SKRIPSI

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA STEROID DARI EKSTRAK

METANOL SPONS Clathria sp. SERTA UJI AKTIVITASNYA TERHADAP
JAMUR Candida albicans.

Untuk memenuhi sebagai persyaratan

Mencapai derajat sarjana (S-1)

OLEH:

Wisdayanti Nur Fatma Imran

F1F1 12 132

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HALU OLEO
KENDARI
2017
ii
 PERNYATAAN

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi ini tidak terdapat karya yang

pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu Perguruan Tinggi,

dan sepanjang pengetahuan saya juga tidak terdapat karya atau pendapat yang

pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis diacu

dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka.

Kendari, Maret 2017

Wisdayanti Nur Fatma Imran

iii
 KATA PENGANTAR

Segala puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT Yang Maha

Pengasih dan Penyayang, atas Karunia, Rahmat dan Kuasa-Nya sehingga penulis

masih diberi kesehatan dan kesempatan untuk dapat menyelesaikan skripsi yang

berjudul “Isolasi dan Identifikasi Senyawa Dari Ekstrak Metanol Spons

Clathria sp Serta Uji Aktivitasnya Terhadap Jamur Candida albicans”.

Terima kasih penulis haturkan kepada Bapak Prof. Dr. Sahidin, M.Si. selaku

pembimbing satu dan Bapak Muh. Hajrul Malaka, S.Si., M.Si. selaku

pembimbing dua yang telah meluangkan waktu, tenaga dan pikiran dalam

mengarahkan dan membimbing penulis dalam proses penyelesaian skripsi ini.

Melalui kesempatan ini secara khusus penulis menyampaikan terima

kasih yang tak terhingga kepada Ibunda tercinta Hj. Erni Husain, S.Pd., M.Si.

dan ayahanda H. Ali Imran, S.E atas segala doa, restu, semangat, bimbingan,

arahan dan nasehat, serta ketabahannya dalam membesarkan dan mendidik yang

tiada henti-hentinya bagi penulis. Semoga Allah SWT selalu melindungi dan

melimpahkan rahmat-Nya.

Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada:

1. Rektor Universitas Halu Oleo.

2. Dekan Fakultas Farmasi Universitas Halu Oleo.

3. Ketua Jurusan Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Halu Oleo.

iv
4. Sekretaris Jurusan Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Halu Oleo yang telah

memberikan banyak bantuan administratif.

5. Bapak Dr. Imran, S.Si., M.Si, Ibu Nur Illiyyin, S.Si., M.Si., Apt. dan Ibu Dian

Munasari Solo, S.Farm., M.Si., Apt. selaku dewan penguji yang telah banyak

memberikan bimbingan dan arahan kepada penulis.

6. Kepala Laboratorium Farmasi yang telah memberikan izin penelitian.

7. Bapak dan Ibu dosen Jurusan Farmasi, serta seluruh staf di lingkungan

Fakultas Farmasi UHO atas segala fasilitas dan pelayanan yang diberikan

selama penulis dalam menuntut ilmu serta Laboran Jurusan Farmasi yang

telah membantu memperlancar berlangsungnya penelitian ini.

8. Kepada Direktur Taman Wisata Pendidikan Laut Bintang Samudra yang telah

bekerjasama dalam jalannya penelitian. Semoga terus menjadi taman wisata

pendidikan laut yang bermanfaat bagi seluruh masyarakat Indonesia

khususnya Sulawesi Tenggara.

9. Buat Kakak yang baik hati Agung Wibawa Mahatva Yodha, S.Si, Wa Ode

Sitti Musnina, S.Si., M.Sc., Nina Elyana, S.Farm., Apt., Sarippudin, S.Si.,

Muh. Azhar S.Farm., Andi Iqmal Jaya Putra, S.Farm., La Ode Abdul Salim,

S.Farm. dan Adnan Aprilianto Soni, S.Farm. terima kasih untuk bantuan dan

arahannya selama ini. Semoga rahmat Allah SWT selalu menyertai kanda.

10. Kepada Kakak Kandungku Abriadi Eka Putra Imran, S.Sos., Jusmaruddin,

S.STPi dan Arsidayani Putri Imran S.Si serta keluarga besar penulis terima

kasih untuk segala kebersamaan hingga saat ini.

v
11. Kepada saudara Ahmad Muhajir, S.M. yang selalu memberikan motivasi,

dukungan, bantuan dan perhatiannya kepada penulis sejak masa perkuliahan

hingga saat ini.

12. Sahabat-sahabatku yang telah memberikan kebahagian, motivasi, energi serta

bantuan kepada penulis : Rizky Audina Syahrir, Iin Priska Budiman, Filda

Rustam dan Umi Widiyati Effendi S.Farm.

13. Rekan-rekan sepenelitian Dissa Aryasanindya, Rahmi Ardani, Nur Af’idah

Annas, Sri Reski Anita, Isra sullasmi, Venna sintari S.Farm, Fadhil

Muhammad, Muh. Ramadhan Salam, Sujana Ramadhan, Sumail Ishak, Nirma,

Iwan dan Muh. Julpan, terima kasih buat semangat dan kerja samanya.

14. Teman-teman Mahasiswa(i) Jurusan Farmasi angkatan 2012 yang tidak bisa

disebutkan satu persatu, yang merupakan teman seperjuangan penulis dalam

menuntut ilmu dan tumbuh menjadi dewasa bersama, semoga Allah SWT

memberikan dan memudahkan jalan bagi kita semua tanpa terkecuali.

Akhir kata, Penulis persembahkan skripsi ini kepada segenap pembaca.

Semoga Allah SWT memberi taufik kepada kita semua untuk mencintai ilmu

yang bermanfaat dan amalan yang shalih serta memberikan ridho balasan yang

sebaik-baiknya, Aammiinn

Kendari, Maret 2017

Penulis

vi
 DAFTAR ISI

HALAMAN PENGESAHAAN...................................................................................ii
PERNYATAAN...............................................................................................................iii
KATA PENGANTAR.....................................................................................................iv
DAFTAR ISI...................................................................................................................vii
DAFTAR TABEL.............................................................................................................x
DAFTAR GAMBAR.......................................................................................................xi
DAFTAR LAMPIRAN...................................................................................................xii
DAFTAR ARTI LAMBANG DAN SINGKATAN......................................................xiii
ABSTRAK......................................................................................................................xiv
ABSTRACT....................................................................................................................xv
BAB I................................................................................................................................1
PENDAHULUAN.............................................................................................................1
A. Latar Belakang....................................................................................................1
B. Rumusan Masalah...............................................................................................4
C. Tujuan Penelitian................................................................................................4
D. Manfaat Penelitian..............................................................................................5
BAB II...............................................................................................................................6
TINJAUAN PUSTAKA...................................................................................................6
A. Biota Laut Spons..................................................................................................6
1. Uraian umum spons Clathria sp......................................................................6
2. Biologi spons.....................................................................................................7
3. Ekologi Spons...................................................................................................8
B. Efek Farmakologi................................................................................................9
C. Metabolit Sekunder.............................................................................................9
D. Kandungan Kimia.............................................................................................10
E. Metode Analisis Senyawa Bahan Alam............................................................11
1. Metode Isolasi.................................................................................................11
2. Metode Identifikasi.........................................................................................15
F. Uji aktivitas Antijamur.....................................................................................18

vii
 1.Macam-macam Uji antijamur............................................................................18
2. Mikroba Uji........................................................................................................20
3. Antibiotik pembanding..................................................................................21
G. Kerangka konsep...............................................................................................22
BAB III...........................................................................................................................24
METODE PENELITIAN..............................................................................................24
A. Waktu, Tempat Penelitian................................................................................24
B. Jenis Penelitian..................................................................................................24
C. Bahan Penelitian................................................................................................24
D. Alat Penelitian....................................................................................................24
E. Variabel..............................................................................................................25
1. Variabel Bebas................................................................................................25
2. Variabel Terikat.............................................................................................25
F. Definisi Operasional..........................................................................................25
G. Prosedur Penelitian...........................................................................................26
1. Pengambilan Sampel......................................................................................27
2. Preparasi Sampel............................................................................................27
3. Ekstraksi.........................................................................................................28
4. Pemisahan dan Pemurnian............................................................................28
5. Identifikasi Kemurnian Isolat.......................................................................29
6. Uji Aktivitas Antijamur.................................................................................29
7. Pengolahan dan Analisis Data.......................................................................31
BAB IV............................................................................................................................33
HASIL DAN PEMBAHASAN......................................................................................33
A. Pemisahan dan Pemurnian...............................................................................33
B. Identifikasi Isolat...............................................................................................39
1. Analisis spektrum infra Red..........................................................................39
2. Spektrum NMR isolat....................................................................................40
C. Uji Aktivitas Antijamur....................................................................................45
BAB V.............................................................................................................................47
PENUTUP.......................................................................................................................47

viii
 A. KESIMPULAN..................................................................................................47
B. SARAN...............................................................................................................47
DAFTAR PUSTAKA.....................................................................................................48
LAMPIRAN...................................................................................................................53
Lampiran 1. Bagan Umum Penelitian..........................................................................53
Lampiran 2. Standar Mc. Farland................................................................................54
Lampiran 3. Bagan Alir Uji Aktivitas Antijamur.............................................................55
Lampiran 4. Perhitungan..............................................................................................58
Lampiran 5. Hasil Uji Antijamur Isolat.......................................................................61
Lampiran 6. Dokumentasi Penelitian...............................................................................62

ix
 DAFTAR TABEL

No Teks Halaman
1. Prerkiraan nilai pergeseran kimia1H-NMR (δH) 16
2. Prerkiraan nilai pergeseran kimia 13C-NMR (δc) 16
3. Jadwal kegiatan penelitian 31
4. Fraksi utama hasil pemisahan tahap awal 34
5. Hasil gabungan KR1-KR4 35
6. Perbandingan data 13C NMR dan 1H NMR senyawa isolat 43
dengan literatur
7. Diameter daerah hambat uji 46

x
 DAFTAR GAMBAR

No. Teks Halaman

1. spons clathria sp. 6
2. Kromatografi kolom vakum 13
3. Jamur Candida albicans 20
4. Kerangka Konsep 22
5. Bagan prosedur penelitian 25
6. Kromatogram pemisahan KKV 33
7. Kromatogram hasil pemisahan fraksi utama 34
8. Kromatogram hasil pemisahan F1 35
9. Kromatogram hasil gabungan KR F1 36
10. Hasil pemisahan dari F1123 36
11. Gabungan hasil KR F123 37
12. Hasil pemisahan Fraksi F1123 bagian 3,4 dan 5 38
13. Uji kemurnian isolat 38
14. Spektrum FTIR isolat 39
15. Spektrum 13C NMR 41
16. Spektrum 1H NMR 41
17. Hipotesis senyawa isolat 43
18. Pola HMBC senyawa isolat 44

xi
 DAFTAR LAMPIRAN

No. Teks Halaman

1. Bagan umum penelitian 54
2. Standar Mc. Farland 55
3. Bagan alir uji aktivitas antijamur 56
4. Perhitungan 59
5. Hasil uji antijamur isolat 64
6. Dokumentasi Penelitian 65

xii
 DAFTAR ARTI LAMBANG DAN SINGKATAN

Lambang/Singkata Arti Lambang dan Keterangan

n

CeSO4 Serium sulfat

CH Metin
CHCl3 Kloroform
cm Centimeter
Cq Karbon kuarterner
DBE Double Bond Equivalence
1
H NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance
13
C NMR Carbon Nuclear Magnetic Resonance
HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivity
HSQC Heteronuclear Single-Quantum Correlation
KLT Kromatografi lapis tipis
KKV Kromatografi kolom vakum
KR Kromatografi radial
Kg kilogram
mg miligram
mL mililiter
g gram
s Singlet
MHz Mega hertz
ppm Part per million
Rf Retardation factor
δ Geseran kimia (ppm)
ΰ Bilangan gelombang (cm-1)
μL Mikro liter
UV Ultra violet
PDA Potato Dextrose Agar
PDB Potato Dextrose Borth
rpm Rotasi per menit

xiii
 Isolasi dan Identifikasi Senyawa Steroid dari Ekstrak Metanol Spons
Clathria sp Serta Uji Aktivitasnya Terhadap Jamur Candida albicans.

Wisdayanti Nur Fatma Imran

F1F1 12 132

ABSTRAK

Spons laut dari genus Clathria merupakan sumber berlimpah metabolit

sekunder yang menunjukkan berbagai aktivitas biologis dan struktur kimia yang
menarik. Telah dilakukan isolasi dan identifikasi senyawa metabolit sekunder dari
spons Clathria sp serta uji aktivitasnya sebagai antijamur. Metode pemisahan dan
pemurnian dilakukan dengan ekstraksi menggunakan teknik maserasi dengan
pelarut metanol, dilanjutkan dengan teknik kromatografi kolom vakum (KKV),
kromatografi radial (KR) dan kromatografi lapis tipis (KLT). Struktur senyawa
dievaluasi dengan menggunakan teknik spektroskopi NMR 1D (1H-NMR, 13C-
NMR) dan spektroskopi NMR 2D (HMBC dan HSQC). Hasil interpretasi data
NMR kemudian dibandingkan dengan data spektroskopi yang sama dari beberapa
literatur. Hasil penelitian menunjukkan isolat dari spons Clathria sp. adalah
senyawa a Nor steroid dengan kerangka kolestan yang memiliki kemiripan
dengan senyawa 3β-(hydroxymethyl)-A-nor-5α-cholestane. Uji aktivitas
antijamur menggunakan metode difusi agar berlapis atau metode sumuran
terhadap jamur Candida albicans. Senyawa tersebut menunjukkan tidak adanya
aktivitas terhadap jamur C.albicans.

