BAB IV

HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Penelitian

Penelitian tentang pengaruh mesenchymal stem cell conditioned

medium (MSC-CM) terinduksi serum inflamasi dosis rendah terhadap kadar

VEGF pada penyembuhan luka ini telah dilakukan di Laboratorium Stem Cell

& Cancer Research (SSCR) FK Unissula Semarang. Subjek penelitian MSC-

CM yang diperoleh dari secretome cairan kultur berasal dari Umbilical Cord

Mesenchymal Stem cell (UB-MSC) diaktivasi dengan serum inflamasi tikus

cedera dan diinkubasi selama 48 jam. Subjek penelitian lainnya yaitu 15 ekor

tikus putih wistar yang dibuat model luka eksisi . Tikus diadaptasi selama 3

hari terlebih dahulu, selanjutnya dibagi menjadi 3 kelompok secara random:

kelompok kontrol (K), kelompok perlakuan I (P1) dan perlakuan 2 (P2).

Tikus dibuat model luka eksisi dengan diameter 8 mm, luka eksisi tersebut

dibiarkan seharian tanpa perlakuan, tikus hanya diberi pakan dan minum

standar. Hari berikutnya pada kelompok K dilakukan pengolesan gel tanpa

MSC-CM terinduksi serum inflamasi dosis rendah, sedangkan pada P1 dioles

dengan gel MSC-CM terinduksi serum inflamasi dosis rendah dosis 25% dan

pada P2 dioles gel MSC-CM terinduksi serum inflamasi dosis rendah dosis

50%.

Pengolesan gel dilakukan sampai hari ke-6, kadar VEGF dilakukan

pada hari ke-3 dan hari ke-6. Kadar VEGF diukur dengan mencampurkan

antibody monoclonal VEGF kemudian diukur dengan menggunakan Enzyme-

Linked Immunosorbent Assay (ELISA) dengan panjang gelombang 450 nm.

Hasil pengukuran kadar VEGF tersebut dapat dilihat pada Gambar 4.1.

120.00 108.43 112.95

103.92
96.39
100.00

78.31
80.00 75.30
Kadar VEGF (pg/ml)

k
60.00
p1
p2
40.00

20.00

0.00
hari3 hari6

Gambar 4.1. Grafik rerata kadar VEGF penyembuhan luka hari ke-3 dan ke-6

Pada hari ke-3 maupun hari ke-6, rerata kadar VEGF di kelompok P2

adalah yang tertinggi baik di hari (108,43 ± 4,45 dan 112,80 ± 1,92 pg/ml),

diikuti oleh kelompok P1 (78,20 ± 0,84 dan 104,00 ± 2,24 pg/ml) dan yang

terendah ditunjukkan kelompok K (75,20 ± 0,84 dan 96,40 ± 2,70 pg/ml).

Rerata kadar VEGF hari ke-6 pada ketiga kelompok tampak lebih tinggi

daripada rerata kadar VEGF hari ke-3.

Hasil analisis normalitas sebaran data dengan uji shapiro wilk

menghasilkan data kadar VEGF penyembuhan luka pada hari ke-3 dan ke-6

di ketiga kelompok semua terdistribusi normal (p>0,05) (Tabel 4.1).

Tabel 4.1 Hasil analisis normalitas kadar VEGF penyembuhan luka

Kelompo p-value
k Hari ke-3 Hari ke-6
K 0,314* 0,166*
P1 0,314* 1,000*
P2 0,777* 0,928*
Keterangan:* = p > 0,05 (distribusi data normal)

Analisis homogenitas varian dengan uji Levene menunjukkan varian

data kadar VEGF penyembuhan luka di ketiga kelompok pada hari ke-3 tidak

homogen (p=0,024), sedangkan pada hari ke-6 homogen (p=0,415) (Tabel

4.2).

