PENGARUH MSC-CM TERINDUKSI SERUM INFLAMASI DOSIS

TINGGI TERHADAP KADAR VEGF PADA LUKA

(Studi Eksperimental In Vivo Mesencymal Stem Cell Conditioned Medium

Terhadap Tikus Galur Wistar Model Luka Eksisi)

Usulan Penelitian untuk Skripsi

Diajukan Oleh :

Rizky Aslia Kusuma Putri

30.101.507548

FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS ISLAM SULTAN AGUNG

SEMARANG

2018
 Usulan Skripsi

PENGARUH MSC-CM TERINDUKSI SERUM INFLAMASI DOSIS

TINGGI TERHADAP KADAR VEGF PADA LUKA

(Studi Eksperimental In Vivo Mesencymal Stem Cell Conditioned Medium

Terhadap Tikus Galur Wistar Model Luka Eksisi)

Diajukan oleh :
Rizky Aslia Kusuma Putri

30.101.507548

Telah disetujui oleh :

Pembimbing I

dr.  Hj. Durrotul Djannah, Sp.S Tanggal : .................................

Pembimbing II

Dr. dr. H. Agung Putra, M. Si, Med. Tanggal : .................................

 DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL........................................................................................
i
HALAMAN PENGESAHAN..........................................................................
ii
DAFTAR ISI....................................................................................................
iii
BAB I PENDAHULUAN.............................................................................
1
1.1. Latar Belakang...............................................................................
1
1.2. Rumusan Masalah..........................................................................
3
1.3. Tujuan Penelitian...........................................................................
3
1.3.1 Tujuan Umum......................................................................
3
1.3.2 Tujuan Khusus.....................................................................
3
1.4. Manfaat Penelitian.........................................................................
4
1.4.1 Manfaat Teoritis...................................................................
4
1.4.2 Manfaat Praktis....................................................................
4
BAB II TINJAUAN PUSTAKA......................................................................
5
2.1. Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)..............................
5
2.1.1 Definisi.................................................................................
5
2.1.2 Reseptor VEGF....................................................................
5
2.2. Penyembuhan Luka........................................................................
6
2.3. Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Penyembuhan Luka..............
9
 2.4. Mesenchymal Stem Cell (MSC).....................................................
10
2.4.1 Definisi.................................................................................
10
2.4.2 Sumber.................................................................................
10
2.4.3 Karakteristik.........................................................................
11
2.5. Mesenchymal Stem Cell Conditioned Medium (MSC-CM)...........
12
2.6. Hubungan antara Mesenchymal Stem Cell Conditioned Medium
(MSC-CM) dengan Kadar VEGF pada Penyembuhan Luka.........
13
2.7. Kerangka Teori..............................................................................
17
2.8. Kerangka Konsep...........................................................................
17
2.9. Hipotesis........................................................................................
18
BAB III METODE PENELITIAN...................................................................
19
3.1 Jenis dan Rancangan Penelitian.....................................................
19
3.2 Variabel Penelitian dan Definisi Operasional................................
20
3.2.1. Variabel Penelitian.............................................................
20
3.2.2. Definisi Operasional..........................................................
20
3.3 Populasi dan Sampel Penelitian.....................................................
21
3.3.1. Populasi Penelitian.............................................................
21
3.3.2. Sampel Penelitian...............................................................
21
3.3.3. Cara Pengambilan Sampel Penelitian................................
22
3.3.4. Besar Sampel......................................................................
22
3.4 Instrumen dan Bahan Penelitian....................................................
22
3.4.1. Instrumen...........................................................................
22
3.4.2. Bahan Penelitian................................................................
24
3.5 Cara Penelitian...............................................................................
25
3.5.1 Perolehan Ethical Clearance.............................................
25
3.5.2 Teknik Isolasi Mesenchymal Stem Cell dari Umbilical
Cord...................................................................................
25
3.5.3 Kultur Sel...........................................................................
27
3.5.4 Proses Pemanenan Sel........................................................
27
3.5.5 Proses Penghitungan Sel....................................................
28
3.5.6 Pengambilan Serum Tikus Injury......................................
29
3.5.7 Pembuatan MSC-CM.........................................................
29
3.5.8 Pembuatan Gel MSC-CM..................................................
30
3.5.9 Pembuatan Luka Eksisi pada Tikus...................................
30
3.5.10 Pemberian Perlakuan..........................................................
30
3.5.11 Lama Perlakuan..................................................................
31
3.5.12 Proses Pengambilan Darah................................................
31
3.5.13 Pembacaan VEGF dengan ELISA.....................................
31
3.6 Tempat dan Waktu Penelitian........................................................
32
3.6.1 Tempat Penelitian..............................................................
32
 3.6.2 Waktu Penelitian................................................................
32
3.7 Pengolahan Data............................................................................
33
3.8 Analisis Data..................................................................................
33
3.9 Alur Penelitian...............................................................................
35
DAFTAR PUSTAKA.......................................................................................
36
Lampiran...........................................................................................................
39
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Terapi Mesenchymal Stem Cell (MSC) menjadi semakin penting

dalam pengobatan regeneratif. Kemampuannya dalam mensekresi berbagai

faktor tropik (sitokin, growth factor, mikro RNA, exosomes dan

microvesicles) menunjukkan kemampuannya yang menjanjikan dalam

berbagai model penyakit pada hewan coba (Schäfer et al., 2016). Namun,

hambatan terjadi pada pengaplikasian terapi MSC terhadap kasus-kasus

klinik. Kondisi ini disebabkan karena kualitas dan keterbatasan yang ada

pada MSC sehingga menyebabkan terapi yang masih belum optimal

(Schäfer et al., 2016). Berbagai pengembangan terapi MSC saat ini semakin

beragam, seperti Mesenchymal Stem Cell-Conditioned Medium (MSC-CM)

menjadi alternatif pengganti dari penggunaan terapi stem cell itu sendiri

(Madrigal et al., 2014 ;Schäfer et al., 2016). MSC-CM menghasilkan

berbagau macam faktor pertumbuhan seperti VEGF, IGF, FGF dan HGF

(Pawitan, 2014). VEGF yang berperan dalam migrasi sel endothelial dan

komponen-komponen penyembuhan luka ke area luka (Bao et al., 2009).

