Irvan Ramadhani 240210100012 VI.

PEMBAHASAN

Analasis kuantitatif mikrobiologi pada bahan pangan penting dilakukan untuk mengetahui mutu bahan pangan dan menghitung proses pengawetan yang akan diterapkan pada bahan pangan tersebut. Analisis kuantitatif mikroorganisme pada bahan pangan terdiri dari (1) metode hitungan cawan; (2) Most Probable Number (MPN); (3) hitungan mikroskopis langsung dan (4) Metode turbidimetri (kekeruhan) menggunakan spektrofotometer.(Fardiaz,1992). Tujuannya untuk mengetahui mutu bahan pangan yang akan diterapkan pada bahan pangan tersebut. Pada praktikum kali ini metode perhitungan mikroorganisme pada bahan pangan yang digunakan hanyalah metode Petroff Hauser dan Most Probable Number (MPN). Sample yang digunakan untuk metode Petroff Hauser adalah Lactobacillus bulgaricus. Sedangkan sampel yang digunakan pada metode MPN adalah Mr. Juice, The kita, Jus ABC Jambu, dan Teh gelas. 6.1 Metode Petroff Hauser Petroff Hauser adalah perhitungan yang dihitung secara langsung dan dilakukan secara mikroskopis yaitu dengan menghitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang sangat kecil. Jumlah cairan yang terdapat antara coverglass dan alat ini mempunyai volume tertentu sehingga satuan isi yang terdapat dalam satu bujur sangkar juga tertentu. Alat yang digunakan adalah Petroff-Hauser Chamber atau Haemocytometer (Safitri, 2009). Ruang hitung terdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm. Satu kotak besar di tengah, dibagi menjadi 25 kotak sedang dengan panjang 0,2 mm. Satu kotak sedang dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil. Dengan demikian satu kotak besar tersebut berisi 400 kotak kecil. Tebal dari ruang hitung ini adalah 0,1 mm. Sel bakteri yang tersuspensi akan memenuhi volume ruang hitung tersebut sehingga jumlah bakteri per satuan volume dapat diketahui (Safitri, 2009).

Irvan Ramadhani 240210100012

Gambar 6.1.1 Ukuran kotak pada haemocytometer (Setiawan, 2010) Menurut setiawan (2010), cara kerja Petroff-Hauser Counting Chamber (menggunakan kotak sedang) adalah sebagai berikut : 1. Bersihkan Petroff-Hauser Counting Chamber atau Haemocytometer dengan alkohol 70 % lalu keringkan dengan tisu. 2. Letakkan gelas penutup di atas alat hitung. 3. Tambahkan 50 l suspensi sel mikroba (kira-kira 1 tetes) dengan cara meneteskan pada parit kaca (sample introduction point) pada alat hitung. Suspensi sel akan menyebar karena daya kapilaritas. Pastikan bahwa ruangan penuh terisi dengan suspensi, ditambah beberapa kelebihan dalam saluran di sampingnya. 4. Biarkan sejenak sehingga sel diam di tempat (tidak terkena aliran air dari efek kapilaritas).

Irvan Ramadhani 240210100012 5. Letakkan alat hitung pada meja benda kemudian cari fokusnya pada perbesaran 40 x10. 6. Lakukan perhitungan secara kasar apakah diperlukan pengenceran atau tidak. Jika dalam satu kotak sedang terdapat sel-sel yang banyak dan bertumpuk maka perhitungan akan tidak akurat. Jika demikian, maka diperlukan pengenceran. 7. Hitung sampel, paling tidak sebanyak 5 kotak sedang (lebih banyak lebih baik). Hasil perhitungan dirata-rata kemudian hasil rataan dimasukkan rumus untuk kotak sedang. Jika dilakukan pengenceran maka jumlah sel/ml dikalikan faktor pengenceran. Tabel 6.1.1 Jumlah bakteri dengan Petroff Hauser Bentuk Bakteri Jumlah Bakteri/kotak Jumlah Bakteri/ml 2,4 x 0,25.106 = 6.106 sel/ml