Tabel 4.2 Hasil analisis homogenitas varian kadar VEGF penyembuhan luka
Hari p-value
Ke-3 0,024
Ke-6 0,415*
Keterangan:* = p > 0,05 (varian data homogen)

Perbedaan rerata kadar VEGF pada penyembuhan luka selanjutnya

dianalisis kebermaknaannya dengan uji one way anova, sebagaimana

ditunjukkan pada Tabel 4.3.

Tabel 4.3 Hasil uji hipotesis one way anova

Hari p-value
Ke-3 0,000*
Ke-6 0,000*
Keterangan:* = p < 0,05 (perbedaan bermakna)

Berdasarkan Tabel 4.3 dapat diketahui bahwa rerata kadar VEGF pada

penyembuhan luka di hari ke-3 dan hari ke-6 pada ketiga kelompok

menunjukkan perbedaan bermakna (p<0,05).

 Perbedaan rerata kadar VEGF penyembuhan luka pada hari ke-3

dianalisis lebih lanjut dengan uji post hoc Tamhane, sedangkan pada hari ke-6

dianalisis dengan uji post hoc LSD untuk mengetahui perbedaan kadar VEGF

penyembuhan luka antar dua kelompok. Hasil uji post hoc hari ke-3 dan hari

ke-6 ditunjukkan pada Tabel 4.4.

Tabel 4.4. Perbedaan rerata kadar VEGF penyembuhan luka antar

kelompok.
Hari Kelompo Kelompo Mean
p-value
k (I) k (J) difference (I-J)
Ke-3 K P1 -3,00 0,001*
K P2 -33,20 0,000*
P1 P2 -30,20 0,000*
Ke-6 K P1 -7,60 0,004*
K P2 -16,40 0,000*
P1 P2 -8,80 0,001*
Keterangan:* = p < 0,05 (perbedaan bermakna)

Hasil uji post hoc Tamhane pada hari ke-3 menunjukkan terdapat

perbedaan rerata kadar VEGF yang bermakna antara kelompok K dengan

kelompok P1 dan P2 (p<0,05), dan juga terdapat perbedaan rerata kadar

VEGF yang bermakna antara P1 dan P2 (p<0,05). Hasil uji post hoc LSD

pada hari ke-6 juga menunjukkan terdapat perbedaan rerata kadar VEGF yang

bermakna antara kelompok K dengan kelompok P1 dan P2 (p<0,05), terdapat

perbedaan rerata kadar VEGF yang bermakna antara P1 dan P2 (p<0,05).

Hasil pada Tabel 4.4 menunjukkan bahwa pemberian MSC-CM

terinduksi serum inflamasi dosis rendah berpengaruh terhadap kadar VEGF

penyembuhan luka pada tikus Wistar model luka eksisi baik pada hari ke-3

maupun hari ke-6. Peningkatan kadar VEGF menunjukkan pola dose

dependent.
4.2. Pembahasan

Pemberian gel MSC-CM terinduksi serum inflamasi dosis rendah dalam

penelitian ini berpengaruh terhadap kadar VEGF pada tikus Wistar model

luka eksisi. Kadar VEGF pada kelompok tikus yang diberi gel MSC-CM

terinduksi serum inflamasi lebih tinggi daripada tikus di kelompok kontrol.

Gel MSC-CM terinduksi serum inflamasi dosis rendah berpengaruh

meningkatkan kadar VEGF pada proses penyembuhan luka. Hasil penelitian

yang serupa juga ditunjukkan oleh Wu et al. (2007) bahwa terjadi

peningkatan VEGF pada terapi pemberian MSC-CM pada penyembuhan

luka. Lee et al. (2016) juga melaporkan bahwa MSC berperan dalam

peningkatan VEGF, migrasi fibroblasrt, serta ekspresi matriks ekstraseluler

seperti kolagen tipe III, fibronektin, dan elastin. Ridawati dan Nasihun (2016)

juga melaporkan bahwa MSC dapat meningkatkan presentasi kolagen tipe I

dan III, IL1 (interleukin-1), IL-6 (interleukin-6), IL-10 (interleukin-10),

Tumor Necrosis Factor α (TNF-α), VEGF.