Namun sejauh kini, penelitian mengenai pengukuran kadar VEGF pada

jaringan luka yang diberikan MSC-CM masih sedikit diteliti.

Mekanisme seluler, humoral, dan molekuler yang dinamis memegang

peranan dalam proses penyembuhan luka. VEGF sangat penting dalam

1
 2

proses penyembuhan luka karena jika tidak distimulasi secara maksimal

akan memperpanjang proses penyembuhan luka (Reinke dan Sorg, 2012).

Penyembuhan luka yang lama menyebabkan luka kronis dimana kondisi ini

pada dasarnya akibat gangguan proses normal penyembuhan luka dimana

ditandai oleh laserasi terbuka dengan berbagai tingkat keparahan (Nuschke

2014). Luka kronis dapat mengurangi estetika dari kulit sehingga dapat

menjadi beban bagi penderitanya. Selain itu dengan keberadaan luka kronis

dapat menghabiskan biaya dalam perawatannya dan berdampak kepada

pembengkakan biaya kesehatan secara keselurahan pada suatu negara

(Murphy dan Evans, 2012).

Selama penyembuhan luka, VEGF disekresikan oleh trombosit,

makrofag, fibroblas, dan keratinosit dan memiliki efek parakrin pada sel

endotel, menginduksi proses angiogenesis luka (Borena et al., 2015). Selain

itu, VEGF juga mampu dihasilkan oleh sel MSC terutama bila distimulasi

dengan lingkungan proinflmasi sehingga mengaktifkan jalur p38-MAPK,

sehingga menghasilkan mediator-mediator untuk perbaikan jaringan selain

VEGF (Kwon, 2013). Aplikasi VEGF topikal mempercepat perbaikan luka

diabetes pada model tikus melalui peningkatan epitelisasi, angiogenesis,

deposisi jaringan granulasi dan pembentukan bekas luka yang minimal

(Borena et al., 2015). Penelitian yang dilakukan oleh Tan et al. (2014),

telah menggunakan kolagen scaffold yang ditambahkan VEGF dalam model

tikus diabetes yang dibuat luka dan menemukan bahwa perawatan

 3

menghasilkan tingkat penyembuhan yang baik, peningkatan vaskularisasi

dan peningkatan tingkat VEGF dalam jaringan granulasi.

Berdasarkan hal tersebut diatas maka diperlukan upaya penelitian

berupa pengaruh mesenchymal stem cell conditioned medium (MSC-CM)

terhadap kadar VEGF pada penyembuhan luka eksisi kulit tikus putih jantan

galur Wistar.

1.2. Rumusan Masalah

Adakah pengaruh pemberian mesenchymal stem cell conditioned

medium (MSC-CM) terhadap kadar VEGF pada penyembuhan luka eksisi

kulit tikus putih jantan galur Wistar?

1.3. Tujuan Penelitian

1.3.1 Tujuan Umum

Untuk mengetahui pengaruh pemberian mesenchymal stem cell

conditioned medium (MSC-CM) terhadap kadar VEGF pada

penyembuhan luka eksisi kulit tikus putih jantan galur Wistar.

1.3.2 Tujuan Khusus

1.3.2.1 Mengetahui kadar VEGF pada penyembuhan luka eksisi

tanpa perlakuan (kontrol),

1.3.2.2 Mengetahui kadar VEGF pada penyembuhan luka eksisi

pada kelompok perlakuan 1 dengan dosis pemberian

 4

mesenchymal stem cell conditioned medium (MSC-CM)

sebesar 25%.

1.3.2.3 Mengetahui kadar VEGF pada penyembuhan luka eksisi

pada kelompok perlakuan 2 dengan dosis pemberian

mesenchymal stem cell conditioned medium (MSC-CM)

sebesar 50%.

1.3.2.4 Mengetahui perbedaan kadar VEGF pada penyembuhan

luka eksisi antara kelompok perlakuan dan kontrol.

1.4. Manfaat Penelitian

1.4.1. Manfaat Teoritis

Sebagai sumbangan ilmu di bidang kedokteran tentang

pengaruh pemberian mesenchymal stem cell conditioned medium

(MSC-CM) terhadap kadar VEGF pada proses penyembuhan luka

eksisi.

1.4.2. Manfaat Praktis

1.4.2.1. Memberikan informasi kepada masyarakat tentang MSC-

CM terhadap penyembuhan luka eksisi.

1.4.2.2. Memberikan sumber informasi pada masyarakat

mengenai MSC-CM.

1.4.2.3. Penelitian ini diharapkan bermanfaat untuk para dokter

dalam alternatif terapi pada luka eksisi.

 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Vascular Endothelial Growth Factor ( VEGF)

2.1.1. Definisi

Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) merupakan

faktor pertumbuhan yang poten dan berfungsi dalam pengaturan

proses fisiologis dan patologis berupa angiogenesis serta

berkontribusi dalam proses patologis yang beragam, khususnya pada

perkembangan tumor (Chung dan Ferrara, 2010). VEGF merupakan

mitogen penting yang mengatur kelangsungan hidup sel endotel,

diferensiasi, angiogenesis, perekrutan sel progenitor endotel, dan lain

sebagainya (Barratt et al., 2014).

2.1.2. Sintesis dan Reseptor VEGF

VEGF dihasilkan oleh beberapa sel yang terinduksi saat

terjadinya luka. Sel tersebut antara lain seperti sel otot polos, sel

endotel, sel epidermal, sel fibroblas dan makrofag (Ucuzian et al.,

2010). VEGF juga terikat pada tiga reseptor transmembran tyrosin

kinase yang berbeda yaitu VEGFR-1 (Flt-1), VEGFR-2 (KDR) dan

VEGFR-3 yang memiliki tingkat afinitas reseptor tinggi. Tyrosin

kinase memiliki tujuh zat yang menyerupai immunoglobulin pada

ekstrasel (Johnson dan Wilgus, 2014,). KDR dan Flt-1 terletak pada

permukaan sel endotel KDR merupakan reseptor yang memediasi

5
 6

aktivitas mitogenik dan kemotaktik dari VEGF , sedangkan Flt-1

sebagai reseptor yang berfungi dalam permeabilitas pembuluh darah

(Johnson dan Wilgus, 2014).