Kata kunci : Senyawa steroid, Clathria sp., 3β-(hydroxymethyl)-A-nor-5α-

cholestane, C. albicans.

xiv
 Isolation And Identification Steroid Compound Methanol Extracts Of
Sponge Clathria sp And Its Activity Test against Candida albicans fungus

Wisdayanti Nur Fatma Imran

F1F1 12 132

ABSTRACT

Marine sponges of the genus Clathria were an abundant source of

secondary metabolites showed a variety of biological activity and chemical
structure interested. The isolation and identification of secondary metabolites that
was in sponge Clathria sp, and also the activity of antifungal, has tested. Separated
and purificated methods had been extracted by maceration technique using
methanol. In additon, vacuum column chromatographic techniques (KKV), radial
chromatography (KR), and thin layer chromatography (TLC), they were used to
the next separate. The structure of the compounds evaluated using techniques 1D
NMR spectroscopy (1H-NMR, 13C-NMR) spectroscopy and 2D NMR (HMBC
and HSQC). The interpretation of NMR data was compared with the same
spectroscopic data from the literature. The results showed that isolates of sponge
Clathria sp. is a a Nor steroid compound with kolestan frame which has a
similarity with the compound 3β- (hydroxymethyl) -A-nor-5α-cholestane. Next,
The antifungal activity tested with using agar diffusion method or methods plated
sinks on the fungus Candida albicans. It conclude that the compounds of steroid
has not an activity to fungi C.albicans.

Keywords: steroid compound, Clathria sp., 3β- (hydroxymethyl) -A-nor-5α-

cholestane, Candida albicans

xv
 BAB I
PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Penyakit infeksi jamur pada kulit dan kuku masih sering dijumpai.

Perkembangan infeksi jamur di Indonesia yang termasuk negara dengan iklim

tropis disebabkan oleh udara yang lembab, sanitasi yang kurang, lingkungan yang

padat penduduk dan tingkat sosial ekonomi yang rendah. Masalah di dunia

kesehatan bertambah dengan meningkatnya berbagai penyakit yang disebabkan

oleh jamur, terutama jamur Candida. Penyakit yang disebabkan oleh Candida

dikenal dengan kandidiasis atau kandidosis yaitu suatu penyakit jamur yang

bersifat akut dan subakut yang dapat mengenai mulut, area genital wanita, kulit,

kuku, paru-paru dan saluran pencernaan (Rochani, 2009).

Keputihan atau Fluor albus merupakan suatu gejala gangguan alat kelamin

yang dialami oleh wanita, berupa keluarnya cairan berwarna putih kekuningan

atau putih kelabu dari saluran vagina. Secara normal, setiap wanita dapat

mengalami keputihan. Namun perlu diwaspadai bahwa keputihan juga dapat

terjadi karena infeksi yang disebabkan oleh bakteri, virus, jamur (fungi) dan

parasit. Telah dilaporkan bahwa Candida sp. merupakan fungi yang paling banyak

ditemukan pada sekret vagina wanita yang mengalami keputihan (Tjitraresmi

dkk., 2010). Menurut Wozniak dkk. (2002), 85-95% penyebab keputihan adalah

Candida albicans.

Candida albicans merupakan flora normal selaput mukosa saluran

pernapasan, saluran pencernaan dan genitalia wanita. Namun C. albicans

1
diketahui merupakan spesies Candida yang paling berbahaya. Jumlah wanita di

dunia yang pernah mengalami keputihan adalah 75%, sedangkan wanita Eropa

yang mengalami keputihan sebesar 25%. BKKBN (2009) menyatakan bahwa

sebanyak 75% wanita di Indonesia pernah mengalami keputihan minimal satu kali

dalam hidupnya dan 45% diantaranya bisa mengalami keputihan sebanyak dua

kali atau lebih (Nanlessy dkk, 2013). Pada penelitian terdahulu, dilaporkan bahwa

sekitar 70% fungi yang diisolasi dari 3 penderita kandidiasis sistemik adalah C.

albicans. Dilaporkan kandidiasis sistemik mengakibatkan kematian sebesar 30-

40% dan endokarditis melebihi 60%. Selain itu, fungi ini juga dapat menyerang

otak sehingga menyebabkan terjadinya meningitis. Pengobatan infeksi kandidiasis

tersebut dilakukan dengan pemberian obat golongan azol (Ryley dkk., 1984).

Walaupun obat-obatan tersebut efektif untuk pengobatan, namun besarnya efek

samping yang ditimbulkan menjadikan pertimbangan dalam pengobatan. Salah

satu kiat pengobatan alternatif yang dilakukan masyarakat adalah dengan

meningkatkan penggunaan bahan alam berkhasiat obat atau obat tradisional.

Berbagai usaha yang dilakukan untuk pengobatan beragam macam

penyakit yang semakin hari terus meningkat dan menuntut peranan dari berbagai

bidang untuk menemukan berbagai jenis obat-obatan yang dapat digunakan pada

manusia dari hasil kekayaan alam dengan tinjauan parameter keamanan obat

sebelum menjadi produk obat. Penggunaan bahan alam terutama dalam upaya

pencegahan penyakit (preventif), penyembuhan (kuratif), pemulihan kesehatan

(rehabilitatif) serta peningkatan kesehatan (promotif) sebagai paradigma utama

dikalangan masyarakat Indonesia (Daniel, 2010).

2
 Indonesia merupakan salah satu negara maritim terbesar dengan dua

pertiga bagian wilayahnya berupa lautan sehingga memiliki sumber daya alam

hayati laut yang sangat melimpah. Hal ini menjadikan Indonesia sebagai salah

satu negara dengan kekayaan keanekaragaman (biodiversity) hayati laut tertinggi

di dunia. Keanekaragaman hayati perairan laut Indonesia memberi peluang untuk

memanfaatkan biota laut dalam pencarian metabolit sekunder senyawa bioaktif

baru, salah satunya adalah spons (Cahyaningrum dkk., 2015).

Spons merupakan salah satu komponen biota penyusun terumbu karang

yang mempunyai kandungan beberapa senyawa dengan persentase bioaktifnya

lebih besar dibanding dengan senyawa-senyawa yang dihasilkan oleh tumbuhan

darat (Murniasih dan Rahmaniar, 1999). Spons adalah biota laut yang

multiselulerprimitif (metazoan) tanpa jaringan nyata, yang merupakan sumber

metabolit sekunder terkaya (Suryani, 2012). Oleh karena itu, penelitian tentang

bahan obat yang berasal dari spons laut telah banyak dilakukan (Cahyaningrum

dkk., 2015).

Genus Clathria dalam keluarga Microcionidae berisi sekitar 430 spesies

dan subgenus Clathria mencakup sekitar 120 spesies di dunia. Spons laut dari

genus Clathria merupakan sumber berlimpah metabolit sekunder baru

menunjukkan berbagai kegiatan biologis dan struktur kimia yang menarik. Dalam

penelitian Sun dkk (2015), komponen aktif yang utama telah diisolasi berupa

Crambescidin 800, suatu alkaloid guanidin pentasiklik yang telah diisolasi dari

spons laut dan memiliki berbagai aktivitas biologis seperti sitotoksik, antivirus,

dan induksi diferensiasi sel. Senyawa ini juga telah ditemukan untuk menghambat

3
pertumbuhan Saccharomyces cerevisiae dan efek antijamur menunjukkan bahwa

crambescidin bisa berfungsi sebagai senyawa utama untuk melawan infeksi jamur

(Sun dkk., 2015).

Berdasarkan penelitian sebelumnya, spons Clathria sp mempunyai

aktivitas sebagai antifungi dan antibakteri (Istiyani, 2014). Senyawa golongan

alkaloid clathryimine A berhasil diisolasi namun aktivitas biologisnya belum

diketahui (Jaswir dan Yunovilsa, 2014). Sejauh ini belum banyak data penelitian

yang mengeksplorasi senyawa metabolit sekunder dari spons Clathria sp. sebagai

bahan baku obat yang bersifat sebagai antijamur. Oleh karena itu, perlu dilakukan

penelusuran senyawa metabolit sekunder dari spons Clathria sp. dengan

mengisolasi dan mengidentifikasi struktur senyawa metabolit sekunder spons

Clathria sp. serta menguji aktivitas antijamurnya terhadap jamur Candida

albicans ATCC 10231.

B. Rumusan Masalah

Masalah yang dikaji dalam penelitian ini adalah:

1. Senyawa metabolit sekunder apa yang dapat diisolasi dan diidentifikasi

dalam ekstrak metanol spons Clathria sp. ?

2. Bagaimanakah aktivitas antijamur senyawa isolat terhadap jamur Candida

albicans ATCC 10231?

C. Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah:

1. Memperoleh dan mengidentifikasi senyawa metabolit sekunder yang

terkandung dalam spons Clathria sp.

4
2. Mengetahui aktivitas antijamur senyawa isolat terhadap Candida albicans

ATCC 10231.

D. Manfaat Penelitian

Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan manfaat berupa:

1. Bagi peneliti dapat menambah pengalaman, pengetahuan dan

keahlian dalam isolasi, serta identifikasi golongan senyawa, elusidasi struktur

dan uji aktivitas senyawa kimia.

2. Bagi Fakultas Farmasi Universitas Halu Oleo dapat mewujudkan

peran Tri Dharma Perguruan Tinggi di bidang farmasi bahan alam khususnya

isolasi senyawa metabolit sekunder spons laut.

3. Bagi perkembangan ilmu pengetahuan,tambahan informasi

mengenai struktur metabolit sekunder dari spons Clathria sp dan aktivitasnya

sebagai antijamur.

4. Bagi pemerintah daerah khususnya Sulawesi Tenggara dapat

memberikan data dalam pengembangan industri bahan baku obat dengan

potensi biota laut yang dimiliki Indonesia.

5
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Biota Laut Spons

1. Uraian umum spons Clathria sp.

Spons merupakan kelompok hewan invertebrata dengan bentuk yang tidak

simetris. Sebagian besar hidup di laut, spons umumnya hidup pada kedalaman 5-

35 meter dari permukaan laut. Spons tidak bergerak tetapi tinggal dan hidup

sampai dewasa pada suatu tempat seperti layaknya tumbuhan. Sebarannya

didukung oleh larva yang bergerak aktif atau oleh hewan muda yang terbawa arus

sebelum mereka menempel. Sebanyak 7000 spesies spons yang hidup dalam dasar

laut dan beberapa dari spesies spons ini telah ditemukan. Spons dikatakan hewan

karena tidak dapat membuat makanannya sendiri dibandingkan tumbuhan bisa

membuat makanan sendiri, selain itu spons bereproduksi secara seksual atau

aseksual (Romimohtarto dan Juwana, 2001).

Spons kelas Demospongia terdiri lebih dari 90% yang diperkirakan sekitar

4.500 – 5.000 spesies dari total spesies yang hidup di dunia, kelas ini dibagi

menjadi 3 subkelas, 13 ordo, 71 famili (Barnes, 1987). Spons Clathria sp.

merupakan spons yang termasuk ke dalam famili Microcionidae koloninya

berbentuk kipas ujung tipis dan pangkal spons tebal, teksturnya tidak lunak/agak

keras berpori, permukaan spons dilapisi dengan kulit yang halus dan berwarna

orange kemudian bagian dalam spons berwarna putih dan berpori. Ditemukan dari

rataan terumbu sampai kedalaman 10 meter (Hooper, 2002;Haris, 2013).

6
 Spons memiliki pola makan melalui penyaringan air laut di pori-pori

permukaan tubuhnya sehingga dikenal sebagai filter feeder. Umumnya air laut

mengandung nutrien seperti alga, bakteri, jamur, fitoplankton dan mikroba

lainnya. Barnes(1991) melaporkan bahwa spons mempunyai kemampuan

menyaring bakteri yang ada di sekitarnya sebanyak 77 % yang dicerna secara

enzimatik sehingga menghasilkan senyawa aktif. Asosiasi bakteri dengan

organisme laut memiliki peranan penting dalam fungsi ekologis, industri dan

kesehatan manusia (James dkk., 1996).

2. Biologi spons

a. Klasifikasi Spons Clathria sp.