(Sumber: Dok. Pribadi, 2011) Menghitung jumlah bakteri menggunakan metode Petroff Hauser diperlukan sebuah rumus. Berikut ini adalah cara penghitungannya: Luas kotak sedang = = = panjang x lebar 0,2 x 0,2 0,04 mm2

Volume kotak sedang = = =

luas x kedalaman 0,04 mm2 x 0,1 mm 0,004 mm3

Irvan Ramadhani 240210100012 Karena 1 ml = 1cm3, maka : = = = 0,004 mm3 0,000004 cm3 4x10-6 ml

Jadi, rumus menghitung jumlah sel/ml dalam kotak sedang adalah : = = = = jumlah sel/4x10-6 ml (jumlah sel/4) x 106 jumlah sel x () x 106 jumlah sel x 0,25 x 106

Berdasarkan hasil perhitungan dan hasil yang didapat pada tabel 6.1.1, jumlah bakteri yang dihitung dengan metode petroff hauser adalah 2,4 x 0,25.106 = 6.106
sel

/ml. Hitungan dengan metode Petroff-Hauser cepat dan murah, tetapi mempunyai

beberapa kelemahan sebagai berikut : 1. Sel-sel yang telah mati tidak dapat dibedakan dari sel-sel hidup. Oleh karena itu, kedua sel tersebut akan terhitung. 2. Sel-sel yang berukuran sangat kecil sukar dilihat di bawah mikroskop, sehingga kadang-kadang tidak terhitung. 3. Untuk mempertinggi ketelitian, jumlah sel di dalam suspensi harus cukup tinggi, misalnya untuk bakteri minimal 106sel/ml. hal ini disebabkan dalam setiap bidang pandang yang diamati harus terdapat sejumlah sel yang dapat dihitung. 4. Tidak dapat digunakan untuk menghitung sel jasad renik di dalam bahan pangan yang banayk mengandung debris atau ekstrak makanan, karena hal ini akan mengganggu dalam perhitungan sel. (Fardiaz S, 1992)

Irvan Ramadhani 240210100012 6.2 Most Probable Number (MPN) MPN adalah suatu metode enumerasi mikroorganisme yang menggunakan data dari hasil pertumbuhan mikroorganisme pada medium cair spesifik dalam seri tabung yang ditanam dari sampel padat atau cair yang ditanam berdasarkan jumlah sampel atau diencerkan menurut tingkat seri tabungnya sehingga dihasilkan kisaran jumlah mikroorganisme yang diuji dalam nilai MPN/satuan volume atau massa sampel (Indra, 2011). Metode perhitungan MPN menggunakan media cair di dalam tabung reaksi yang berisi tabung durham, dimana perhitungan dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang positif yaitu yang ditumbuhi oleh jasad renik setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengematan tabung yang positif dapat dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan atau terbentuknya gas didalam tabung durham yang diletakkan pada posisi terbalik, yaitu untuk jasad renik pembentuk gas, sehingga tabung durham tersebut naik keatas. Keuntungan dari metoda ini adalah : 1. Dapat dibuat sangat peka dengan penggunaan volume inokulum contoh yang lebih besar dari 1,0 ml/tabung 2. Bahan-bahan dapat dipersiapkan untuk tugas lapangan 3. Media pertumbuhan selektif dapat digunakan untuk menghitung jenis mikroorganisme yang diharapkan di antara jenis-jenis lainnya yang ada dalam bahan pangan tersebut Kerugiannya adalah dibutuhkannya banyak ulangan untuk diperoleh hasil yang teliti dan sehubungan dengan hal tersebut banyak biaya dan waktu yang dibutuhkan untuk persiapannya. Metoda ini banyak digunakan untuk menghitung bakteri patogenik dalam jumlah sedikit yang terdapat dalam bahan pangan (Buckle dkk, 1985). Metoda MPN pada prinsipnya adalah metoda penentuan tingkat pencemaran mikroorganisme pada air minum dan air permukaan yang umum dilakukan pada saat ini dengan teknik filter untuk penentuan bakteri coliform dan fekal coli (coli tinja). Karena sifatnya lebih cepat dan lebih reprodusibel, metoda ini lebih unggul bila