2.2. Penyembuhan Luka

Penyembuhan luka merupakan proses yang dinamis dan melibatkan

banyak komponen kompleks dari molekul matriks ekstraseluler, mediator

inflamasi , beragam sel setempat dan leukosit yang berinfiltrasi untuk

mengembalikan kepadatan jaringan dan homeostasis. Proses penyembuhan

luka dibagi menjadi tiga fase homeostasis, meliputi fase inflamasi, fase

proliferasi dan fase remodelling (Reinke dan Sorg, 2012). Penjelasan

tahapan penyembuhan luka sebagai berikut (Reinke dan Sorg, 2012):

1. Fase Inflamasi

Fase ini dimulai pada 1-3 hari dari proses perlukaan, adalah fase

yang esensial karena di fase ini faktor pertumbuhan dan sinyal sitokin

menjalankan perannya untuk menggerakan sel dan jaringan yang

merupakan hal mendasar dalam proses penyembuhan luka. Fase

inflamasi dibagi menjadi dua yaitu :

1) Fase awal, Neutrofil mengeluarkan mediator seperti TNF-α, IL-1β,

dan IL-6 yang memperkuat respon inflamasi dan menstimulasi

VEGF dan IL-8 untuk respon perbaikan yang adekuat.

 7

2) Fase akhir, makrofag mensintesis faktor pertumbuhan seperti TGF-

β, TGF-α, FGF, PDGF, VEGF, yang membantu proliferasi sel, dan

sintesis Extra Cellular Matrix (ECM), dan migrasi fibroblas.

Gambar 2.2. Fase Inflamasi (Reinke dan Sorg, 2012)

2. Fase Proliferasi

Terjadi pada hari ke 4-21, pada fase ini yang menjadi fokus pada

proses penyembuhan luka adalah penutupan permukaan luka,

pembentukan jaringan granulasi, dan mengembalikan jaringan

vaskuler. Terdapat 3 proses utama pada fase ini yaitu migrasi dari

fibroblas, reepitelisasi, dan angiogenesis. Pada Reepitelisasi Proses

awal tingkat seluler dimulai 24-72 jam setelah luka terjadi dan diawali

oleh keratinosit lokal dari tepi luka dan sel stem epitel dari folikel

rambut dan kelenjar keringat, diaktifkan oleh jalur sinyal dari epitel
 8

dan sel non epitel tepi luka yang melepaskan sitokin dan faktor

pertumbuhan.

Gambar 2.3. Fase Proliferasi (Reinke dan Sorg, 2012)

3. Fase Remodelling

Adalah fase terakhir dari proses penyembuhan luka dimana luka

menjadi matur yang terjadi pada hari ke- 21 sampai 1 tahun. Di fase ini

kolagen tipe III digantikan oleh kolagen tipe I yang lebih kuat. Selain

itu proses angiogenesis berkurang, aliran darah menurun, dan

metabolisme akut luka semakin lambat dan akhirnya berhenti.

 9

Gambar 2.4. Fase Remodelling (Reinke dan Sorg, 2012)

2.3. Faktor- Faktor yang Mempengaruhi Penyembuhan Luka

Faktor-faktor yang mempengaruhi penyembuhan luka antara lain

(Kumar et al., 2018):

1. Infeksi merupakan penyebab terpenting yang dapat menghambat proses

penyembuhan luka. Infeksi akan memperpanjang proses inflamasi dan

berpotensi menambah luas area luka.

2. Nutrisi berperan penting pada pemulihan. Misal pada defisiensi vitamin

C menyebabkan sintesa kolagen dan menghambat proses penyembuhan

luka.

3. Glukokortikoid atau steroid memiliki efek anti inflamasi. Pemberian

steroid mengakibatkan lemahnya jaringan parut karena inhibisi TGF-β

dan pengurangan fibrosis.

 10

4. Perfusi yang buruk akibat arteriosklerosis dan diabetes atau karena

obstruksi drainase vena menghambat proses penyembuhan luka.

5. Luas dan tipe jejas jaringan dapat mempengaruhi proses penyembuhan

luka.

6. Lokasi jejas dan sifat jaringan tempat jejas berada menentukan tingkat

penyembuhan luka.

2.4. Mesenchymal Stem Cell (MSC)

2.4.1. Definisi

Mesenchymal stem cell (MSC) atau sel punca stromal

sangat sering ditemukan pada sel stroma pada sumsum tulang

belakang, periosteum, kulit dan lemak. MSC termasuk dalam

golongan stem cell yang bersifat multipotent karena dapat

berdiferensiasi menjadi sel tulang, ligamen, otot,tendon dan lemak.

MSC memiliki beberapa marker yang dapat digunakan sebagai

identifikasi ada atau tidaknya keberadaannya, marker tersebut

meliputi positif marker dengan CD70, CD90 dan CD105;

sedangkan marker negatif adalah CD34 (Lin et al., 2013)

2.4.2. Sumber

Sumber dari MSC dapat terbagi menjadi dua golongan yaitu

dari jaringan dewasa dan jaringan neonatal. Pada jaringan dewasa

antara lain: sumsum tulang, darah perifer dan jaringan lemalk.

Sedangkan pada sumber MSC dari jaringan neonatal antara lain:

 11

plasenta, umbilical cord dan umbilical cord blood (Hass et al.,

2011).