Menurut (Hooper, 2002) spons Clathriasp. diklasifikasikan sebagai

berikut:

Kingdom : Animalia

Filum : Porifera

Kelas : Demospongiae

Ordo : Poecilosclerida

Famili : Microcionidae

Genus : Clathria

Spesies : Clathria sp Gambar 1. Spons Clathria sp (Koleksi Pribadi)

b. Morfologi Spons

Bentuk luar spons laut sangat dipengaruhi oleh faktor fisik, kimiawi dan

biologis lingkungannya. Spons yang berada di lingkungan yang terbuka,

berombak besar, dangkal, dan terkena sinar matahari cenderung pendek

pertumbuhannya, merambat dan memiliki kisaran warna yang gelap hingga terang

7
seperti hitam, coklat, abu, ungu, biru, hijau, orange dan kuning. Sebaliknya spons

dari jenis yang sama pada lingkungan yang terlindung atau pada perairan yang

lebih dalam dan berarus tenang serta tidak terkena sinar matahari pertumbuhannya

cenderung tegak dan tinggi serta warnanya pucat hingga putih. Pada perairan

yang lebih dalam spons cenderung memiliki tubuh yang lebih simetris dan lebih

besar sebagai akibat dari lingkungan yang lebih stabil apabila dibandingkan

dengan jenis yang sama yang hidup pada perairan yang dangkal (Amir dan

Budiyanto, 1996).

c. Reproduksi dan Daur Hidup Spons

Porifera berkembang biak secara aseksual maupun seksual. Reproduksi

aseksual yaitu terjadi dengan cara pembentukkan umumnya fragmentasi yaitu

potongan-potongan dari spons yang patah dapat hidup dengan cadangan makanan

yang ada di tubuhnya kemudian beregenerasi membentuk tunas baru untuk

menjadi spons dewasa (Bergquist, 1978). Reproduksi seksual terjadi pada spons

yang hermaprodit, dimana kebanyakan porifera adalah hermaprodit, namun sel

telur dan sperma diproduksi pada waktu yang berbeda. Sperma dan sel telur

dihasilkan oleh amebocyte. (Amir dan budiyanto, 1996).

3. Ekologi Spons

Spons hidup dan tumbuh dengan cara melekat atau menempel pada

beberapa benda keras bawah laut seperti bebatuan dan karang. Spons memiliki

banyak perbedaan yang sangat beragam antara spesiesnya dalam hal ukuran,

bentuk dan warna. Beberapa spons ada yang berukuran kecil sekecil butiran beras

sampai berukuran besar dengan ukuran panjang lebih dari empat kaki. Dalam

8
pertumbuhannya, bentuk luar spons sangat bervariasi. Bentuk luar ini dapat

berupa tabung, pengebor, merambat, masif, jari, bola, semi bola, bercabang-

cabang, tugu dan sebagainya. Bentuk luar spons laut sangat dipengaruhi oleh

faktor fisik, kimiawi, dan biologis lingkungannya (Suparno, 2005).

B. Efek Farmakologi

Ekstrak dari spons genus Clathria telah dilaporkan memiliki sifat

antibakteri dan antijamur dengan sebagian besar spons menunjukkan aktivitas

antibiotik spektrum luas (Istiyani, 2014). Hal ini membuktikan bahwa spons

sangat potensial dalam pengembangan industri farmasi, mengingat senyawa-

senyawa aktif yang dihasilkan mempunyai perbedaan dengan senyawa yang

dihasilkan oleh tumbuh-tumbuhan darat yang selama ini merupakan sumber

utama bahan obat-obatan (Murniasih, 2003).

C. Metabolit Sekunder

Metabolit sekunder adalah senyawa hasil biosintetik turunan dari metabolit

primer yang umumnya diproduksi oleh organisme. Metabolit sekunder berfungsi

sebagai alat pertahanan diri terhadap herbivora, mikroba, virus dan tumbuhan

kompetitor. Selain itu dalam reproduksi, metabolit sekunder juga berfungsi

sebagai penarik serangga agar terjadi penyerbukan, dengan kata lain metabolit

sekunder memiliki sifat adaptif sehingga tumbuhan dapat bertahan hidup atau

tidak musnah (Sahidin, 2006).

Semua jenis biota tidak terkecuali spons, menghasilkan metabolit primer

dan metabolit sekunder (saat ini umum dikenal dengan istilah natural produk)

yang merupakan hasil proses metabolisme dalam tubuh organisme. Pembentukan

9
metabolit sekunder dipengaruhi oleh lingkungan, sehingga diasumsikan bahwa

pada lingkungan yang berbeda walaupun jenis sama akan menghasilkan metabolit

yang berbeda. Semula metabolit sekunder ini dianggap hanyalah produk buangan

dari tiap biota yang merupakan sisa proses metabolisme namun dengan

berkembangnya ilmu pengetahuan dan teknologi peranan metabolit

sekunder/natural produk mulai terungkap dan ternyata mempunyai manfaat yang

amat penting dan luas baik untuk dirinya sendiri maupun untuk lingkungannya

(Rachmaniar, 1996).

Senyawa metabolit sekunder yang ada pada spons dapat dipisahkan

melalui metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT) sehingga dihasilkan fraksi-

fraksi. Fraksi-fraksi hasil Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dapat diidentifikasi

dengan menggunakan reagen kromogenik (pemberi warna pada noda) yang

mengandung gugus fungsional tertentu sehingga fraksi menjadi berwarna. Warna

pada fraksi merupakan indikator suatu jenis senyawa atau kelompok senyawa.

Senyawa-senyawa tersebut mempunyai aktifitas bioaktif (antikanker, antimikroba

dan antiparasit) yang berfungsi secara farmakologis (Hanani dkk., 2006).

D. Kandungan Kimia

Kandungan kimia dalam spons antara lain alkaloid, terpenoid, steroid,

asam lemak, dan turunan asam amino (Faulkner, 2002). Koleksi biota laut

Indonesia dari spons laut Clathria Sp yang berwarna orange telah berhasil

diisolasi menghasilkan senyawa golongan alkaloid clathryimine A yang belum

diselidiki aktivitas biologisnya (Jaswir dan Yunovilsa, 2014).

10
E. Metode Analisis Senyawa Bahan Alam

1. Metode Isolasi

Isolasi adalah pemisahan suatu komponen kimia dari campuran.

Pemisahan ini didasarkan atas perbandingan sifat partisi komponen tersebut

terhadap adsorbennya (Harborne, 2006). Proses isolasi yang harus dilakukan

untuk memeperoleh senyawa murni meliputi ekstraksi, fraksinasi dan pemurnian

(Sahidin, 2012).

a. Penyiapan Sampel

Sampel bahan alam diambil dari sponsdalam keadaan segar disimpan di

udara terbuka. Pengeringan dilakukan dalam keadaan terawasi untuk mencegah

terjadinya perubahan kimia yang terlalu banyak. Bahan dikeringkan tanpa

menggunakan suhu tinggi, lebih baik dengan aliran udara yang cukup. Setelah

kering, spons dihaluskan dalam bentuk serbuk dengan cara di rajang dengan

menggunakan alat pencacah hingga menjadi serbuk halus spons Clathria sp.

(Harborne, 1996).

b. Ekstraksi

Ekstraksi adalah mengeluarkan senyawa dalam jaringan. Untuk

mengekstrak suatu senyawa diperlukan pengrusakan atau penghancuran dinding

sel atau membran sel secara fisik, mekanik atau kimiawi (Judomidjojo, 1990).

Ekstraksi mengikuti prinsip “like dissolves like” yang berarti bahwa senyawa

polar akan mudah larut dalam pelarut polar dan begitupun sebaliknya (Sudjadi,

1988). Tujuan ekstraksi adalah untuk menarik komponen-komponen kimia yang

11
terdapat dalam suatu sampel dengan menggunakan pelarut tertentu (Harborne,

1996).

Jenis ekstraksi yang sering digunakan adalah ekstraksi panas dan ekstraksi

dingin. Ekstraksi secara panas dilakukan dengan refluks, sokletasi dan destilasi

uap, sedangkan ekstraksi secara dingin dilakukan dengan maserasi (Harborne,

1996). Maserasi adalah perendaman bahan alam yang dikeringkan (simplisia)

dalam suatu pelarut. Metode ini dapat menghasilkan ekstrak dalam jumlah

banyak, serta terhindar dari perubahan kimia senyawa-senyawa tertentu karena

pemanasan (Rusdi dalam Pratiwi, 2009). Proses ini digunakan untuk

mengekstraksi spons Clathria sp.

c. Fraksinasi

Fraksinasi merupakan prosedur pemisahan yang bertujuan memisahkan

golongan utama kandungan yang satu dari kandungan yang lain. Senyawa yang

bersifat polar akan masuk ke pelarut polar dan senyawa non-polar akan masuk ke

pelarut non-polar pula (Harbone,1987). Proses fraksinasi ini dapat diduga sifat

kepolaran dari senyawa yang akan dipisahkan. Berbagai metode kromatografi

memberikan cara pemisahan paling kuat di laboratorium kimia. Gagasan dasarnya

sederhana untuk dipahami, caranya beragam mulai dari cara sederhana sampai

yang agak rumit dari segi kerja dan peralatan dan metode ini dapat dipakai untuk

setiap jenis senyawa (Gritterdkk., 1991).

d. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Teknik kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan suatu cara pemisahan

komponen senyawa kimia di antara dua fase, yaitu fase gerak dan fase diam.

12
Teknik tersebut hingga saat ini masih digunakan untuk mengidentifikasi senyawa-

senyawa kimia, karena murah, sederhana, serta dapat menganalisis beberapa

komponen secara serempak. Teknik standar dalam melaksanakan pemisahan

dengan KLT diawali dengan pembuatan lapisan tipis dengan cara mencuplikan

adsorben pada permukaan plat kaca (Hayani dan Sukmasari, 2005).

Setelah proses pengembangan cuplikan, langkah selanjutnya yaitu

mengamati noda yang telah dipisahkan. Jika diperoleh noda yang berwarna maka

dapat diamati langsung secara visual. Sedangkan untuk noda yang tidak nampak,

dapat dilihat dengan menggunakan lampu ultraviolet (UV), umumnya pada

panjang gelombang 254 nm – 366 nm (Sastrohamidjojo, 1985).

Identifikasi noda dinyatakan dengan nilai Rf (Retardation factor) yang

didefinisikan sebagai rasio jarak noda terhadap titik awal dibagi jarak eluen

terhadap titik awal (Anwar dkk., 1994).

jarak yang ditempu h substansi

RF=
jarak yang ditempu h eluen

e. Kromatografi Kolom Vakum

Kromatografi kolom adalah kromatografi adsorbsi, dimana komponen

yang dipisahkan secara selekstif teradsorbsi pada permukaan adsorben yang

dipakai untuk bahan isian kolom. Pada kromatografi ini digunakan zat padat

sebagai adsorben yang bertindak sebagai fasa stasioner dan menggunakan zat cair

sebagai fase mobil (Adnan, 1997).

Kromatografi kolom digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa

dalam jumlah banyak. Prinsip kromatografi kolom pada dasarnya sama dengan

KLT, dimana senyawa-senyawa dalam campuran terpisahkan oleh karena adsorpsi

13
antara suatu padatan penyerap sebagai fase diam dan suatu pelarut sebagai fase

gerak. Kolom kromatografi biasanya berupa pipa gelas yang dilengkapi sebuah

kran atau kadang-kadang juga dapat digunakan buret. Untuk menahan penyerap di

dalam kolom dapat digunakan wol kaca atau kapas (Sastrohamidjojo, 1985).

Gambar diagram sederhana kromatografi kolom dapat dilihat pada Gambar 2.

Gambar 2. Diagram sederhana kromatografi Kolom vakum (Hostettmann dkk, 1995)

f. Kromatografi Radial

Kromatotron memiliki prinsip sama seperti kromatografi klasik dengan

aliran fase gerak yang dipercepat oleh gaya sentrifugal. Kromatografi jenis ini

menggunakan rotor yang dimiringkan dan terdapat dalam ruang tertutup oleh plat

kaca kuarsa, sedangkan lapisan penyerapnya berupa plat kaca yang dilapisi oleh

silika gel. Plat tersebut dipasang pada motor listrik dan diputar dengan kecepatan

800 rpm. Pelarut pengelusi dimasukkan ke bagian tengah alat sehingga dapat

mengalir dan merambat karena gaya sentrifugal. Untuk mengetahui jalannya

proses elusi dimonitor dengan lampu UV. Gas Nitrogen dialirkan kedalam ruang

plat untuk mencegah pengembunan pelarut pengelusi dan mencegah sampel

14
teroksidasi. Pemasukan sampel itu diikuti dengan pengelusian menghasilkan pita-

pita komponen berupa lingkaran. Pada tepi plat, pita-pita akan terputar keluar

dengan gaya sentrifugal dan ditampung dalam botol (Hostettmann, 1995).

2. Metode Identifikasi

a. Spektrofotometri Inframerah

Spektrofotometri inframerah digunakan untuk penentuan gugus fungsi

khususnya senyawa organik dan juga analisis kuantitatif. Spektrum inframerah

memberikan puncak-puncak maksimal yang jelas sebaik puncak minimalnya.

Spektrum absorpsi dibuat dengan bilangan gelombang pada sumbu X dan

persentase transmitan (T) pada sumbu Y. Radiasi inframerah hanya terbatas pada

perubahan energi setingkat molekul, dimana pada tingkat ini, perbedaan dalam

keadaan vibrasi dan rotasi digunakan untuk mengadsorbsi sinar inframerah,

sehingga untuk dapat mengadsorpsi, molekul harus memiliki perubahan momen

dipol sebagai akibat dari vibrasi (Khopkar, 2003).