Induksi serum inflamasi dosis rendah pada MSC-CM dalam penelitian

ini ditujukan untuk membantu mengaktivasi stem cell karena dalam serum

inflamasi tersebut terkandung mediator inflamasi seperti IL-1, IL-6, TNF-α,

dan TNF-β yang berfungsi mengaktifkan stem cel (Bryant and Nix, 2007).

MSC-CM sendiri juga mengandung berbagai faktor pertumbuhan, termasuk

di dalamnya adalah VEGF (Pangkahila and Aman, 2018). Induksi serum

inflamasi membantu mengaktivasi faktor parakrin dari MSC-CM dalam

perbaikan jaringan. Faktor parakrin tersebut akan mensekresikan faktor

pertumbuhan, salah satunya yaitu VEGF (Yew et al., 2011). Pensinyalan

parakrin dari MSC-CM juga memberikan sifat antiscarring melalui sekresi

VEGF dan faktor pertumbuhan hepatosit (HGF) dan menjaga keseimbangan

yang tepat antara TGF-β1 dan TGF-β3 (Maxson et al., 2012).

Penyembuhan luka terdiri dari beberapa tahapan. Pada fase inflamasi

yang terjadi sekitar 1-3 hari, MSC berperan dalam regulasi inflamasi,

menekan TNF, meregulasi produksi IL-10 dan IL-1 serta memblok proliferasi

sel T. Pada fase proliferasi yang berlangsung selama sekitar 2 minggu sejak

fase inflamasi, MSC berperan pada produksi faktor-faktor pertumbuhan

seperti VEGF, HGF dan VEGF, serta merekrut keratinosit, fibroblas dermal

dan stem cell host. Pada fase remodelling yang berlangsung hingga lebih dari

2 tahun, MSC berperan dalam produksi TGF-3 dan KGF, meregulasi

MMP/TIMP dan meregulasi deposisi kolagen (Maxson et al., 2012).

Penelitian ini dilakukan selama 6 hari sehingga, perbedaan rerata kadar

VEGF yang telah tampak pada hari ke-3 menunjukkan peran MSC-CM dalam

percepatan fase proliferasi dalam proses penyembuhan luka. Fase proliferasi

tersebut masih berlanjut hingga hari ke-6.

Perbedaan dosis aplikasi gel MSC-CM dalam penelitian ini

menghasilkan perbedaan kadar VEGF penyembuhan luka. Dosis yang lebih

tinggi (50%) dianggap lebih efektif/optimal dalam meningkatkan kadar

VEGF pada proses penyembuhan luka eksisi dibandingkan dengan dosis

25%. Pada dosis yang lebih tinggi, MSC-CM terinduksi serum inflamasi

dosis rendah juga mengandung kadar faktor pertumbuhan yang lebih besar.
Kandungan faktor pertumbuhan tersebut membantu meningkatkan efek

parakrin dari MSC-CM sehingga kadar VEGF yang diperoleh juga lebih

tinggi. Penelitian sebelumnya melaporkan bahwa VEGF dianggap sebagai

faktor penting dalam MSC-CM, dan MSC-CM diusulkan untuk menjadi agen

terapeutik yang memadai untuk regenerasi tulang dengan angiogenesis

(Katagiri et al., 2017).

Penelitian ini berhasil membuktikan pengaruh MSC-CM terinduksi

serum inflamasi dosis rendah terhadap kadar VEGF pada penyembuhan luka.