Gambar 2.5. Sumber Utama Mesenchymal Stem Cell (MSC) (Hass et al.,
2011)

2.4.3. Karakteristik

Karakteristik dari MSC adalah sebagai berikut (King et al.,

2014):

1. Sel-sel mampu menempel pada plastik,

2. Dapat membentuk koloni mirip fibroblas,

3. Mampu berdiferensiasi menjadi beberapa garis keturunan

(tulang, otot, atau adiposa tergantung pada rangsangan yang

diberikan pada percobaan in vitro)

 12

Gambar. 2.6. Tiga kriteria dari MSC (King et al., 2014)

2.5. Mesenchymal Stem Cell Conditioned Medium (MSC-CM)

Mesenchymal Stem Cell Conditioned Medium (MSC-CM) merupakan

suatu medium yang kaya akan sitokin dan berbagai molekul seperti

interleukin, faktor pertumbuhan, glikosaminoglikan dan molekul adhesi sel

yang diperoleh dari kultur MSC (Pereira et al., 2014; Ribeiro et al., 2011).

Dalam perkembangannya, berbagai rangsangan dan kondisi dapat

digunakan untuk meningkatkan dari MSC-CM, seperti (Vizoso et al., 2017):

1. Kultur sel berada dalam lingkungan hipoksia, yang meningkatkan

produksi faktor pertumbuhan dan molekul anti-inflamasi;

 13

2. Rangsangan pro-inflamasi, yang menginduksi sekresi yang lebih tinggi

dari faktor-faktor terkait imunitas;

3. Kultur pada tempat media berbentuk tiga dimensi, yang meningkatkan

produksi faktor anti-tumor dan anti-inflamasi; dan

4. Rekayasa mikropartikel.

2.6. Hubungan antara Mesenchymal Stem Cell Conditioned Medium (MSC-

CM) dengan Kadar VEGF pada Penyembuhan Luka

MSC-CM mengandung banyak faktor pertumbuhan seperti IGF-1,

TGF-β1, VEGF (Osugi et al., 2012). Keberadaan VEGF memegang peranan

penting dalam perbaikan luka kutan melalui proses angiogenesis (Wilgus,

2018). Proses angiogenesis pada penyembuhan luka distimulasi oleh

VEGF. Proses ini terdiri atas beberapa tahap meliputi Vasodilatasi,

degradasi membrane basalis, migrasi sel endotel dan proliferasi sel endotel.

Beberapa proses lain yang terjadi setelah empat tahap tersebut adalah

pembentukan pembuluh kapiler, pementukan anastomosis pembuluh darah

dan pembentukan membrana basalis baru. Waktu yang dibutuhkan untuk

VEGF meningkat selama penyembuhan luka adalah 3-7 hari (Bao et al.,

2009). Berikut ini tahapan proses penyembuhan luka yang di stimulasi oleh

VEGF (Bao et al., 2009; Johnson dan Wilgus, 2014):

 14

1. Vasodilatasi

Proses vasodilatasi diawali dengan VEGF yang berikatan

dengan resetor KDR lalu menstimulasi nitric oxide synthase (NOS) dan

prostacyclin untuk menstimulasi proses vasodilatasi bersamaan dengan

peningkatan permeabilitas pembuluh darah. VEGF juga tersusun atas

Vascular Permeability Factor (VPF) yang dalam fungsinya dapat

meningkatkan permeabilitas pembuluh darah yag lebih kuat

dibandingkan dengan histamin.

2. Degradasi membran basalis

VEGF memicu terjadinya adhesi dan agregasi platelet setelah

menginduksi factor prokoagulan dalam sel endotel. Setelah itu platelet

akan mensintesis dan melepaskan VEGF sehingga terjadi peningkatan

konsentrasi protein ini secara local yang selanjutnya mengaktivasi

kaskade koagulasi serta pembentukan thrombin dan fibrin. Aktivasi

endothel progelatinase A oleh Thrombin akan meningkatkan sekresi sel

endotel kolagenase intersisial (MMP-1) inhibitor jaringan

metalloproteinase (TIMP-1) dan gelatinase A (MMP-2). VEGF akan

merangsang sel – sel otot polos pembuluh darah untuk

mengekspresikan MMP-1 , MMP-3 dan MMP-9 hingga terciptanya

lingkungan vascular yang seimbang antara enzim promotor dan

inhibitor untuk menunjang adanya proses migrasi sel endotel. Fungsi

MMP-1 dan MMP-3 adalah mendegradasi kolagen tipe I, II, III, IV, IX

dan X sedangkan MMP-9 berfungsi dalam proses aktivasi neutrophil

 15

untuk migrasi melewati membrane basalis. Kondisi tersebut akan

menciptakan lingkungan yang proteolitik sehingga mampu

mendegradasi membrane basalis dan matriks ekstraseluler yang akan

memfasilitasi perpindahan sel endotel menuju ruang ekstravaskuler.

3. Migrasi dan Proliferasi sel endotel

Pertumbuhan pembuluh darah yang baru diperantarai oleh sel

endotel tunggal bernama tip cell. Setelah itu sel endotel akan bermigrasi

sehingga dapat bertautan dengan sel endotel dari pembuluh darah

lain.Migrasi sel endotel ini akan diperantarai VEGF secara kemotaksis.

VEGF menstimulasi beberapa mediator seperti integrin osteopontin

(OPN) dan thrombin pada proses ini. Ketika sudah terjadi migrasi maka

akan dilanjutkan dengan proses proliferasi dan elongasi untuk

pertumbuhan pembuluh darah. Proses proliferasi diawali dengan

inhibisi apoptosis sel yang berada di permukaan hidrofobik dengan

melibatkan peningkatan ekspresi dari αvβ5 integrin dan deposisi

vitronectin. Inhibisi apoptosis juga terjadi akibat inhibisi pro-apoptotic

signaling termasuk forkhead (FKHR) atau aktivasi caspase-3. Hal

tersebut kemudian akan meningkatkan replikasi dan meningkatkan

masa hidup dari sel endotel sehingga VEGF mampu meginduksi

proliferasi. Proses proliferasi dan anti apoptotic dari VEGF diperantarai

oleh MAP2K1/2/MAPK3/1 dan jalur P13K/AKTI Pembuluh darah

yang mulai tumbuh akan bergabung dengan pembuluh darah lain yang
 16

untuk tetap memfasilitasi adanya perfusi darah di jaringan dan adanya

regresi sebagian pembuluh darah yang tidak memperfusi jaringan.