Dalam spektrum inframerah posisi pita ditunjukkan sebagai bilangan

gelombang atau panjang gelombang. Gugus fungsional dapat ditentukan dengan

melihat bilangan gelombang atau panjang gelombangnya dimana bilangan

gelombang yang lebih tinggi (4000–1300 cm -1) disebut daerah gugus fungsional,

dalam daerah ini gugus-gugus fungsional yang penting seperti –OH, -NH, -C≡CH,

═CN dan ═C═O menunjukkan puncak yang khas, dan letak puncak tersebut tidak

berubah karena bentuk atau ukuran molekulnya. Daerah (1300–400 cm -1) yang

disebut sebagai daerah sidik jari (finger print region) adalah amat kompleks tetapi

15
spektrum daerah ini sangat berharga bila kita menggunakannya dan disesuaikan

dengan daerah yang lain (Sastrawijaya, 1985).

b. Spektrofotometri 1H-NMR,13C-NMR dan korelasi Heteronuklear

Spektroskopi NMR (Nuclear Magnetic Resonance = Resonansi Magnetik

Inti) berhubungan dengan sifat magnet dari inti atom. Spektroskopi NMR

didasarkan pada penyerapan panjang gelombang radio oleh inti-inti tertentu dalam

molekul organik, apabila molekul ini berada dalam medan magnet yang kuat. Inti

atom unsur-unsur dapat dikelompokkan menjadi dua, yakni atom unsur yang

mempunyai spin atau tidak mempunyai spin. Spin inti akan menimbulkan medan

magnet. Dari resonansi magnet proton (RMP), akan diperoleh informasi jenis

hidrogen, jumlah hidrogen dan lingkungan hidrogen dalam suatu senyawa begitu

juga dari resonansi magnet karbon (RMC) (Khopkar, 2003). Untuk memastikan

kebenaran struktur yang dianalisis, metode ini sering dibantu dengan spektroskopi

2-D yaitu HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence), HMBC

(Heteronuclear Multi Bond Coherence), COSY (Correlation Spectroscopy) dan

NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy) (Silverstein, 1998).

Ada beberapa parameter yang dapat membantu menginterpretasi spektra

NMR yaitu (1) pergeseran kimia, (2) tetapan kopling (J), dan (3) integrasi

(Khopkar, 2003). Nilai-nilai pergeseran kimia untuk proton-proton dan karbon

NMR dapat dilihat pada Tabel 1 dan 2.

16
Tabel 1. Perkiraan nilai-nilai pergeseran kimia untuk proton-proton non aromatik
Gugus δH (ppm) Gugus δH (ppm) Gugus δH (ppm)
CH3-C 0,9 R-CH2-C 1,4 CH-C 1,5
CH3-C-O 1,3 R-CH2-C-O 1,9 CH-C-O 2,0
CH3-C=C 1,6 R-CH2-CO-N 2,2 CH-CO-N 2,4
CH3-CO 2,0 R-CH2-C=C 2,3 CH-CO 2,7
CH3-N 2,4 R-CH2-CO 2,4 CH-N 2,8
CH3-Ar 2,3 R-CH2-N 2,5 CH-Ar 3,3
CH3-O 3,3 R-CH2-Ar 2,9 CH-O 3,9
CH3-O-C-O 3,7 R-CH2-O 4,6 CH-Cl 4,0
CH3-N-CO 4,2 R-CH2-O-CO 3,1 R-CH=C 4,5-6,0

Tabel 2. Pergeseran kimia pada atom-atom 13C

Gugus δC (ppm) Gugus δC (ppm) Gugus δC (ppm)
H3C13-C 5-20 C- H3C13-N 35-65 (C)3C13-C-N 50-70
H3C13-C=C 15-30 C- H3C13-O 55-75 (C)3C13-C-O 70-90
H3C13-Ar 20 (C)2HC13-C 25-55 ArC13-H 115-135
H3C13-COO 20 (C)2HC13-CO 40-70 ArC13-C 137-147
H3C13-CO 22-32 (C)2HC13-Ar 40 ArC13-Cl 135
H3C13-N 25-40 (C)-(O)HC13-Ar 70-80 ArC13-CO 137
H3C13-O 45-55 (C)2HC13-O 65-85 ArC13-N 145-155
C- H3C13-C 16-46 (C)3HC13-C 35-55 ArC13-O 150-160
H3C13-CO 30-50 (C)3HC13-C-CO 45-65 C13=O 170-200
C- H3C13-Ar 30 (C)3HC13-C-Ar 45-65 O- H3C13-Ar 60-70
(Watson, 2009).

Persamaan Double Bond Equivalent (DBE) dapat digunakan untuk

memudahkan dalam menentukan struktur suatu senyawa. Nilai ini dapat

memprediksi banyaknya ikatan rangkap, siklik, karbonil dan gugus nitro dari

suatu senyawa (Watson, 2009).

Spektroskopi korelasi heteronuklear mendeteksi interaksi antara dua inti

yang berbeda seperti 1H dan 13C. Spektroskopi korelasi heteronuklear memilki dua

tipe, yaitu koherensi kuantum tunggal heteronuklear (Heteronuclear Single

Quantum Coherence, HSQC) dan koherensi multiikatan heteronuklear

(Heteronuclear Multiband Coherence, HMBC) (Heinrich dkk., 2009).

17
F. Uji aktivitas Antijamur

Jamur sebagai suatu mikroorganisme eukariotik yang mempunyai ciri-ciri

spesifik yaitu mempunyai inti sel, memproduksi spora, tidak mempunyai klorofil,

dapat berkembang biak secara aseksual dan beberapa jamur mempunyai bagian–

bagian tubuh berbentuk filamen-filamen dan sebagian lagi bersifat uniseluler.

Beberapa jamur meskipun saprofitik, dapat juga menyerbu inang yang hidup lalu

tumbuh dengan subur sebagai parasit dan menimbulkan penyakit pada tumbuhan,

hewan, termasuk manusia, tidak kurang dari 100 spesies yang patogen terhadap

manusia (Rochani, 2009).

Candida albicans tumbuh sebagai mikroflora normal tubuh manusia pada

saluran pencernaan, pernafasan, saluran genital wanita. Jumlah normal Candida

albicans dalam rongga mulut kurang dari 200 sel per ml saliva. Keadaan ini dapat

berubah menjadi patogen pada pasien yang menderita berbagai macam kelainan

sistemik dan juga penggunaan antibiotik jangka panjang, hal ini sering disebut

sebagai penyakit kandidiasis (Rahmah, 2010).

1.Macam-macam Uji antijamur

a. Metode difusi

1) Difusi Cakram (Disc)

Cara ini merupakan cara yang paling sering digunakan untuk menentukan

kepekatan kuman terhadap berbagai macam obat-obatan. Pada cara ini, digunakan

suatu cakram kertas saring (paper disc) yeng berfungsi sebagai tempat

penampung zat antimikroba. Kertas saring tersebut kemudian diletakkan pada

18
lempeng agar yang telah diinokulasi mikroba uji, kemudian diinkubasi pada

waktu dan suhu tertentu, sesuai dengan kondisi optimum dari mikroba uji. Pada

umumnya, hasil yang diperoleh bisa diamati setelah inkubasi selama 18-24 jam

dengan suhu 370C (Greenwood, 1995).

Metode cakram disk atau cakram kertas ini memiliki kelebihan dan

kekurangan. Kelebihannya adalah mudah dilakukan, tidak memerlukan peralatan

khusus dan relatif murah. Sedangkan kelemahnnya adalah ukuran zona bening

yang terbentuk tergantung oleh kondisi inkubasi, inokulasi, predifusi dan

preinkubasi serta ketebalan medium (Pelczar, 1988.).

2) Difusi Parit (Ditch)

Suatu lempeng agar yang telah diinokulasikan dengan jamur uji dibuat

sebidang parit. Parit tersebut berisi zat antimikroba, kemudian diinkubasi pada

waktu dan suhu optimum yang sesuai untuk mikroba uji. Hasil pengamatan yang

akan diperoleh berupa ada tidaknya zona hambat yang akan terbentuk di sekitar

parit (Bonang, 1992).

3) Difusi Sumuran (hole/cup)

Pada lempeng agar yang telah diinokulasi dengan mikroba uji dibuat suatu

lubang yang selanjutnya diisi dengan zat antimikroba uji. Kemudian setiap lubang

itu diisi dengan zat uji. Setelah diinkubasi pada suhu dan waktu yang sesuai

dengan mikroba uji, dilakukan pengamatan dengan melihat ada atau tidaknya zona

hambatan di sekeliling lubang (Bonang, 1992).

Metode sumuran masih jarang digunakan untuk melakukan uji pada

penelitian dikarenakan sulitnya proses perlakuan, namun berdasarkan banyak

19
teori, hasil dari metode sumuran akan lebih mudah terlihat dan menampakan hasil

yang nyata (Prayoga, 2013). Metode sumur (difusi agar) didasarkan pada

kemampuan senyawa-senyawa antibakteri yang diuji untuk menghasilkan jari-jari

zona penghambatan di sekeliling sumur uji terhadap jamur yang digunakan

sebagai penguji (Nurainy dkk., 2008).

b.Metode Dilusi

Metode ini dilakukan dengan mencampurkan zat antimikroba dan media

agar, yang kemudian diinokulasikan dengan mikroba uji. Hasil pengamatan yang

akan diperoleh berupa tumbuh atau tidaknya mikroba didalam media. Aktivitas

zat antimikroba ditentukan dengan melihat konsentrasi hambat minimum (KHM)

yang merupakan konsentrasi terkecil dari zat antimikroba uji yang masih

memberikan efek penghambatan terhadap pertumbuhan mikroba uji (Pratiwi,

2008).

2. Mikroba Uji

a. Candida albicans

Sel jamur Candida albicans berbentuk bulat, lonjong atau bulat lonjong.

Koloninya pada medium padat sedikit menimbul dari permukaan medium, dengan

permukaan halus, licin atau berlipat-lipat, berwarna putih kekuningan dan berbau

ragi. Besar koloni bergantung pada umur. Pada tepi koloni dapat dilihat hifa semu

sebagai benang-benang halus yang masuk ke dalam medium. Pada medium cair

jamur biasanya tumbuh pada dasar tabung (Suprihatin, 1982).

20
 Klasifikasi C. albicans menurut (Frobiscer, 1983) adalah sebagai berikut.

Kingdom : Fungi

Phylum : Ascomycota

Subphylum : Saccharomycotina

Class : Saccharomycetes

Ordo : Saccharomycetales

Family : Saccharomycetaceae

Genus : Candida Gambar 3. Jamur candida albicans

Spesies : Candida albicans

C. albicans dapat tumbuh pada suhu 37oC dalam kondisi aerob atau

anaerob. Pada kondisi anaerob, C. albicans mempunyai waktu generasi yang lebih

panjang yaitu 248 menit dibandingkan dengan kondisi pertumbuhan aerob yang

hanya 98 menit. Walaupun C. albicans tumbuh baik pada media padat tetapi

kecepatan pertumbuhan lebih tinggi pada media cair dengan suhu 37oC.

Pertumbuhan juga lebih cepat pada kondisi asam dibandingkan dengan kondisi

normal atau basa (Biswas dan Chaffin, 2005).

3. Antibiotik pembanding

Antibiotik yang digunakan sebagai pembanding dalam penelitian ini adalah

ketokonazole. Ketokonazol mempunyai spektrum yang luas dan efektif terhadap

Blastomyces dermatitidis, Candida spesies, Coccidiodes immitis, Histoplasma

capsulatum, Malassezia furfur, Paracoccidiodes brasiliensis. Ketokonazol juga

efektif terhadap dermatofit tetapi tidak efektif terhadap Aspergillus spesies dan

Zygomycetes (Lubis, 2008).

21
 Ketokonazol merupakan senyawa turunan imidazol, aktivitasnya

menimbulkan membran sitoplasma jamur tidak teratur dan mempengaruhi

biosintesis ergosterol, sterol pada membran fungus (Olson, 2004). Ketokonazol

bekerja menghambat biosintesis ergosterol yang merupakan sterol utama untuk

mempertahankan integritas membran sel fungi. Ketokonazol bekerja dengan cara

menginhibisi enzim sitokrom P-450, C-14-a-demethylase yang bertanggung jawab

merubah lanosterol menjadi ergosterol, hal ini akan mengakibatkan dinding sel

fungi menjadi permeabel dan terjadi penghancuran fungi (Lubis, 2008).

G. Kerangka konsep

Secara umum, penelitian ini terbagi menjadi tiga tahapan yaitu isolasi

senyawa metabolit sekunder, identifikasi struktur dan uji aktivitas antijamurnya.

Pada tahap isolasi, pemilihan metode merupakan variabel bebas, meliputi teknik

ekstraksi, pemilihan jenis kromatografi, penentuan eluen, dan lain-lain. Variabel

bebas tersebut akan mempengaruhi varibel terikat yaitu senyawa murni yang

berhasil diisolasi (isolat). Senyawa murni kemudian ditentukan strukturnya

berdasarkan data spektroskopi.

Uji aktivitas antijamur dilakukan dengan metode sumuran. Pada tahap ini,

konsentrasi senyawa isolat berperan sebagai variabel bebas yang akan

menentukan variabel terikat yakni luas zona hambat serta pertumbuhan jamur

Candida albicans. Aktivitas antijamur diukur berdasarkan zona bening yang

terdapat pada mikroba pembenihan. Kerangka konsep data dilihat pada Gambar 4.

22
 Spons laut
Teknik Isolasi
Clathria sp

ISOLASI

Senyawa Murni

Aktivitas
Konsentrasi Isolat Antijamur
Uji bioaktivitas

Keterangan:

= variabel bebas

= variabel terikat

Gambar 4 .Kerangka konsep penelitian

23
 BAB III

METODE PENELITIAN

A. Waktu, Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan dengan pengambilan data lapangan dan sampel di

Taman Laut Pendidikan Bintang Samudra Kec. Soropia, kab. Konawe, Sulawesi

Tenggara. Isolasi dan identifikasi terhadap sampel dilakukan di Laboratorium

Bahan Alam Fakultas Farmasi Universitas Halu Oleo, mulai bulan Februari 2016-

februari tahun 2017. Analisis spektrometri dilakukan di Laboratorium Organik

Fakultas Kimia Institut Teknologi Bandung.