Irvan Ramadhani 240210100012 dibandingkan dengan metoda MPN. Kelemahannya pada metode membran filter terletak pada kepekaannya terhadap gangguan yang disebabkan oleh kekeruhan air. Kekeruhan air yang disebabkan oleh partikel partikel zat organik yang tinggi dapat mengganggu pertumbuhan mikroorganisme. Selain itu hasil analisa dapat pula terganggu apabila dalam sampel terdapat zat beracun atau bakteri jenis lainnya dalam jumlahnya besar (Safitri, 2009). Prosedur yang dilakukan untuk melakukan metode ini, pertama dimasukkan Nutrient Broth pada setiap tabung reaksi. Nutrient Broth yang digunakan pada praktikum kali ini adalah NBSS(Nutrient Broth Single Strength) dan NBDS(Nutrient Broth Double Strength). Perbedaan konsentrasi yang dibuat menyebabkan NBDS lebih pekat dibanding NBSS, NBDS dibuat dengan dua kali konsentrasi seharusnya sehingga nutrisi yang terkandung dalam NBDS akan lebih banyak dan memberi kondisi yang baik bagi mikroorganisme untuk tumbuh (Suriawiria, 1985). Jumlah total tabung reaksi yang digunakan untuk setiap sampel adalah 9 buah, 3 buah tabung reaksi ukuran besar, dan 6 buah tabung reaksi kecil. Tabung reaksi besar diisi oleh NBDS dengan sampel 10ml sedangkan pada tabung reaksi kecil diisi oleh NBSS sebenyak 1 ml sampel. Setelah semua tabung terisi oleh sampel,dilakukan inkubasi selama 2 hari dalam suhu 30-32oC.

Gambar 6.2.1 Pemberian sampel metode MPN seri 3 tabung (Sumber : ekmon-saurus.blogspot.com)

Irvan Ramadhani 240210100012 Tabel 6.2.1 Perhitungan Mikroorganisme dengan Metode MPN Kel. Sampel Pengamatan Seri A Seri B Seri C (10 ml) (1 ml) (0,1 ml) Warna tidak Warna keruh. berubah Warna tidak Terdapat (kuning berubah endapan bening). (kuning IA Mr. Juice Berwarna Terdapat bening). orange. endapan. Tidak terdapat Berwarna endapan orange. 3 3 3 IIA Teh kita Warna Warna Warna kekuningan kekuningan kekuningan (+) (+++) agak (++) agak agak kecoklatan. kecoklatan. kecoklatan Sedikit bening. Sedikit bening. Sedikit bening. Ada keruhan Ada keruhan Ada keruhan (+++). (++). (o) 3 3 3 Fase 1: Kuning. Warna keruh. Warna bening. Jus ABC Fase 2: Terdapat Sedikit IIIA Jambu Orange. endapan endapan. Terdapat kemerahan. endapan. 1 0 1 Warna putih Warna putih Warna coklat keruh. keruh Keruh (++) IVA Teh Keruh (+). keruh (++). Bergelembung gelas Bergelembung Bergelembung (+) (+). (+). 1 3 3 (Sumber: Dok. Pribadi, 2011)

Nilai MPN

24 x

= 24 x 102

24 x

= 24 x 102

29

Dari hasil praktikum yang telah dilakukan terhadap sampel didapatkan hasil bahwa hampir semua sampel mengalami perubahan warna, terdapat endapan serta bergelembung. Menurut Suriawiria (1985), Kekeruhan yang terdapat pada tabung reaksi disebabkan karena adanya aktivitas dari suatu mikroorganisme. Kekeruhan yang terjadi pada tabung-tabung reaksi tersebut berbeda, ada yang mengalami kekeruhan