Gambar 2.1 Peran VEGF (Bao et al., 2009)

 17

2.7. Kerangka Teori

Dosis mesenchymal stem cell

conditioned medium (MSC-CM)

Kadar IGF-1 Kadar VEGF TGF-β1

Jumlah Makrofag Jumlah Sel Endotel Jumlah Keratinosit

Lokasi luka

Kadar VEGF pada Ukuran luka

penyembuhan luka
eksisi Status nutrisi

Glukokortikoid

Faktor mekanik

2.8. Kerangka Konsep

Dosis mesenchymal stem cell Kadar VEGF pada

conditioned medium (MSC-CM) penyembuhan luka eksisi
 18

2.9. Hipotesis

Terdapat pengaruh mesenchymal stem cell conditioned medium

(MSC-CM) terhadap kadar VEGF pada penyembuhan luka eksisi.

 BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1. Jenis Penelitian dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan

menggunakan rancangan “post test only control group design”.

K+
P1

R P2

Keterangan:

Penelitian (R) : Perbandingan sampel penelitian

Perlakuan 1 (P1) : Pemberian MSC Conditioned Medium dengan

dosis gel 25%.

Perlakuan 2 (P2) : Pemberian MSC Conditioned Medium dengan

dosis gel 50%.

Kontrol (K) : Gel tanpa MSC Conditioned Medium

Gambar 3.1. Post test only control group design

19
 20

3.2. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

3.2.1. Variabel Penelitian

3.2.1.1. Variabel Bebas : Dosis Mesenchymal Stem Cell

Conditioned Medium

3.2.1.2. Variabel Tergantung : Kadar VEGF pada luka eksisi

3.2.2. Definisi Operasional

3.2.2.1. Dosis Mesenchymal Stem Cell Conditioned Medium

Conditioned Medium diperoleh dari hasil secretome kultur

Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cell (UB-MSC) yang

diaktivasi dengan serum tikus injury dan diinkubasi selama

48 jam. UB-MSC diisolasi dari tikus galur Wistar yang

hamil 19 hari.

Skala : Rasio

3.2.2.2. Kadar VEGF pada luka eksisi

Kadar VEGF merupakan suatu protein yang dihasilkan oleh

isolasi serum tikus luka eksisi yang sebelumnya diberikan

perlakuan gel MSC-CM dan dianalisis dengan ELISA.

Pengukuran VEGF dilakukan dengan mencampurkan

antibody monoclonal VEGF kemudian diukur dengan

menggunakan Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

(ELISA) dengan panjang gelombang 450 nm. Luka eksisi

dibuat dengan menggunakan punch biopsy dengan ukuran

diameter 8 mm.
 21

Skala: Rasio.

3.3. Populasi dan Sampel Penelitian

3.3.1. Populasi Penelitian

Populasi penelitian ini adalah tikus putih jantan galur Wistar

yang diperoleh dari Laboratorium Stem Cell and Cancer Research

Fakultas Kedokteran UNISSULA.

3.3.2. Sampel Penelitian

3.3.2.1 Kriteria Inklusi

1. Tikus putih jantan galur Wistar umur 2-3 bulan.

2. Tikus putih jantan galur Wistar yang tidak sakit.

3. Tikus putih jantan galur Wistar dengan berat badan 200-

250 gram.

3.3.2.2 Kriteria Eksklusi

1. Tikus putih jantan galur Wistar yang memiliki kelainan

anatomis.

2. Tikus putih jantan galur Wistar yang sudah pernah

digunakan untuk penelitian sebelumnya.

3.3.2.3 Kriteria Drop Out

Tikus mati selama penelitian

 22

3.3.3. Cara Pengambilan Sampel Penelitian

Pengambilan sampel pada penelitian ini dengan menggunakan

cara Randomized Sampling. Tikus putih jantan galur Wistar dibagi

menjadi 3 kelompok yaitu kelompok perlakuan 1 (P1), kelompok

perlakuan 2 (P2), dan kontrol (K).

3.3.4. Besar Sampel

Sampel minimal dihitung dengan menggunakan kriteria WHO

sebanyak 5 ekor sampel per kelompok. Pada penelitian ini digunakan

15 ekor tikus putih jantan galur Wistar dengan masing-masing 5

ekor sampel per kelompok.

3.4. Instrumen dan Bahan Penelitian

3.4.1. Instrumen

1. Micropipette with tip (blue tip, yellow tip, pink tip)

2. Pipette filler

3. Conical tube (15 ml, 50 ml)

4. Cryotube 1 ml

5. Inverted microscope

6. CO2 cylinder

7. Scissor

8. Pinset

9. Scalpel dan bisturi

10. Thermostirrer
 23

11. Sentrifuge

12. Beaker glass

13. Aluminium foil

14. Dish

15. Flask

16. Tabung CO2

17. Centrifuge

18. Imunocytochemistry

19. Biosafety Cabinet class 2

20. CO2 Incubator

21. Hotplate stirrer

22. Disposable pipet

23. Heparin tube

24. Cell counter

25. 24 well plate

26. Gunting bedah

27. Pipet kapiler

28. Sentrifuge Tube

29. Freezer

30. Sentrifuge (Sarvall MC 12 V),

31. Kapas

32. Punch Biopsy 8 mm

33. ELISA-KIT
 24

34. Timbangan digital

35. Pipet tetes

36. Mortir

37. Stemper

38. Gelas ukur

39. Penangas air,

40. Homogenizer (Ultraturax)

41. Penggaris plastik

42. Kertas label

43. Viskometer

3.4.2. Bahan Penelitian

1. Mesenchymal Stem Cell

2. NaCl 0.9%

3. FBS

4. Medium dMEM

5. Alkohol 70%

6. Fungizon 0.5%

7. Streptomisin-penicilin 1% (penstrep)

8. PBS

9. Alkohol 70%

10. VEGF ELISA kit

11. Tikus putih jantan galur Wistar

12. Pakan standart tikus

 25

13. Aquades

14. Etanol 96 %

15. HPMC Karbomer

16. PVA

17. Metil paraben

18. Propil paraben

19. Glisin

20. TEA

3.5. Cara Penelitian

3.5.1. Perolehan Ethical Clearance

3.5.2. Teknik Isolasi Mesenchymal Stem Cell dari Umbilical Cord

Seluruh proses dilakukan di dalam biosafety cabinet class 2,

menggunakan peralatan yang steril dan dikerjakan dengan teknik

sterilitas yang tinggi.