B. Jenis Penelitian

Penelitian ini berupa penelitian eksperimental eksplorasi, yaitu mengkaji

kandungan metabolit sekunder spons Clathria sp. dan menguji aktivitasnya

sebagai antijamur.

C. Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan pada peneltian ini adalah Spons Clathria sp.,

metanol (teknis), aseton (teknis), etil asetat (teknis), n-heksan (teknis), kloroform

p.a (QREC®), silika gel 60 GF254 p.a (Merck®), silika 60 G (Merck®),akuades,

serium sulfat (CeSO4) (Merck®), alkohol 70% (teknis), Potatoes Dextrose Agar

(PDA), Potatoes Dextrose Borth (PDB), C. albicans ATCC 10231, Ketokonazol .

24
D. Alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian yakni satu set alat selam, satu set

satu set alat destilasi (Duran-Germany®), satu set alat kromatografi kolom vakum

(KKV), alat kromatografi radial (Kromatotron), Vacuum Rotary

Evaporator(Buchi®), oven (Stuart®), timbangan analitik (Explorer Ohaus®), plat

KLTSi-Gel F254 (Merck®), pipet tetes, mikropipet (Eppendorf®), botol vial, kertas

saring biasa dan whatman No.1, pisau, blender, erlenmeyer (Pyrex®),lampu UV

(UVG-58), chamber,cutter, spatula, pinset, mistar, pipa kapiler, gelas ukur

(Pyrex®), pencadang, pipet ukur, filler, kuvet,spektrofotometer UV-Vis (Genesys-

20), spektrofotometer NMR (1H dan13C) (Agilent), spektroskopi FT-IR (Thermo®).

E. Variabel

Dalam penelitian ini ada dua jenis variabel yaitu variabel bebas dan

variabel terikat.

1. Variabel Bebas

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah metode isolasi yang digunakan

pada tahap isolasi dan konsentrasi senyawa murni pada uji aktivitas antijamur.

2. Variabel Terikat

Variabel terikat dalam penelitian ini adalah luas zona hambat serta

pertumbuhan jamur C. albicans.

F. Definisi Operasional

Definisi operasional dalam penelitian ini sebagai berikut :

25
1. Ekstrak metanol Spons Clathria sp. yang dimaksud dalam penelitian ini

adalah maserat metanol Spons Clathria sp. yang telah diuapkan dengan

rotary vacum evaporator.

2. Eluen yang dimaksud dalam penelitian ini adalah campuran dua atau lebih

pelarut organik, baik yang sudah didestilasi maupun yang belum didestilasi.

3. Kromatografi yang dimaksud dalam penelitian ini adalah teknik pemisahan

senyawa metabolit sekunder dengan menggunakan silika sebagai fasa diam

dan eluen sebagai fasa gerak, seperti KKV dan Kromatografi Radial, serta

dimonitoring dengan KLT.

4. Metabolit sekunder yang dimaksud dalam penelitian ini adalah senyawa

murni/isolat yang diisolasi dari ekstrak metanol Spons Clathria sp.

5. Aktivitas antijamur yang dimaksud dalam penelitian yaitu diameter zona

hambat di sekitar sumuran yang merupakan zona penghambatan atau

kematian C. albicans setelah pemberian senyawa isolat.

G. Prosedur Penelitian

Bagan umum proses penelitian dapat dilihat pada Lampiran 1. Prosedur

penelitian terdiri atas pengambilan sampel, preparasi sampel, ekstraksi, pemisahan

dan pemurnian, identifikasi isolat, uji aktifitas antibakteri. Secara umum, prosedur

penelitian ini tersaji dalam gambar 5.

26
 S p o n s C la tr h r ia sp .

M a se ra s i M e O H

E k stra k 3 0 0 g

KKV

F1 F2 F3 F4 F5

KR

F1a F1b F1c

KR

F11 F12 F13 F14 F15

KR

iso la t

Gambar 5. Bagan prosedur penelitian

1. Pengambilan Sampel

Pengambilan sampel spons Clathria sp. dilakukan pada daerah tubir

karang (Reef Slope) dengan kemiringan 700 mengikuti kontur sejajar garis pantai.

Spons diambil dari perairan pada kedalaman yang sama menggunakan peralatan

selam (SCUBA) dari kedalaman 10 meter dengan metode koleksi bebas induk.

Spons dipotong 10% dari volume awal untuk memberikan kesempatan

beregenerasi.

2. Preparasi Sampel

Sampel spons yang telah diambil dibersihkan, dipotong kecil-kecil, dan

dikeringkan, setelah kering selanjutnya spons dihaluskan dalam bentuk serbuk

27
dengan cara dirajang dengan menggunakan alat pencacah hingga menjadi serbuk

halus spons clathria sp.

3. Ekstraksi

Serbuk spons Clathria sp. dimaserasi dengan pelarut organik metanol

selama 3×24 jam di dalam wadah yang tertutup. Tiap 1×24 jam filtrat dan residu

dipisahkan kemudian dilakukan penggantian pelarut. Filtrat yang terkumpul

dipekatkan dengan menggunakan rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak

kental.

4. Pemisahan dan Pemurnian

Pemisahan dan pemurnian kandungan kimia melalui Kromatografi Kolom

Vakum (KKV), Kromatografi Radial (KR). Fasa diam berupa silika gel,

sedangkan fasa gerak berupa campuran pelarut organik (eluen). Pemisahan tahap

awal (ekstrak total) dapat menggunakan Kromatografi Kolom Vakum (KKV)

berdiameter 4 cm dengan jumlah sampel maksimal 30 g. Kromatografi radial

dipilih untuk pemisahan maupun pemurnian, ketika jumlah fraksi maksimal 2 g

digunakan plat silika dengan ketebalan 4 mm (plat 4), jumlah fraksi maksimal 1 g

digunakan plat silika dengan ketebalan 2 mm (plat 2), dan jumlah fraksi maksimal

0,5 g digunakan plat silika dengan ketebalan 1 mm (plat 1). Setiap tahap

pemisahan dan pemurnian akan dimonitor dengan Kromatografi Lapis Tipis

(KLT) 1 dimensi. Hasilnya diamati di bawah lampu UV 254 nm dan 366 nm serta

disemprotkan penampak noda serium sulfat (CeSO4) lalu dilakukan pemanasan.

28
5. Identifikasi Kemurnian Isolat

Identifikasi kemurnian isolat dilakukan dengan berbagai teknik

spektroskopi, antara lain, spektrofotometer IR dan spektroskopi 1D-NMR ( 13C-

NMR). Kemurnian isolat diuji dengan metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT) 1

dimensi dengan tiga sistem eluen yang berbeda, pengamatan lampu UV 254 nm

dan 366 nm dengan beberapa macam fase gerak sehingga akan menunjukkan pola

noda yang tunggal.

6. Uji Aktivitas Antijamur

a. SterilisasiAlat

Alat-alat gelas yang terdiri dari cawan petri, erlenmeyer, gelas kimia,

tabung reaksi dibersihkan dan dibungkus dengan kertas, kemudian dimasukkan ke

dalam autoklaf dan disterilkan selama 15-20 menit pada suhu 121 oC dan tekanan

15 psi. Ose dan pinset disterilkan dengan alkohol 70% dan kemudian dibakar

sebentar pada api bunsen (Waluyo, 2008).

b. Pembuatan Media

1. Media Dasar dan Media Peremajaan Jamur

PDA (Potatoes Dextrose Agar) sebanyak 20 mg dilarutkan dalam aquadest

500 mL pada Erlenmeyer kemudian dipanaskan di atas hot plate sampai

mendidih. Media disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit.

Setelah didinginkan beberapa saat, kemudian dituang ke dalam beberapa tabung

reaksi yang telah disterilkan, dimiringkan 300 dan dibiarkan memadat. Koloni

jamur diambil dari biakan yang tersedia, digoreskan pada media agar miring

29
secara aseptis dengan jarum ose kemudian diinkubasikan dalam inkubator

(Gozalidkk., 2009).

2. Media Pembenihan

PDB (Potatoes Dextrose Broth) 2,4 g dilarutkan dalam 100 mL akuades

kemudian dipanaskan di atas hot plate sampai mendidih dan diperoleh larutan

jernih lalu disterilkan ke dalam autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit.

c. Pembuatan Suspensi Jamur Uji

Biakan Candida albicans dalam media agar miring disuspensikan dengan

NaCl. Kemudian diambil secukupnya dan dimasukan kedalam media pembenihan.

Lalu dicampur dan diatur kekeruhannya sama dengan larutan Mc.Farland (Carter

dan Cole, 1990).

d. Pembuatan larutan kontrol

1. Larutan kontrol negatif (-)

Larutan kontrol negatif digunakan larutan DMSO 5% dibuat dengan cara

ditimbang sebanyak 5 mL dan ditambahkan akuades sampai 100 mL kemudian

dikocok sampai homogen.

2. Larutan kontrol positif (+)

Larutan kontrol positif yang digunakan yaitu ketokonazol yang dibuat

dengan cara ditimbang 30 mg ketokonazol dan dilarutkan.

e. Pengujian Aktivitas Antijamur

Uji aktivitas antijamur menggunakan metode difusi agar dengan cara

mengukur zona bening yang terbentuk di sekitar sumuran. Cara pengujiannya

yaitu dengan cara mengambil 1 ose jamur yang telah dikulturkan dipindahkan ke

30
media pembenihan kemudian diinkubasi selama 3×24 jam, setalah diinkubasi

kemudian dibandingkan dengan Mc. Farland, yang memiliki tingkat kekeruhan

yang sama.

Potato Dextrose Agar (PDA) yang telah disterilisasi dimasukkan kedalam

cawan petri sebanyak 10 mL dibiarkan hingga memadat sebagai lapisan dasar,

setelah memadat dimasukkan pencadang secara aseptis kedalam cawan petri,

ditambahkan1 mL suspensi jamur kedalam 15 mL PDA lalu dimasukkan kedalam

cawan petri secara aseptis sebagai lapisan semi solidnya dibiarkan hingga

memadat, setelah memadat alat pencadang pada media diangkat secara aseptis

hingga membentuk sumuran pada media (Aminullah, 2010). Selanjutnya

masukkan larutan kontrol positif (+) ketokonazol, larutan kontrol negatif (-)

DMSO 5% dan larutatan uji isolat 0,1%, 0,2%, 0,3%, dengan menggunakan pipet

mikro 100 µL dalam lubang sumuran. Setelah itu dimasukkan dalam inkubator

untuk diinkubasi selam 3×24 jam pada suhu suhu 370C, lalu dilihat dan diukur

daerah bening yang terbentuk.

Daerah bening merupakan petunjuk kepekaan mikroba terhadap antimikroba

yang digunakan sebagai bahan uji yang dinyatakan dengan lebar diameter zona

hambat. Zona hambat yang terbentuk di sekitar sumuran, ditentukan dengan cara

mengukur zona diameter vertikal dan diameter horizontal dengan satuan (mm)

menggunakan jangka sorong (Torar, 2015). Zona hambat yang terbentuk

selanjutnya dibandingkan dengan kontrol positif yang digunakan.

7. Pengolahan dan Analisis Data

Data yang diperoleh antara lain data pemisahan dengan kromatografi lapis

31
tipis (KLT), spektrum IR, spektrum NMR 1-D (1H dan 13C-NMR) dan spektrum

NMR 2-D (HMBC dan HSQC), serta nilai DDH isolat pada uji antijamur. Data

kromatografi Lapis Tipis ekstrak dan fraksi digunakan untuk menentukan eluen

pemisahan dan memonitoring pemisahan yang sudah dilakukan dengan

kromatografi kolom dan kromatografi radial. Data spektroskopi IR dan NMR 1-D

(1H dan13C-NMR), NMR 2-D (HMBC dan HSQC) diinterpretasi dan

dibandingkan dengan literatur sehingga diperoleh struktur senyawa metabolit

sekunder.

32
 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pengkajian kandungan senyawa metabolit sekunder spons Clathria sp.

dilakukan dengan mengisolasi senyawa yang terkandung dari spons dan menguji

aktivitas isolat tersebut sebagai antifungi. Secara keseluruhan kegiatan penelitian

ini terdiri atas tahapan isolasi, identifikasi dan pengujian aktivitas isolat. Tahapan

isolasi dimulai dari preparasi sampel, ekstraksi, selanjutnya dilakukan pemisahan

dan pemurnian. Pada penelitian ini tahapan isolasi yang dilakukan dimulai dari

tahap pemisahan dan pemurnian.

A. Pemisahan dan Pemurnian

Pemisahan dan pemurnian dalam mengisolasi senyawa yang terdapat

didalam suatu sampel spons dapat dilakukan menggunakan teknik kromatografi

seperti Kromatografi Lapis Tipis (KLT), Kromatografi Kolom Vakum (KKV),

dan Kromatografi Radial (KR). Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan

fisik dengan unsur-unsur yang akan dipisahkan terdistribusi antara dua fasa yaitu

fasa gerak dan fasa diam.

Pencarian dan penetapan sistem pelarut untuk Kromatografi Kolom

Vakum (KKV) menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) terhadap ekstrak.