Sebelum uji preklinis ini digeneralisasikan secara klinis masih ada beberapa

keterbatasan yang perlu diteliti lebih lanjut. VEGF merupakan faktor

pertumbuhan yang memediasi proses angiogenesis, penelitian ini perlu

ditindaklanjuti dengan efek pemberian gel MSC-CM terinduksi serum

inflamasi dosis rendah terhadap jumlah pembuluh darah pada penyembuhan

luka. Angiogenesis merupakan langkah penting dalam penyembuhan luka,

karena pembentukan pembuluh darah baru dapat memastikan pengiriman

nutrisi dan oksigen yang berkaitan dengan kelangsungan hidup sel (Yang et

al., 2016). Penelitian Boomsma dan Geenen (2012) melaporkan bahwa MSC

mensintesis dan mensekresikan beberapa faktor parakrin seperti VEGF yang

mampu mempengaruhi migrasi MSC, mempromosikan angiogenesis dan

mengurangi apoptosis. Efek pemberian gel MSC-CM terinduksi serum

inflamasi dosis rendah terhadap migrasi MSC dan apoptosis sel pada proses

penyembuhan luka juga perlu dilakukan.

 Pada proses penyembuhan luka, penelitian sebelumnya yang dilakukan

oleh Padeta et al. (2017) menyebutkan bahwa MSC-CM mampu

mempromosikan pemulihan luka bakar kulit pada tikus putih, seperti yang

ditunjukkan oleh: akselerasi penutupan luka, jumlah fibroblas yang lebih

banyak, kepadatan serat kolagen yang tinggi dan jumlah pembuluh darah

yang lebih banyak pada kelompok MSC-CM dibandingkan dengan kelompok

kontrol. Pemulihan luka bakar tersebut disebabkan karena jumlah sel

imunoreaktif bFGF meningkat secara signifikan selama proses pemulihan

pada kelompok MSC-CM dibandingkan dengan kelompok kontrol, dan

disarankan bahwa bFGF memainkan peran penting pada regenerasi jaringan

kulit yang diobati dengan MSC-CM. Kadar bFGF dalam penelitian ini juga

perlu diteliti karena faktor pertumbuhan tersebut juga disekresi oleh MSC-

CM yang terinduksi serum inflamasi dosis rendah, dan sinergisitas antara

bFGF dengan VEGF terhadap penyembuhan luka eksisi juga perlu diteliti.

Penelitian Losi et al. (2013) melaporkan bahwa rekombinan VEGF dan bFGF

dapat merangsang proliferasi sel dan mempercepat penyembuhan ulkus kulit

diabetik yang umumnya sulit sembuh secara spontan karena berkurangnya

tingkat dan aktivitas faktor pertumbuhan endogen.

 BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa:

5.1.1 Terdapat pengaruh pemberian MSC-CM terinduksi serum inflamasi

dosis rendah terhadap kadar VEGF pada penyembuhan luka eksisi

kulit tikus putih jantan galur Wistar.

5.1.2 Terdapat pengaruh pemberian MSC-CM terinduksi serum inflamasi

dosis rendah dengan dosis MSC-CM 25% terhadap kadar VEGF

dibanding dengan kontrol.

5.1.3 Terdapat pengaruh pemberian MSC-CM terinduksi serum inflamasi

dosis rendah dengan dosis MSC-CM 50% terhadap kadar VEGF

dibanding dengan kontrol.

5.1.4 Terdapat perbedaan pengaruh perbandingan dosis MSC-CM

terinduksi serum inflamasi dosis rendah antara 25% dan 50% terhadap

kadar VEGF.

5.2. Saran

Saran yang dapat peneliti ajukan terkait dengan keterbatasan penelitian

ini adalah:

5.2.1 Meneliti pengaruh pemberian MSC-CM terinduksi serum inflamasi

terhadap jumlah pembuluh darah pada penyembuhan luka eksisi kulit

tikus putih jantan galur Wistar.

.
5.2.2 Meneliti pengaruh pemberian MSC-CM terinduksi serum inflamasi

terhadap migrasi MSC dan apoptosis sel pada proses penyembuhan

luka eksisi kulit tikus putih jantan galur Wistar.