1. Umbilical cord dikumpulkan dan ditaruh dalam wadah steril

yang mengandung NaCl 0.9%

 Jika tidak diproses secara langsung, simpan pada suhu 4C

sampai proses isolasi (12-24 jam)

 Jika dilakukan isolasi segera pada saat pengambilan

umbilical cord, tidak perlu disimpan pada suhu 4C.

2. Dengan menggunakan pinset, umbilical cord diletakkan ke petri

dish, umbilical cord dicuci sampai bersih dengan PBS

 26

3. Umbilical cord dipotong dengan pisau steril menjadi 3-5 cm

4. Pembuluh darah dibuang yang ada pada potongan umbilical

5. Potongan 3-5 cm umbilical dipindahkan ke petri dish yang

bersih

6. Tiap potongan umbilical dihancurkan dengan gunting mata

tajam atau bisturi menjadi potongan-potongan kecil 1 mm

7. Dengan menggunakan pinset, hasil potongan kecil umbilical

ditempatkan pada cawan kultur jaringan 60 mm dengan susunan

titik-titik yang tersebar rata pada permukaan cawan kultur

jaringan

8. Medium komplit dibersihkan (MEM yang ditambahkan

dengan fungizon, penstrep, dan FBS) sebanyak 2-3 ml

9. Dilakukan inkubasi dalam inkubator dengan suhu 37C dan 5%

CO2

10. Setiap 24 jam diamati, untuk melihat ada sel yang keluar dari

spot penanaman explan (kira-kira 14 hari akan muncul sel dari

explan)

11. Medium diganti tiap 2-3 hari sekali dengan cara membuang

separuh medium dengan menggunakan micropipette diganti

dengan fresh medium komplit sebanyak yang dibuang

12. Setelah sel muncul dari explan, medium komplit ditambahkan

menjadi 5 ml
 27

13. Setelah 24-72 jam dari munculnya sel explan, sel yang

mengapung dipindahkan ke cawan petri jaringan yang baru

dengan cara:

14. Semua medium diambil dan masukkan ke conical tube 15 ml

15. Sentrifugasi 2000 rpm selama 10 menit

16. Supernatant dibuang

17. Dilakukan resuspensi pellet dengan medium komplit

3.5.3. Kultur sel

1. Tanam di cawan petri jaringan

2. Inkubasi 37C dan 5% CO2

3. Setengah medium diganti setiap 2-3 hari sekali sampai sel

konfluens 80%.

3.5.4. Proses Pemanenan Sel

1. Panen sel dilakukan menggunakan panen sel ketiga yang

dipindahkan ke coverslip

2. Wadah medium dibersihkan dengan menggunakan PBS 1 ml

dan tripsin 1 ml untuk memisahkan medium dengan sel

3. Inkubasi selama 3 menit pada suhu 37C

4. Memastikan sel sudah lepas dilihat di mikroskop

5. Jika sudah lepas, ambil tripsin dan PBS menggunakan

micropipette

6. Kemudian ganti dengan medium komplit

 28

3.5.5. Proses Penghitungan Sel

1. 10µl sel disiapkan dan dimasukan ke cryotube

2. triptofan blue 90µl ditambahkan ke dalam cryotube

3. 10µL ddi dipipetkan ke bilik hitung yg sudah ditutup dengan

deck glass

4. Diihat dengan menggunakan mikroskop inverted pada 4 bilik

hitung

5. Cara penghitungan:

 Hitung sel pada 4 bilik hemositometer.

 Sel yang hidup bening terang.

 Sel yang mati  biru gelap.

Gambar 3.2 Bilik Hitung

Gambar diatas menunjukan kotak pada haemocytometer yang

digunakan untuk menghitung jumlah sel. Yang digunakan adalah 4

kotak paling pojok (kiri, kanan, atas, dan bawah). Sedangkan kotak
 29

tengah tidak digunakan. Hitung jumlah sel dengan menggunakan

rumus:

∑ n 1+∑ n 2+∑ n 3+∑ n 4 X 10 4 X pengenceran

4

3.5.6. Pengambilan Serum Tikus Injury

1. Tikus dilukai dengan menggunakan punch biopsy 8 mm di

punggung dan biarkan selama 3 hari

2. Desinfeksi disekitar daerah orbita tikus yang akan diambil

darahnya

3. Darah diambil pada orbita tikus sebanyak 1 ml

4. Dimasukan ke dalam conical tube dan sentrifudge 3500 RPM

selama 10 menit

5. Serum diambil dan buat konsentrasi 50%

3.5.7. Pembuatan MSC-CM

1. MSC sebanyak 50.000 sel dimasukkan dalam 20 sumuran 24

well plate

2. Diberi medium α-MEM sebanyak 200 µl dengan suplementasi

10% FBS dan 1% penisilin-streptomisin

3. Serum tikus injury dipipet dengan konsentrasi 50% pada 5

sumuran 24 well plate yang telah berisi MSC

4. Sel diinkubasi dalam incubator CO2 selama 48 jam.

5. Selanjutnya pisahkan stem cell dengan conditioned medium

dengan disentrifuge pada kecepatan 3000 RPM.

6. Ambil supernatan.
 30

3.5.8. Pembuatan Gel MSC-CM

(Terlampir di Lampiran)

3.5.9. Pembuatan Luka Eksisi pada Tikus

1. Menyiapkan tikus.

2. Tikus dilukai dengan menggunakan punch biopsy 8 mm di

punggung kedalaman sampai bagian lapisan dermis.

3. Mengamati dan memastikan sudah adanya perlukaan pada tikus

perlakuan.