Sistem pelarut merupakan campuran dua atau lebih pelarut sebagai fasa gerak

dalam pemisahan menggunakan teknik kromatografi. Penggunaan dua atau lebih

sistem pelarut dilakukan dengan syarat dapat tercampur dengan sempurna.

33
 (a) (b) (c)

Gambar 6.Kromatogram hasil pemisahan KKV; (a) di bawah UV 254 nm; (b) di
bawah lampu UV 366 nm;(c) setelah disemprot pereaksi serium sulfat

Kromatogram pada Gambar 6. memperlihatkan hasil pemisahan tahap

awal dengan menggunakan KKV. Pemisahan tahap awal dilakukan pemisahan

menggunakan KKV sebanyak 10 kali untuk menghabiskan ekstrak yang tersedia

sehingga setelah dilakukan penggabungan KKV 1-KKV 10 diperoleh 5 fraksi

utama dan dapat dilihat pada tabel 4. Kromatogram di atas terlihat bahwa

senyawa-senyawa dalam ekstrak telah terdistribusi berdasarkan tingkat

kepolarannya. Fraksi-fraksi yang memiliki pola noda yang sama digabungkan

karena cenderung memiliki susunan senyawa yang sama.Penggabungan fraksi

hasil pemisahan dilakukan dengan analisis KLT yang dilihat dari penampakan

pola noda yang sama. Penggabungan dilakukan terhadap fraksi 1-4; 5-9; 10-12;

13-17 dan 18. Hasil penggabungan fraksi dianalisis kembali dengan KLT yang

dapat dilihat pada Gambar 7.

Tabel 4. Fraksi utama hasil pemisahan tahap awal

N Fraksi Berat (g)
o
1. F1 1,1
2. F2 10
3. F3 2,9
4. F4 24
5. F5 97

34
 Fraksi utama di KLT menggunakan n-heksan:etil asetat (9:1) untuk

melihat pola senyawanya sekaligus untuk menentukan fraksi yang akan dikerjakan

lebih lanjut.

Gambar 7.Hasil pemisahan fraksi utama

Berdasarkan pola noda pada Gambar 7, fraksi F1

memperlihatkan jenis senyawa yang cukup

banyak, namun jumlah fraksi ini tergolong sedikit.Untuk

memaksimalkan proses pemisahan, fraksi F2

dikerjakan terlebih dahulu untuk memisahkan bagian atas dan bagian bawahnya.

Senyawa-senyawa yang ada di bagian atas fraksi F2 digabungkan dengan fraksi

F1 untuk dikerjakan lebih lanjut. Fraksi F3, F4, dan F5 menunjukkan pola noda

dan berat fraksi yang sangat banyak, ketiga fraksi ini telah dilakukan oleh peneliti

sebelumnya.

Sebanyak 2 g Fraksi F1 dilakukan pemisahan dengan KR menggunakan

plat 1 mm sebanyak 4 kali perlakuan. Setiap perlakuan sampel yang digunakan

sebanyak 0,5 mg. Fase gerak yang digunakan dalam pemisahan ini adalah n-

heksan dan etil asetat dengan perbandingan 9,5:0,5. Hasil pemisahan dengan KR

pertama dapat dilihat pada Gambar 8.

35
 Gambar 8. Kromatogram hasil pertama KR 1

Kromatogram pada Gambar 8. merupakan hasil KR pertama Fraksi F1.

Pada KR pertama ini menunjukan senyawa-senyawa dari fraksi F1 terdistribusi

sesuai dengan tingkat kepolarannya. Sehingga diperoleh fraksi-fraksi yang terlihat

pada kromatogram memiliki noda-noda yang berbeda satu sama lain. Pemisahan

pada tahap ini dilakukan sebanyak 4 kali untuk menghabiskan fraksi F1 yang

tersisa sehingga setelah dilakukan penggabungan KR1-KR4 diperoleh 9 fraksi dan

dapat dilihat pada Tabel 5. dan Gambar 9.

Tabel.5 Hasil penggabungan KR1-KR4

No. Fraksi Berat (g)

1 F1 1 0,08
2 F1 2 0,61
3 F1 3 0,67
4 F1 4 0,14
5 F1 5 0,08
6 F1 6 0,02
7 F1 7 0,03
8 F1 8 0,03
9 F1 9 0,34

36
 Gambar 9. Kromatogram hasil gabungan Kr F1

Kromatogram diatas merupakan hasil gabungan dari KR1-KR4 dari fraksi

F1. Kromatogram pada Gambar 9. menunjukkan bahwa senyawa-senyawa pada

fraksi F1 telah menunjukkan pemisahan yang baik. Penggabungan dilakukan

berdasarkan kemiripan nilai Rf-nya. Hasil kromatogram penggabungan fraksi F1

selanjutnya dilakukan pemisahan lebih lanjut pada fraksi F1 1 F12 F13 digabung

dan selanjutnya dilakukan pemisahan dengan Kromatografi Radial menggunakan

eluen n-heksan:etil asetat 9,5:0,5. Hasilnya dapat dilihat pada Gambar 10.

Gambar 10. Hasil pemisahan dari gabungan fraksi F11 F12 F13

Gambar 10. memperlihatkan hasil pemisahan yang baik, dilakukan

pemisahan kembali pada tiap fraksi dengan cara Kromatografi Radial

menggunakan fase gerak n-heksan : kloroform ( 9,5:0,5), kemudian kromatogram

yang menunjukkan pola noda sama digabung seperti yang terlihat pada gambar

37
11(a) dan selanjutnya kromatogram yang menunjukkan pola noda sama yaitu

bagian 3, 4 dan 5 digabung untuk dilakukan pemisahan dengan kromatografi

radial menunjukkan hasil seperti yang terlihat pada gambar 11(b).

Gambar 11. (a) (b)

Gambar 11 menunjukkan hasil pemisahan yang baik selanjutnya dilakukan

pemisahan dengan kromatografi radial sehingga diperoleh kromatogram seperti

pada gambar 12, pola noda nomor 9 menunjukkan pola noda tunggal, ini

dinyatakan sebagai isolat yang diperoleh sebanyak 30 mg.

Gambar 12. Kromatogram Hasil pemisahan

Dilakukan uji kemurnian isolat menggunakan berbagai sistem eluen

seperti yang tampak pada gambar 13.

38
 Ket :
Fase gerak :
1. n-heksan : etil asetat : aseton
9,6 : 0,3 : 0,1
2. n-heksan :etil asetat : kloroform
9,6:0,2 : 0,2
3. n-heksan : kloroform 9,7 : 0,3

1 2 3

Gambar 13. Uji kemurnian isolat

B. Identifikasi Isolat

Isolat kemudian dianalisis dengan spektroskopi IR dan spektroskopi NMR.

Analisis dengan spektroskopi IR dilakukan untuk mengidentifikasi gugus fungsi

yang terdapat dalam molekul sedangkan analisis dengan NMR bertujuan untuk

menentukan jumlah dan jenis atom karbon dan hidrogen dalam molekul isolat.

1. Analisis spektrum infra Red

Analisis dengan spektroskopi IR dilakukan untuk mengidentifikasi gugus

fungsi yang terdapat dalam molekul isolat. Prinsip dari identifikasi dengan metode

ini adalah adanya serapan radiasi inframerah oleh molekul yang mengakibatkan

terjadinya perubahan tingkat energi vibrasi sehingga molekul berada dalam

keadaan vibrasi tereksitasi. Panjang gelombang dimana suatu ikatan mengabsorpsi

radiasi inframerah tergantung pada jenis vibrasi dari ikatan tersebut, sehingga tiap

ikatan dari tiap gugus fungsi yang berlainan akan menyerap radiasi inframerah

pada panjang gelombang yang berbeda-beda. Spektrum inframerah isolat dapat

dilihat pada Gambar 14.

39
 100

%T

642.30
854.47
1 2 7 1 .0 9

1 1 1 4 .8 6

5 0 9 .2 1
935.48
95

5 8 4 .4 3
3 4 5 0 .6 5

4 3 2 .0 5
9 6 8 .2 7
90

723.31
85

1 3 7 9 .1 0
80

1 1 7 2 .7 2
75

1 4 6 3 .9 7
70

65
2 8 5 2 .7 2
2 9 2 2 .1 6

1 7 3 7 .8 6
60

4400 4000 3600 3200 2800 2400 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400
riz 1/cm

Gambar 14. Spektrum IR senyawa isolat

Spektrum pada Gambar 14 menunjukkan serapan radiasi inframerah oleh

molekul yang terukur oleh spektrofotometer IR. Frekuensi regangan ikatan Csp3-

H ditunjukkan dengan adanya serapan dengan intensitas tinggi pada bilangan

gelombang 2922,16 cm-1 memperlihatkan banyaknya gugus Csp3–H yang

didukung oleh vibrasi tekukan. Ikatan tekukan Csp3–H pada bilangan gelombang

1463,97 cm-1. Selanjutnya bilangan gelombang 1379,10 cm-1 mengindikasikan

adanya ikatan C-C. Keberadaan gugus karbonil (C=O) dari ester ditunjukkan pada

bilangan gelombang 1737,86 cm-1 dan ikatan C-O pada serapan di bilangan

gelombang 1172,72 cm-1.

2. Spektrum NMR isolat

Spektrum13C-NMR memperlihatkan jumlah karbon yang menyusun

struktur senyawa isolat. Signal karbon memperlihatan senyawa isolat memiliki 31

karbon, terdiri dari karbon karbonil pada geseran kimia 174,1 ppm yang

merupakan ciri khas dari gugus ester, serta karbon siklik dengan ikatan tunggal

40
pada geseran kimia 10-80 ppm. Melalui HSQC, diketahui bahwa senyawa isolat

memiliki 3 karbon kuartener, 8 metin (CH), 14 metilen (CH2), dan 6 metil (CH3).

1.0 U N H A L U - c b w d _ 1 3 C . e s p

0.9

0.8

0.7
Normalized Intensity

0.6

22.65 25.04
0.5

29.28
22.71 29.17
29.62
52.40

38.48

14.13
14.48
34.49
38.97

35.50
0.4

68.20

12.19
55.42

44.13

22.56
0.3

56.27
174.08

0.2

0.1

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20

Chemical Shift (ppm)

Gambar 15. Spektrum 1D 13C NMR

U N H A L U -c b w d _ 1 H .e s p

0.30

0.25
0.77
Normalized Intensity

0.20
0.88
1.29

0.66
0.86

0.15
0.89
0.90

0.84 0.85
1.33

0.10
2.28

1.60
1.65 1.62

0.67
1.09
1.14
1.12

1.07
1.44
1.36
2.27

1.17
1.95
3.96

1.54
1.93
4.10

0.05
1.72
4.11

1.75
2.33

4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5

Chemical Shift (ppm)

Gambar 16. Spektrum 1D 1H NMR

Munculnya signal resonansi pada Gambar 16 disebabkan oleh karena

proton dalam lingkungan kimia yang berlainan. Signal-signal resonansi tersebut

41
letaknya dipisahkan oleh pergeseran kimia (chemical shift). Beberapa signal

mengikuti pola splitting yang spesifik, seperti doublet (d), triplet (t), kuartet

(q),dan seterusnya. Terjadinya splitting disebabkan oleh spin-spin coupling, yaitu

interaksi magnetik dari suatu inti dengan inti lainnya (Harmita, 2007).

Data 1H-NMR menunjukkan bahwa terdapat 54 proton, yang diwakili oleh 15

jenis signal proton, dimana 2 diantaranya memiliki geseran kimia yang cukup

besar yaitu 4,11 dan 3,96 ppm. Besaran ini mengindikasikan bahwa proton

tersebut memiliki kerapatan elektron yang sangat kecil. Sinyal proton

menunjukkan penumpukkan proton dengan integrasi yang sangat besar serta data

multiplitas proton juga menunjukkan banyaknya proton tetangga. Hal ini

mengindikasikan bahwa dalam struktur senyawa isolat terdapat interaksi antar

proton dalam sistem siklik yang saling tumpang tindih dan merupakan ciri khas

dari senyawa golongan golongan triterpenoid atau steroid. Berdasarkan data 1H

dan 13C-NMR dapat diperkirakan rumus molekul senyawa isolat yaitu C31H54O2

dengan DBE (Double Bond Equivalence) = 5 yang berasal dari 4 cincin siklik dan

1 ikatan rangkap. Melalui penelusuran literatur, hipotesis awal struktur senyawa

isolat adalah steroid dengan kerangka kolestan seperti yang tersaji pada Gambar

14 dan Tabel 6.