5.2.3 Meneliti pengaruh pemberian MSC-CM terinduksi serum inflamasi

terhadap kadar bFGF pada penyembuhan luka eksisi kulit tikus putih

jantan galur Wistar.

5.2.4 Meneliti pengaruh pemberian rekombinan VEGF dan bFGG dari

MSC-CM terinduksi serum inflamasi terhadap proliferasi sel dan

percepatan penyembuhan luka eksisi kulit tikus putih jantan galur

Wistar.
Tambahan Pustaka:

Boomsma, R.A., Geenen, D.L. 2012. Mesenchymal Stem Cells Secrete Multiple
Cytokines That Promote Angiogenesis and Have Contrasting Effects on
Chemotaxis and Apoptosis. PLoS ONE 7(4): e35685.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0035685 .

Katagiri, W., Kawai, T., Osugi, M., Sugimura-Wakayama, Y., Sakaguchi, K.,
Kojima, T., & Kobayashi, T. 2017. Angiogenesis in newly regenerated
bone by secretomes of human mesenchymal stem cells. Maxillofacial
plastic and reconstructive surgery, 39(1), 8. doi:10.1186/s40902-017-
0106-4.

Losi, P., Briganti, E., Errico, C., Lisella, A., Sanguinetti, E., Chiellini, F., Soldani,

G. 2013. Fibrin-based scaffold incorporating VEGF- and bFGF-loaded
nanoparticles stimulates wound healing in diabetic mice. Acta Biomater.;
9(8):7814-21. doi: 10.1016/j.actbio.2013.04.019. Epub 2013 Apr 17.

Maxson, S., Lopez, E. A., Yoo, D., Danilkovitch-Miagkova, A., & Leroux, M. A.
2012. Concise review: role of mesenchymal stem cells in wound
repair.Stem cells translational medicine, 1(2), 142-9.

Padeta, I., Nugroho, W.S., Kusindarta, D.L., Fibrianto, Y.H. dan Budipitojo, T.
2017. Mesenchymal Stem Cell-conditioned Medium Promote the
Recovery of Skin Burn Wound. Asian Journal of Animal and Veterinary
Advances, 12: 132-141.

Yang, J., Nie, S., Liu, L., Yu, Y., Chain, J., Liu, X., Yin, H., Hu, Q. 2016. Human
umbilical cord mesenchymal stem cells pretreated with angiotensin-II
facilitates angiogenesis by improving the function of endothelial cells. Int
J Clin Exp Pathol; 9(5):5056-5066.
Lampiran 1. Data penelitian kadar VEGF

Kelompok Hari 3 Hari 6

K 1 75 99
2 74 93
3 76 98
4 75 94
5 76 98
P1 1 79 107
2 77 103
3 78 105
4 79 101
5 78 104
P2 1 110 115
2 107 110
3 115 112
4 103 113
5 107 114
Lampiran 2. Hasil analisis statistik deskriptif kadar VEGF

Descriptives

95% Confidence Interval

for Mean

Std. Std. Lower Upper Minimu Maximu

N Mean Deviation Error Bound Bound m m

hari3 K 5 75.2000 .83666 .37417 74.1611 76.2389 74.00 76.00

P1 5 78.2000 .83666 .37417 77.1611 79.2389 77.00 79.00

P2 1.0840E
5 4.44972 1.98997 102.8749 113.9251 103.00 115.00
2

Total 15 87.2667 15.71381 4.05729 78.5646 95.9687 74.00 115.00

hari6 K 5 96.4000 2.70185 1.20830 93.0452 99.7548 93.00 99.00

P1 1.0400E
5 2.23607 1.00000 101.2236 106.7764 101.00 107.00
2

P2 1.1280E
5 1.92354 .86023 110.4116 115.1884 110.00 115.00
2

Total 1.0440E
15 7.25849 1.87413 100.3804 108.4196 93.00 115.00
2
Lampiran 3. Hasil Uji Normalitas Data Kadar VEGF