4. Membiarkan luka tanpa perlakuan selama 24 jam (Dianggap

sebagai hari ke-0)

3.5.10. Pemberian Perlakuan

Setelah 24 jam tiap kelompok mendapatkan pre perlakuan

berupa pembuatan luka eksisi selanjutnya dilanjutkan dengan

pengolesan gel pada luka pada masing-masing kelompok. Untuk

masing-masing kelompok P1, P2 dan kontrol sebagai berikut:

1. Kelompok Kontrol : Tikus setelah dilukai, luka eksisi

dibersihkan dengan aquades kemudian kemudian dioleskan gel

tanpa MSC-CM pada luka.

2. Kelompok P1 : Tikus setelah dilukai, luka eksisi dibersihkan

dengan aquades kemudian dioleskan gel MSC-CM 25% pada

luka.
 31

3. Kelompok P2 : Tikus setelah dilukai, luka eksisi dibersihkan

dengan aquades kemudian dioleskan gel MSC-CM 50% pada

luka.

4. Pemberian perlakuan dianggap sebagai hari pertama

3.5.11. Lama Perlakuan

Lama perlakuan dilakukan selama 2 hari, sesuai dengan waktu

fisiologis pada fase pembentukan protein VEGF.

3.5.12. Proses Pengambilan Darah

1. Pengambilan darah dilakukan setelah 2 hari

2. Menyiapkan conical tube 15 ml

3. Darah diambil dari mata tikus tepatnya di arteri orbitalis dengan

pipet kapiler

4. Setelah didapatkan seluruh sampel tikus (tikus perlakuan dan

kontrol) kemudian sentrifuge dengan kecepatan 2500 rpm selama

10 menit

5. Ambil supernatanya dan simpan pada sentrifuge tube

6. Simpan sampel pada freezer dengan suhu 00.

3.5.13. Pembacaan VEGF dengan ELISA

1. Menyampurkan standard dan dilusi standard menjadi

konsentrasi 300, 150, 75, 37,5 , 18,7 , dan 0 pg/ml.

2. Menyiapkan sumuran kosong, sumuran standard, dan sumuran

sampel.

3. Menambahkan cairan conjugasi 50 µl ke sumuran standard .

 32

4. Menambahkan dilusi spesial sebanyak 40 µl dan sampel 10 µl.

5. Menambahkan 50 µl horseradish peroxidase (HRP) pada tiap

lubang, lalu inkubasi 60 menit pada suhu 37º C.

6. Buang cairan dan keringkan tiap sumuran.

7. Beri cairan pencuci, aduk, dan kocok selama 30 menit ulangi

sebanyak 5 kali lalu keringkan.

8. Beri 50 µl chromogen solution A dan chromogen solution B

pada tiap sumuran. Aduk rata dan inkubasi selama 10 menit

pada suhu 37 ºC.

9. Beri larutan stopper 50 µl pada tiap sumuran

10. Baca menggunakan ELISA dengan panjang gelombang 450 nm

3.6. Tempat dan Waktu Penelitian

3.6.1. Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan di laboratorium Stem Cell & Cancer

Research FK Unissula (SCCR)

3.6.2. Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan pada bulan Agustus 2018.

 33

3.7. Pengolahan Data

Pengolahan data pada penelitian ini melalui empat tahap, yaitu:

3.7.1. Editing

Setelah data terkumpul, pada tahap ini dilakukan pengecekan

kembali data-data yang didapatkan.

3.7.2. Coding

Memberikan kode atau merubah kata menjadi angka pada data yang

sudah di edit agar mempermudah memasukkan data.

3.7.3. Processing

Memperoses data yang akan dianalisis dengan cara memasukkan

data ke komputer.

3.7.4. Cleaning

Pada tahap terakhir mengecek kembali data-data yang sudah

dimasukkan agar terhindar dari kesalahan.

3.8. Analisis Data

Data yang dihasilkan diolah secara komputerisasi. Semua data

dilakukan uji deskriptif terlebih dahulu untuk mengetahui nilai mean dan

standar deviasi. Selanjutnya dilakukan uji normalitas menggunakan

Saphiro-Wilk test dan uji homogenitas menggunakan Levene test sebagai

syarat uji parametrik. Bila didapatkan sebaran data normal dan homogen,

maka dilanjutkan uji one-way Anova dan dilanjutkan uji Post Hoc untuk

membandingkan antar kelompok perlakuan. Bila didapatkan distribusi data

 34

tidak normal dilakukan transformasi data. Bilamana masih tidak normal,

maka dilakukan uji beda non parametrik kemudian menggunakan uji

Kruskal Walls dan dilanjutkan uji Mann-Whitney untuk membandingkan

antar kelompok perlakuan. Pengolahan analisis data dilakukan dengan

menggunakan SPSS 20.0 for Windows.

 35

3.9. Alur Penelitian

Umbilical Cord
Tikus dilukai dengan diameter 8 mm

3 hari
Isolasi
Ambil darah 2 ml

Media

Sentrifudge 3500 RPM selama 10 menit

Kultur

Ambil serum Formulasi Gel

MSC
Inkubasi 48 jam
MSC Conditioned Medium
Tikus putih jantan galur Wistar 15 ekor

Randomisasi & adaptasi selama 3 hari Perlakuan 1, Dosis Perlakuan 2, Dosis

MSC-CM 25% MSC-CM 50%

Dibagi menjadi 3 kelompok

Kelompok Kontrol (K) Kelompok perlakuan 1 (P1) Kelompok perlakuan 2 (P2)

5 ekor tikus 5 ekor tikus 5 ekor tikus

Luka eksisi diameter 8 mm

Dibiarkan tanpa perlakuan selama 1 hari dan diberi pakan standar

K + Pengolesan Gel tanpa MSC-CM P1 + Pengolesan gel MSC-CM Dosis 25% P2 + Pengolesan gel MSC-CM Dosis 50%

Dibiarkan sampai hari ke-3 dan diberi pakan standar

Pengambilan darah melalui sinus orbita

Sentrifuge, pengambilan serum dan ELISA

Pengolahan dan analisa data

Gambar 3.3. Alur Penelitian

 DAFTAR PUSTAKA

Anief M., 2007, Ilmu Meracik Obat, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta.