42
 21 22 24 26
20
18 25
23
12
11 17
19 13 27
16
1 9
14
10 8 15
2
5 7
3
6

O 4

28
29
O

31 30

Gambar 17. Hipotesis senyawa isolat

Tabel 6.Perbandingan data 13C dan 1H-NMR senyawa isolat dengan literatur
N δH (ppm) δHa(pp δCb
δC (ppm) δCa (ppm) δHb ( ppm) HMBC
O m) (ppm)
1 39,1 CH2 1,75 39.2 (CH2) 3.7 1h 39.1 3.7 dd C1-C2-C5
2 27,4 CH2 1,43, 1,94 27.4 (CH2) 3.4 1h 26.6 3.4 t C2-C5-C1
3 38,6 CH 2,34 42.7 (CH) 1.1 1h 42.9 1.1 d C3-C4-C1
4 68,3 CH2 3,92, 4,12 67.0 (CH2) 0.85 1h 66.7 0.85 d C2-C3-C5
5 52,5 CH 1,43 52.6 (CH) 0.7 1h 50.0 0.7 s C5-C9
6 24,5 CH2 1,03, 1,54 24.6 (CH2) 0.6 1h 24.9 0.6 s  
7 32,8 CH2 1,73, 0,84 32.8 (CH2)   31.9   C7-C8
8 35,9 CH 0,98 35.6 (CH)   35.0   C8-C7-C11
9 55,5 CH 0,72 55.5 (CH)   53.3   C9-C10-C5
10 44,2 CQ - 44.1 (CQ)   42.9    
11 22,8 CH2 1,63, 1,31 , 0,65 22.8 (CH2)   20.8   C11-C8
12 39,6 CH2 1,14 39.9 (CH2)   39.8   C12-C13-C14
13 43,1 CQ - 43.1 (CQ)   42.6    
14 56,4 CH 0,98 1,10 56.5 (CH)   56.4   C14-C13-C12
15 23,9 CH2 1,14 24.6 (CH2)   24.2    
16 58,3 CH 0,91, 1,14, 1,62 28.3 (CH2)   28.2   C17
17 56,3 CH 1,0 56.4 (CH)   56.3   C17-C13
18 12,3 CH3 0,66 14.7 (CH3)   14.4    
19 14,6 CH2 0,78 12.5 (CH3)   12.1    
20 35,9 CH 1,29 35.9 (CH)   35.8   C20-C21
21 18,8 CH3 0,84 18.9 (CH3)   18.7    
22 36,3 CH2 0,98 36.3 (CH2)   36.2    
23 23,9 CH3 1,14 23.9 (CH3)   23.9    
24 40,0 CH2 1,95, 1,15 40.9 (CH2)   39.5    
25 28,1 CH 1,52, 1,80 28.1 (CH)   28.0    
26 22,7 CH3 0,86, 1,30, 1,63 22.9 (CH3)   22.7    
27 22,7 CH3 0,86, 1,30, 1,63 23.3 (CH3)   22.7    
28 174,2 CQ
29 34,4 CH2 2,27, 1,34
30 22,2 CH2 1,27
31 14,2 CH3 0,89, 1,26
Ket: hipotesis struktur berdsarkan literatur dari Eggersdorfer (1982) dan Nantheuil (1985).

43
 Pembuktian struktur lebih lanjut menggunakan analisis NMR 2D-HMBC

yang memperlihatkan korelasi jarak jauh antar proton dan karbon. Gambar 18

memperlihatkan korelasi jarak jauh proton pada posisi 4 dengan C-2, C-3, dan C-

5, serta terdapat kontur antara H-1 dengan C-2 dan C-5 yang turut membuktikan

kebenaran struktur yang diajukan. Adanya korelasi antara H-14 dengan C-12 serta

C-13 juga turut mendukung ketepatan letak karbon dalam sistem siklik. Karbon

C-4 memiliki geseran kimia yang relatif besar disebabkan oleh esterifikasi

sehingga kerapatan elektron karbon ini cenderung berkurang karena pengaruh

keelektronegatifan karbon karbonil C-28. Adanya korelasi dari karbon C-28

dengan proton H-3, H-4 dan H-29, hal ini semakin meyakinkan struktur senyawa

isolat merupakan steroid yang merupakan analog dari kerangka kolestan.

H -2 9
H -4
H -3

20

21
40
20
18
26 60
17
19 11 13 25
F1 Chemical Shift (ppm)

1 80
27
10 8 15
100
3
5
H
4 120
O
H H
140
28
O
H3C 160
31 H
C -2 8
180

200

13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 -1 -2
F2 Chemical Shift (ppm)

Gambar 18. Pola HMBC senyawa isolat

44
C. Uji Aktivitas Antijamur

Uji aktivitas antijamur senyawa isolat menggunakan metode cup-plate

technique, pengamatannya berdasarkan diameter daerah hambat yang muncul di

sekitar sumuran yang berisi senyawa isolat. Uji antifungi bertujuan untuk

mengetahui kemampuan senyawa isolat dalam menghambat jamur yang diujikan.

Jamur yang dgunakan dalam pengujian ini yaitu C. albicans ATCC 10231.

Diameter daerah hambat (DDH) yang terbentuk dari uji antijamur diukur dan

dibandingkan dengan kontrol negatif berupa etil asetat dan kontrol positif yang

digunakan pada uji antijamur ini adalah ketokonazole. Kontrol negatif etil asetat

bertujuan untuk mengetahui pelarut yang digunakan dalam uji ini tidak

memberikan efek penghambatan. Sedangkan kontrol positif bertujuan untuk

mengetahui efektivitas senyawa isolat yang diuji. Penggunaan kontrol negatif

pada uji aktivitas antijamur yaitu etil asetat, karena pelarut organik ini sebagai

pelarut yang melarutkan senyawa isolat dan pelarut ini tidak memberikan aktivitas

antifungi. Apabila diameter zona hambat senyawa isolat lebih besar dari pada

zona hambat kontrol positif maka senyawa isolat sangat efektif sebagai antijamur,

sedangkan jika zona hambat yang dibentuk senyawa isolat lebih kecil atau bahkan

tidak ada maka isolat kurang efektif atau tidak dapat digunakan sebagai antijamur.

Kategori Pengukuran diameter daerah hambat pada uji antijamur berdasarkan

penggolongan Davis dan Stout (1971) dalam jurnal Kandoli dkk, yaitu sebagai

berikut: a. Diameter zona hambat diatas 20 mm artinya daya hambat sangat kuat;

b. Diameter zona hambat 11-20 mm artinya daya hambat kuat; c. Diameter zona

hambat 5-10 mm artinya daya hambat sedang; d. Diameter zona hambat 0-4 mm

45
artinya daya hambat lemah. Hasil pengukuran diameter daerah hambat pada uji

antijamur dapat dilihat pada tabel 7.

Tabel 7. Diameter Daerah Hambat

Diameter Daerah Hambat Ket
Kons. Uji (mm)
Jamur
(mg/L)
A B C x ∑
(mm)
0,1 % - - - -
0,2 % - - - -
C.albicans 0,3 % - - - -
K+ 17 15 16 16 Kuat
K- - - - -

A B C

Gambar 17. Hasil uji anti jamur (a) perlakuan1 (b)perlakuan 2 (c)perlakuan 3

Hasil pengamatan pada Gambar 17 dan Tabel 7 memperlihatkan bahwa

senyawa isolat tidak dapat menghambat pertumbuhan fungi C. albicans yang

ditandai dengan tidak adanya zona bening disekitar sumuran, hanya kontrol positif

yang mampu menghambat fungi yang diujikan dengan terbentuknya zona bening

yang terdapat disekitar sumuran. Hal ini disebabkan karena ketokonazol bekerja

menghambat biosintesis ergosterol yang merupakan sterol utama untuk

mempertahankan integritas membran sel fungi. Bekerja dengan cara menginhibisi

enzim sitokrom P-450, C-14-a-demethylase yang bertanggung jawab merubah

lanosterol menjadi ergosterol, hal ini akan mengakibatkan dinding sel fungi

menjadi permiabel dan terjadi penghancuran fungi.

46
 BAB V
PENUTUP

A. KESIMPULAN

Kesimpulan dari penelitian ini adalah:

1. Senyawa yang berhasil diisolasi dan diidentifikasi dari ekstrak metanol spons

laut Clathria sp. merupakan senyawa A-Nor Steroid dengan kerangka

kolestan dengan rumus molekul C31H54O2.

2. Hasil uji aktivitas antijamur menunjukkan senyawa isolat tidak aktif sebagai

antijamur.

B. SARAN

1. Saran dari peneliti perlu dilakukan pengkajian lebih lanjut mengenai

kandungan metabolit sekunder spons Clathria sp. dan aktivitasnya dalam

berbagai sistem uji serta penentuan kadarnya dalam spons.

2. Diperlukan adanya data spektrum MS untuk pembuktian struktur kimia

lebih lanjut.

47
 DAFTAR PUSTAKA

Adnan, M., 1997, Teknik Kromatografi untuk Analisis Bahan Makanan,

Yogyakarta.
Amir, I. dan Budiyanto A., 1996, Mengenal spons laut (Demospongiae) secara
umum,Oseana,21(2): 15-31.
Andayani, S.G.D., Linar, Z.U., Kardono, L.B.S., Hanafi, M., 2006, Antibiotika
Baru dari Actinomycetes dan Jamur, Prosiding Seminar Nasional
Himpuanan Kimia Indonesia, Departemen Kimia FMIPA IPB, Bogor.

Anwar, C., Purwono, B., Paranomo, H.D., Wahyuningsih dan Tutik, D., 1994,
Penuntun Praktikum Kimia Organik, Fakultas Matematika and Ilmu
Pengetahuan Alam Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
Astuti, P., Alam, G., Hartati, M.S., Sari, D., dan Wahyuono, S., 2005, Uji
sitotoksik senyawa alkaloid dari spons Petrosia sp: potensial
pengembangan sebagai Antikanker,Majalah Farmasi Indonesia16 (1) : 58
– 62.
Barnes, 1991,Invertebrata Zoologi, Blackywell scientific PV6 Oxford London,
Melbourne.
Barnes, R. D., 1987, Invertebrata zoology, Ed ke-50, Saunders College
Publishing. Pennsylvania.
Bergquist, P.R., 1978,Sponges Hutchinson, London.
Bhakuni, D.S. dan Rawat, D.S., 2005, Bioaktif Marine Natural Products,
Anamaya, New Delhi.
Bonang, G., 1992, Mikrobiologi Untuk Profesi Kesehatan Edisi 16, Jakarta : Buku
Kedokteran EGC.
Cahyaningrum P.L., I Made Dira Swantara, I Gede Mahardika., 2015, Toksisitas
Isolat Dari Ekstrak Metanol Spons Clathria (Thalysias) Sp Terhadap Larva
Artemia Salina L, Cakra Kimia (Indonesian E-Journal of Applied
Chemistry), 3 (12), hal 50-55.
Daniel, 2010, Isolasi dan Identifikasi Senyawa Flavonoid Pada Fraksi Etil Asetat
Dari Daun Tumbuhan Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz), Jurnal
Mulawarman Scientifie,9(1). Hal: 17-26.
Depkes RI, 1997,Farmakope Indonesia, Edisi III, Depkes RI, Jakarta.
Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1986, Sediaan
Galenik,Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.

48
Faulkner, D.J., 2002, Marine natural products. Natural Products. Hal 1–48.
Gozali, D., Rusmiati, D. dan Utama, P., 2009, Formulasi dan Uji Stabilitas
Mikroemulsi Keto konazole Sebagai Antijamur Candida albicans dan
Tricophytonmentagrophytes,Farmaka,7(2).

Gritter R. J., Bobbit J. M., dan Schwanrning, 1991, Pengantar Kromatgorafi, ITB
Press, Bandung.
Harborne, J.B., 1987, Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisa
Tumbuhan, Edisi II, Penerbit Institut Teknologi Bandung, Bandung.
Harborne, J.B., 1996, Metode Fitokimia : Penuntun Cara Modern Menganalisa
Tumbuhan, Edisi II, ITB Press, Bandung.

Haris, A., 2006, Transplantasi spons Aaptos aaptos Schmidt: Densitas gamet dan
pertumbuhan. Torani, 16 (1): 1-7.
Hayani, E.dan Sukmasari, M., 2005. Teknik Pemisahan Komponen Ekstrak
Purwoceng Secara Kromatografi Lapis Tipis. Buletin Teknik Pertanian,
Vol. 10 No. 2.
Heinrich, M., Joanne B., Simon G., Elizabeth M. W., 2009, Farmakognosi dan
Fitoterapi, EGC, Jakarta.
Hooper, J.N.A., 2002,Sponguide Guide to Spons Qollection and Identification,
Queensland Museum, South Brisbane.
Hostettmann, K., M. Hostettmann dan Marston A., 1995, Cara kromatografi
Preparatif: Penggunaan pada Isolasi Senyawa Alam, Penerbit ITB,
Bandung.
Ichiba T, Corgiat J.M., Scheuer PJ, Kelly-Borges M., 1994, 8-
Hydroxymanzamine A, a ß-Carboline Alkaloid from a Sponge,
Pachypellina sp. Natural Products .57 (16).
Istiyani, WD., 2014, Kajian Aktivitas Antibakteri dan Metabolit Sekunder
Beberapa Jenis Spons, Skripsi, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan,
Jurusan Perikanan, Universitas Halu Oleo, Kendari.
James, S.G., Holmstrom, C.dan Kjelleberg, S., 1966, Purification
andcharacterization of a novel antibacterial protein from the marine
bacterium D2,Applied and Environmental Microbiology, 62(8), 2783–
2788.
Jaswir, I. dan Masteria, Y.P., 2014,The Alkaloids from Indonesian Marine
Sponges,Journal Oceanography, Volume 2, ISSN: 2332-2632.
Johnson, 2011, Dasar Kromatografi Cair, Penerbit ITB, Bandung.

49
Judomidjojo, M., Darwis, A.A., Sa’id, E.G., 1990, Teknologi Fermentasi, Institut
Pertanian Bogor, Bogor.
Kandoli F., Jimmy A. dan Michael L., 2016, Uji Daya Hambat Ekstrak Daun
Durian (Durio Zybethinus) Terhadap Pertumbuhan candida albicans
Secara In Vitro, Jurnal Ilmiah Farmasi UNSRAT, 5 (1), 2302-2493.
Khopkar, S.M., 2003, Konsep Dasar Kimia Analitik, Universitas Indoneisa,
Jakarta.
Mercy, N., Abidjulu, J., Kamu, S.F., 2013, Pengaruh Antibakteri Ekstrak Kulit
Batang Matoa(Pometia pinnata) terhadap Bakteri Staphylococcus
aureussecara In vitro,Jurnal MIPA UNSRAT Online, 2 (2), 128-132.