Case Processing Summary

Cases

Valid Missing Total

kelompok N Percent N Percent N Percent

Kadar VEGF K 5 100.0% 0 0.0% 5 100.0%

hari ke-3 P1 5 100.0% 0 0.0% 5 100.0%

P2 5 100.0% 0 0.0% 5 100.0%

Kadar VEGF K 5 100.0% 0 0.0% 5 100.0%
hari ke-6 P1 5 100.0% 0 0.0% 5 100.0%

P2 5 100.0% 0 0.0% 5 100.0%

Tests of Normality

Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk

kelompok Statistic df Sig. Statistic df Sig.

Kadar VEGF hari K .231 5 .200* .881 5 .314

ke-3 P1 .231 5 .200* .881 5 .314

P2 .223 5 .200* .956 5 .777

Kadar VEGF hari K .323 5 .096 .840 5 .166
ke-6 P1 .127 5 .200* .999 5 1.000

P2 .141 5 .200 *
.979 5 .928

*. This is a lower bound of the true significance.

a. Lilliefors Significance Correction
Lampiran 4. Hasil Uji Homogenitas Varian Kadar VEGF

Test of Homogeneity of Variance

Levene
Statistic df1 df2 Sig.

Kadar VEGF hari ke- Based on Mean 5.180 2 12 .024

3 Based on Median 2.483 2 12 .125

Based on Median and

2.483 2 4.442 .189
with adjusted df

Based on trimmed mean 5.034 2 12 .026

Kadar VEGF hari ke- Based on Mean .947 2 12 .415
6 Based on Median .163 2 12 .852

Based on Median and

.163 2 8.409 .852
with adjusted df

Based on trimmed mean .916 2 12 .426

Lampiran 5. Hasil Uji One Way Anova Perbedaan Kadar VEGF Hari ke-3
dan Hari ke-6

Oneway

ANOVA

Sum of Mean
Squares df Square F Sig.

Kadar VEGF hari Between

3372.133 2 1686.067 238.594 .000
ke-3 Groups

Within Groups 84.800 12 7.067

Total 3456.933 14
Kadar VEGF hari Between
673.600 2 336.800 63.150 .000
ke-6 Groups

Within Groups 64.000 12 5.333

Total 737.600 14
Lampiran 6. Hasil Uji Post Hoc Tamhane Perbedaan Kadar VEGF Antar
Dua Kelompok Hari ke-3 dan Uji Post Hoc LSD Hari ke-6

Post Hoc Tests

Multiple Comparisons
Dependent Variable: Kadar VEGF hari ke-3
Tamhane

Mean 95% Confidence Interval

Difference (I-
(I) kelompok (J) kelompok J) Std. Error Sig. Lower Bound Upper Bound

K P1 -3.000 *
.529 .001 -4.59 -1.41

P2 -33.200* 2.025 .000 -40.88 -25.52

P1 K 3.000 *
.529 .001 1.41 4.59
P2 -30.200 *
2.025 .000 -37.88 -22.52
P2 K 33.200* 2.025 .000 25.52 40.88

P1 30.200* 2.025 .000 22.52 37.88

*. The mean difference is significant at the 0.05 level.

Post Hoc Tests

Multiple Comparisons
Dependent Variable: Kadar VEGF hari ke-6
Tamhane

Mean 95% Confidence Interval

Difference (I-
(I) kelompok (J) kelompok J) Std. Error Sig. Lower Bound Upper Bound

K P1 -7.600* 1.568 .004 -12.35 -2.85

P2 -16.400* 1.483 .000 -20.98 -11.82

P1 K 7.600 *
1.568 .004 2.85 12.35
P2 -8.800* 1.319 .001 -12.79 -4.81
P2 K 16.400* 1.483 .000 11.82 20.98

P1 8.800 *
1.319 .001 4.81 12.79

*. The mean difference is significant at the 0.05 level.