Bao P., Kodra A., Tomic-Canic M.,  Golinko M.S., Ehrlich H.P., Brem H., 2009,
The role of vascular endothelial growth factor in wound healing, J Surg Res.
153(2): 347–358.

Barratt S., Medford A.R., Millar A.B., 2014, Vascular endothelial growth factor in
acute lung injury and acute respiratory distress syndrome, Respiration.
87(4):329-42.

Borena B.M., Martens A., Broeckx S.Y., Meyer E., Chiersg K., Duchateau L.,
Spaas J.H., 2015, Regenerative skin wound healing in mammals: state-of-
the-art on growth factor and stem cell based treatments, Cell Physiol
Biochem 36:1-23.

Chung A.S., Ferrara N., 2010, Developmental and pathological

angiogenesis, Annual Review of Cell and Developmental Biology.

Hass R., Kasper C., Böhm S., Jacobs R., 2011, Different populations and sources
of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and
neonatal tissue-derived MSC, Cell Commun Signal 9:12.

Johnson K.E., Wilgus T., 2014, Vascular endhotelial growth factor and
angiogenesis in the reulation of wound healing, comprehensive invited
review, Journal of Wound Healing Society.

King A., Balaji S., Keswani S.G., Crombleholme T.M., 2014, The Role of Stem
Cells in Wound Angiogenesis, Adv. In Wound Care 3(10): 614-625

Kwon, Y.W., Heo S.C., Jeong G.O., Yoon J.W., Mo W.M., Lee M.J., Jang I.H.,
Kwon S.M., Lee J.S., Kim J.H., 2013. Tumor necrosis factor-α-activated
mesenchymal stem cells promote endothelial progenitor cell homing and
angiogenesis, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of
Disease, 1832(12).

Lin C.S.,  Xin Z.C., Dai J., Lue T.F., 2013, Commonly used mesenchymal stem
cell markers and tracking labels: limitations and challenges, Histol
Histopathol 28(9): 1109–1116.

Madrigal M., Rao K.S., Riordan N.H., 2014, A review of therapeutic effects of
mesenchymal stem cell secretions and induction of secretory modification

36
 37

by different culture methods, Journal of Translational Medicine 2014,

12:260.
Murphy P.S., Evans G.R.D., 2012, Advances in wound healing: A review of
current wound healing products, Plast Surg Int. 2012: 190436.

Nuschke A., 2014, Activity of mesenchymal stem cells in therapies for chronic
skin wound healing, Organogenesis 10:1, 29-37.

Osugi M., Katagiri W., Yoshimi R., Inukai T., Hibi H., Ueda M., 2012,
Conditioned media from mesenchymal stem cells enhanced bone
regeneration in rat calvarial bone defects, Tissue Eng Part A. 18(13-
14):1479-89.

Pawitan J.A., 2014, Prospect of Stem Cell Conditioned Medium in Regenerative

Medicine, BioMed Research International (2014).

Pereira T., Ivanova G., Caseiro A.R., Barbosa P., Bártolo P.J., Santos J.D., Luís
A.L., Maurício A.C., 2014, MSCs conditioned media and umbilical cord
blood plasma metabolomics and composition, PLoS One 9(11):e113769.

Reinke J.M., Sorg H, 2012, Wound Repair and Regeneration, European Surgical
Research, Department of Plastic, Hand and Reconstructive Surgery,
Hannover Medical School, Hannover, Germany, p. 38 – 40.

Ribeiro C.A., Salgado A.J., Fraga J.S., Silva N.A., Reis R.L., Sousa N., 2011, The
secretome of bone marrow mesenchymal stem cells-conditioned media
varies with time and drives a distinct effect on mature neurons and glial
cells (primary cultures), J Tissue Eng Regen Med. 5(8):668-72.

Schäfer R., Spohn G., Patrick C. Baer P.C., 2016, Mesenchymal Stem/Stromal
Cells in Regenerative Medicine: Can Preconditioning Strategies Improve
Therapeutic Efficacy?, Transfus Med Hemother 43:256–267.

Tan Q., Chen B., Yan X., Lin Y., Xiao Z., Hou X., Dai J., 2014, Promotion of
diabetic wound healing by collagen scaffold with collagen-binding vascular
endothelial growth factor in a diabetic rat model, J Tissue Eng Regen Med
8:195-201.

Ucuzian A.A., Gassman A.A., East A.T., Greisler H.P., 2010, Molecular
mediators of angiogenesis, J Burn Care Res. 31(1): 158.

Vizoso F.J., Eiro N., Cid S., Schneider J., Perez-Fernandez R., 2017,
Mesenchymal stem cell secretome: toward cell-free therapeutic strategies in
regenerative medicine, Int J Mol Sci. 18(9): 1852.
 38

Wilgus T.A., 2018, Vascular Endothelial Growth Factor and Cutaneous Scarring
in Advances in Wound Care Ahead of Print, Mary Ann Liebert, Inc.
 39

Lampiran. Cara Kerja Pembuatan Formulasi Gel (Arief, 2007)

Panaskan air

Wadah 1 Wadah 2 Wadah 3

PVA HPMC Glisin, TEA, metil

Larutakan dengan air Larutakan dengan air paraben dan propil
panas secukupnya di panas secukupnya di paraben dilebur di
atas pemangas air atas pemangas air atas penangas air
sambil di aduk sambil di aduk

Campur wadah 3 ke wadah 2 aduk sampai homogen

Campuran dari wadah 2 dan 3 dicampur dengan

campuran wadah 1, aduk sampai homogen

Masukkan ke dalam wadah

Keterangan:

1. Pembuatan sediaan gel dilakukan dengan cara melarutkan basis gel (HPMC

atau karbomer) dan PVA dengan air panas 70oC aduk terus menerus hingga

membentuk homogen.

2. Pengadukan dilakukan dengan gerakan konstan yaitu 4200 rpm.

3. Ditunggu hingga basis membentuk massa gel (tahap 1).

4. Larutkan TEA, metil paraben, propil paraben dengan glisin hingga homogen.

Perlahan ditambahkan MSC-CM sesuai konsentrasi (25% dan 50%), aduk

hingga homogen (tahap 2).