Muniarsih T. dan Rachmaniar R., 1999, Isolasi Substansi Bioaktif Antimikroba

dari Spons Asal Pulau Pari Kepulauan Seribu. Prosidings Seminar
Bioteknologi Kelautan Indonesia I ’98. Jakarta 14–15 Oktober 1998: 151-
158.
Murniasih,A., 2003,Metabolit Sekunder Dari Spons Sebagai Bahan Obat-
Obatan,Jurnal Oseana, VXXVIII(3), 27-33.
Nanlessy, D.M., Hutagaol, E., dan Wongkar, D., 2013, Hubungan antara
Pengetahuan dan Perilaku Remaja Puteri dalam Menjaga Kebersihan Alat
Genitalia dengan Kejadian Keputihan Di SMA Negeri 2 Pineleng, J.
Keperawatan , 1(1):1-5.

Nurainy, F., Rizal, S., Yudiantoro, 2008, Pengaruh Konsentrasi Kitosan Terhadap
Aktifitas Antibakteri dengan Metode Difusi Agar (Sumur), Universitas
Lampung,Jurnal Teknologi Industri dan Hasil Pertanian.13(2), 118-119.

Olson, J., 2004. Belajar Mudah Farmakologi, Cetakan 1, EGC . Penerbit Buku
Kedokteran Jakarta.
Pelczar, M. J. dan Chan. E. C., Penerjemah: Hadioetomo, R. S., 1986,Dasar-
dasar Mikrobiologi, Jilid I. Penerbit Universitas Indonesia, Jakarta.
Pratiwi, I., 2009, Uji Antibakteri Ekstrak Kasar Daun Acalypha indica terhadap
Bakteri Salmonella choleraesuis dan Salmonella typhimurium,Skripsi,
Jurusan Biologi FMIPA UNS, Surakarta.
Pratiwi, S.T., 2008, Mikrobiologi Farmasi, Erlangga, Jakarta.

Rachmaniar, R., 1996, Penelitian Produk Alam Laut Skreening Substansi

Bioaktif, Laporan Penelitian Tahun Anggaran 1995/1996. Lembaga Ilmu
Pengetahuan Indonesia, Puslitbang Oseanologi.

50
Rahmah, M., Utami, R. dan Fitri, N.R., 2010, Pemeriksaan Residu Antibiotik
pada Hati Kerbau dan Ikan Nila dengan Metode Difusi Agar,
JurnalPeternakan, Vol 7(1) : 29-34.
Rochani, N., 2009, Uji Aktivitas Antijamur Ekstrak Daun Binahong (Anredera
Cordifolia (Tenore) Steen) Terhadap Candida Albicans Serta Skrining
Fitokimianya, Skripsi. Universitas Muhamadiyah, Surakarta.
Romimohtarto, K. dan S. Juwana. 2001, Biologi laut : Ilmu pengetahuan
tentang biota laut. Jakarta : Pusat Penelitian dan Pengembangan
Oseanologi-LIPI. Jakarta.
Roy J., Gritter, James M., Bobbit, Arthur, E.S., 1991,Pengantar Kromatografi.
Penerbit ITB. Bandung.
Ryley, J.F., Wilson, R.G. dan Barrett-Bee K.J., 1984, Azole resistance in Candida
albicans, Sabouraudia, 22(1):53-63.
Sahidin, I., 2012, Mengenal Senyawa Alami, Unhalu Press, Kendari.
Sastrawijaya, A.T., 1985,Penentuan Struktur Molekul, Jurusan Kimia IKIP
Surabaya. Cetakan Bina Ilmu Offse, Surabaya.

Sastrohamidjojo, H., 1985, Kromatografi, UGM Press, Yogyakarta.

Silverstein, 1998, Spectrometric Identification of Organic Compounds, Edisi ke-6,
Jhon Willey and Sons, New York.
Sjorgren, M., 2006, Antifouling Activity of Synthesized Peptide Analogs of the
Sponge Metabolite Barettin, Peptides, 27 (9), hal 2058-2064.
Sudjadi, 1988, Metode Pemisahan Kimia, Kanisius, Yogyakarta.
Suharyanto, 2003, Beberapa Aspek Biologi Sponge (Auletta Sp.) di Perairan
Pulau Barranglompo Sulawesi Selatan,Jurnal Penelitian Perikanan
Indonesia,(9)1: 61-66.
Sun, X., Sun, S., Ference, C., Zhu, W., Zhou, N., Zhang, Y., & Zhou, K. (2015).
A potent antimicrobial compound isolated from Clathria cervicornis.
Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Vol. 25.
Suparno, 2005,Kajian Bioaktif Spons Laut (Forifera: Demospongiae) Suatu
Peluang Alternatif Pemanfaatan Ekosistem Karang Indonesia Dalam
Dibidang Farmasi.Makalah Pribadi Falsafah Sains (PPs 7002), Institut
Pertanian Bogor.
Suriyani, Usman H dan Ahmad A., 2012, Isolasi, Karakterisasi dan
UjiBioaktifitasMetabolitSekunderdariSponsCallyspongia sp.,Vol.12(1), 2–
8.

51
Tjitraresmi, A., Kusuma, S.A.F. dan Rusmiati, D., 2010, Formulasi Dan Evaluasi
Sabun Cair Antikeputihan Dengan Ekstrak Etanol Kubis Sebagai Zat
Aktif, Fakultas Farmasi, Universitas Padjadjaran Bandung.

Waluyo, L., 2008, Teknik Metode Dasar Mikrobiologi, UMM Press, Malang.

Watson, D.G., 2009,Analisis Farmasi : Buku Ajar untuk Mahasiswa Farmasi dan
Praktisi Kimia Farmasi Edisi 2, Penerbit Buku Kedokteran, Jakarta.
Wozniak, K.L., Floyd, L., Wormley, Jr., Paul, L. dan Fidel, Jr., 2002, Candida-
Specific Antibodies during Experimental Vaginal Candidiasis in Mice,
Infect. and Immun., 70(10):5790-5799.

52
 LAMPIRAN

Lampiran 1. Bagan Umum Penelitian

Clathria Sp

sortasi basah, pencucian, perajangan, pengeringan

dan penghalusan

Sampel
(Serbuk)

ekstraksi dengan metanol,

dipekatkan dengan rotavapor
Ekstrak total
(ekstrak metanol)

pemisahan dengan KKV

Fraksi Fraksi Fraksi Fraksi Fraksi

1 2 3 4 n

- monitoring dengan KLT

- gabung sesuai dengan pola noda
- pemurnian
Senyawa murni

- penentuan struktur (spektroskopi)

- uji antijamuri

Struktur senyawa dan

aktivitas antijamur

53
Lampiran 2. Standar Mc. Farland

Standar Mc. Farland berada dalam konsentrasi spesifik dari jamur per mL.
Jumlah jamur sesuai dengan skala Mc. Farland(Guinea dkk, 2010).
Jumlah jamur
Spesies
(x 106/mL)
T. mucoides 4,5 x 106
Rhodotorula spp. 1,9 x 106
C. tropicalis 3,3 x 106
S. cerevisiae 1,2 x 106
C. parapsilosis 1,3 x 106
C. glabrata 4,3 x 106
C. albicans 1,4 x 106
C. kefyr 2,1 x 106
C. krusei 3,1 x 106
T. inkin 1,4 x 106

54
Lampiran 3. Bagan Alir Uji Aktivitas Antijamur
a. Sterilisasi

Alat dan Bahan

- dicuci sampai bersih

- dikeringkan
- dibungkus dengan kertas
- dimasukkan dalam autoklaf pada suhu
1210C dan tekanan 15 Psi selama 15-20
menit.

Alat dan Bahan

steril

b. Pembuatan media PDA

Potato Dextrose Agar

- ditimbang sebanyak 3,9 gram

- dilarutkan dalam erlenmeyer dengan
aquades sebanyak 100 ml
- dipanaskan sampai mendidih
- dimasukkan dalam autoklaf pada suhu
1210C dan tekanan 15 Psi selama 15-20
menit.

Media jamur (PDA)

steril

55
c. Pembuatan media PDB

Potato Dextrose Broth

- Diambil 2,4 gram

- dilarutkan dalam 100 mL aquades
- dipanaskan hingga mendidih dan
terdapat larutan jernih
- dimasukkan dalam autoklaf pada suhu
1210C dan tekanan 15 Psi selama 15-20
menit.

Media jamur (PDB)

steril

d. Pembuatan suspensi Jamur

Larutan PDB 5 mL

- ditambahkan 1 ose kultur jamur yang

akan diujikan sedikit demi sedikit
- dikocok dengan vortex
- dilihat kekeruhannya lalu dibandingkan
dengan larutan standar Mc. Farland

Suspensi Jamur

56
e. Pengujian aktivitas Antijamur

Media uji PDA

- Diambil sebanyak 10 mL
- Dimasukkan kedalam cawan petri secara
aseptis
- Dibiarkan hingga memadat
Lapisan bawah

- Ditancapkan 5 pencadang
- Diambil media sebanyak 15 mL
- Ditambahkan 1 mL suspensi jamur
- Dihomogenkan
- Dimasukkan lagi kedalam cawan petri yang
telah ditancapkan pencadang
- Dilakukan secara aseptis
- Dibiarkan hingga memadat
- Dibuka pecadang setelah media lapis atas
memadat
- Dimasukkan masing-masing konsentrasi
isolat
- Dimasukkan kedalam kulkas selama 60
menit
- Diinkubasi selama 3x24 jam pada suhu 37°C
- Diamati dan diukur zona bening yang
terbentuk

Diameter zona
hambat

57
Lampiran 4. Perhitungan

a. Perhitungan untuk pembuatan Media dasar dan media semi solid

 Media dasar (PDA)

39
× 100 mL = 3,9 gram
1000
Jadi, untuk media dasar ditimbang sebanyak 3,9 gram dan dilarutkan
dengan aquades dalam 100 mL
b. Perhitungan diameter zona hambat

Gambar Cara perhitungan diameter zona hambat

Pengukuran diameter zona hambat =2 xz−2 yz

Ket : 2xz = diameter zona bening dan sumuran

2yz = diameter sumuran

a,b,c,d = sisi pengukuran zona bening

Diameter zona bening yang diukur seperti pada gambar diatas Pengukuran

dilakukan pada empat sisi yaitu pada sisi a, b, c dan sisi d, kemudian dihitung nilai

rata-rata dari hasil pengukuran empat sisi tersebut. Cara menghitung rata-rata

diameter zona bening yaitu :

a+b+ c+ d
4

1. Perhitungan Zona Hambat Candida albicans

Perlakuan 1

58
 Dik : Sisi a = 18 mm
Sisi b = 19 mm
Sisi c = 20 mm
Sisi d = 19 mm
Diameter pencadang = 4 mm
Dit : Diameter zona hambat?
18+19+20+19
Rata-rata zona hambat =
4
= 19 mm
Diameter zona hambat = 19 mm – 4 mm
= 15 mm
Perlakuan 2

Dik : Sisi a = 20 mm
Sisi b = 20 mm
Sisi c = 21 mm
Sisi d = 19 mm
Diameter pencadang = 4 mm
Dit : Diameter zona hambat?
20+20+21+19
Rata-rata zona hambat =
4
= 20 mm
Diameter zona hambat = 20 mm – 4 mm
= 16 mm
Perlakuan 3
Dik : Sisi a = 21 mm
Sisi b = 19 mm
Sisi c = 20 mm
Sisi d = 20 mm
Diameter pencadang = 4 mm
Dit : Diameter zona hambat?

59
 21+ 21+ 22+ 20
Rata-rata zona hambat =
4
= 21 mm
Diameter zona hambat = 21 mm – 4 mm
= 17 mm
c. Perhitungan Pembuatan Kontrol Positif

Dilarutkan 30 mg dalam 30 mL akuades = 1000 mg/L

M1 x V1 = M2 x V2
1000 mg/L x x = 30 mg/L x 0,1 L
1000 mg/L x = 300 mg
3000 mg
x =
1000 mg/L
x = 0,03 L = 30 mL
d. Perhitungan Konsentrasi Isolat Uji

1. Konsentrasi 0,1 %

b/v (%) = g/mL

1 mg
x 100 %
1mL

0,001 g x 100 = 0,1 %

1 mL
2. Konsentrasi 0,2 %

2 mg x 100 %
1 mL
0,002 g x 100 = 0,2 %
1 mL
3. Konsentrasi 0,3 %

3 mg x 100
1 mL
0,003g x 100 = 0,3 %
1 mL

60
61
Lampiran 5. Hasil Uji Antijamur Isolat

A B C

Ket
Diameter Daerah Hambat (mm)
Kons. Uji
Jamur C
(mg/L)
A B C ∑x
(mm)
0,1 % - - - -
0,2 % - - - -
C.albicans 0,3 % - - - -
K+ 17 15 16 16 Kuat
K- - - - -

62
Lampiran 6. Dokumentasi Penelitian

Kromatografi Radial (KR)

PDA PDB Suspensi Jamur

Proses Sterilisasi Uji Aktivitas

Antijamur

63