Lampiran 10 (lanjutan)

Contoh perhitungan ASP akurasi 80 ppm :

Rata-rata AUC (sampel + standar ) = 1330833
Rata-rata AUC sampel = 751769
Rata-rata AUC standar = 566309
 60

Lampiran 11 : penetapan kadar ACS dan ASP

Contoh perhitungan penetapan kadar ACS

Persamaan kurva baku : y = 29794,82053x + 68596,59350
Keterangan Y: rata-rata AUC sampel
X: kadar sampel (ppm)
y = 29794,82053x + 68596,59350
1182616 = 29794,82053x + 68596,59350

X = 37,38969 ppm

37,3869 mg/1000ml

Dilarutkan pada labu ukur 50ml

x = 1,869 mg/ 50ml

dalam 50 ml terdapat 1 g serbuk sampel sehingga dalam 1 gram

mengandung 1,869 mg ACS sedangkan dalam 1 bungkus (14,624g )
mengandung ACS sebanyak 27,20 mg

Contoh perhitungan penetapan kadar ASP

Persamaan kurva baku : y = 8019,196x + 15201,122
y = 8019,196x + 15201,122

858042,679 = 8019,196x + 15201,122

x = 105,103 ppm

105,103 mg/ 1000ml

Dilarutkan pada labu 50 ml

x = 5,255 mg/50ml
 61

lampiran 11 : lanjutan

dalam 50 ml terdapat 1 g serbuk sampel sehingga dalam 1 gram mengandung

5,255 mg ACS sedangkan dalam 1 bungkus (14,624 g ) mengandung ACS
sebanyak 75,95 mg/bungkus
 62

Lampiran 12

1. Standar ACS dan ASP konsentrasi 20 ppm

2. Standar ACS dan ASP 40 ppm

3. Standar ACS dan ASP 80 ppm

 63

Lampiran 12 : lanjutan

4. Standar ACS dan ASP 100 ppm

5. Standar ACS dan ASP 200 ppm

 64

Lampiran 13

Presisi
 65

Lampiran 14
Sampel 1

1. Replikasi 2

2. Replikasi 3
 66

Lampiran 15

1. Akurasi 80% ACS dan ASP

2. Akurasi 100% ACS dan ASP

3. Akurasi 120% ACS dan ASP