Irvan Ramadhani 240210100012 pada bagian permukaannya saja dan juga ada yang mengalami kekeruhan merata pada seluruh media dan sampel. Kekeruhan yang terjadi merata pada media disebabkan karena adanya mikroorganisme anaerob fakultatif, yaitu mikroorganisme yang mampu hidup ataupun tumbuh dengan atau tanpa adanya oksigen. Kekeruhan yang terjadi pada permukaannya saja disebabkan karena adanya mikroorganisme aerob. Menurut Fardiaz (1992), Gelembung udara yang dihasilkan pada tabung durham disebabkan oleh adanya aktivitas yang respirasi mikroorganisme, sehingga dapat dilihat hasil dari respirasi mikroorganisme tersebut berupa gelembung gas. Perhitungan nilai MPN dimulai setelah diketahui nilai MPN nya, perhitungan dilakukan dengan rumus sebagai berikut :

Mr. Juice Mr. Juice menghasilkan kombinasi angka 3 3 3 dan nilai yang didapat dari tabel MPN adalah 24 sehingga nilai MPN yang didapat adalah:

Teh kita Sama seperti Mr. Juice, Teh kita menghasilkan kombinasi angka 3 3 3 dan nilai yang didapat dari tabel MPN adalah 24 sehingga nilai MPN yang didapat adalah:

Jus ABC Jambu Jus ABC Jambu menghasilkan kombinasi angka 1 0 1 dan nilai yang didapat dari tabel MPN adalah 7 sehingga nilai MPN 7 pula. Hal ini dikarenakan dalam tabel kombinasi 1 0 1 tidak perlu dikalikan dengan pengenceran tabung tengah.

Irvan Ramadhani 240210100012 Teh gelas Teh gelas menghasilkan kombinasi angka 1 3 3 dan nilai yang didapat dari tabel MPN adalah 29 sehingga nilai MPN 29 pula. Hal ini dikarenakan dalam tabel kombinasi 1 0 1 tidak perlu dikalikan dengan pengenceran tabung tengah.

Irvan Ramadhani 240210100012 VII. KESIMPULAN

Dari pelaksanaan kegiatan praktikum analisis kuantitatif mikroorganisme pada bahan pangan ini, dapat disimpulkan beberapa hal: 1. Analisis kuantitatif sangat penting untuk standar keamanan suatu bahan pangan. 2. Cara yang dapat dilakukan dalam analisis kuantitatif mikroorganisme yaitu metode MPN dan Metode Petroff-Hausser 3. Semakin tinggi pengenceran maka pertumbuhan jumlah koloni harus semakin rendah dari pada pengenceran sebelumnya. 4. Gelembung udara yang dihasilkan pada tabung durham disebabkan oleh adanya aktivitas yang respirasi mikroorganisme, sehingga dapat dilihat hasil dari respirasi mikroorganisme tersebut berupa gelembung gas 5. Kekeruhan yang terdapat pada tabung reaksi juga disebabkan karena adanya aktivitas dari suatu mikroorganisme.

Irvan Ramadhani 240210100012 DAFTAR PUSTAKA

Buckle, K.A., R.A Edwards, G.H. Fleet,dan M.Woottoon. 1985. Ilmu Pangan. Penerjemah : Hari Purnomo dan Adiono. Penerbit Universitas Indonesia (UIPress), Jakarta. Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan . PT. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta. Indra, E. 2011. Metode MPN ( Most Probable Number) atau APM (Angka Paling Mungkin) Bagian 1. http://ekmon-saurus.blogspot.com (diakses tanggal 22 Maret 2011) Safitri, R dkk. 2009. Buku Penuntun Praktikum Mikrobiologi Dasar. Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas Padjadjaran, Jatinangor. Setiawan, I. 2010. Penghitungan Jumlah Bakteri Secara Langsung Menggunakan Haemocytometer. http://blog.unila.ac.id/wasetiawan (diakses tanggal 22 Maret 2011) Suriawiria, U. 1985. Pengantar Mikrobiologi Umum. Angkasa, Bandung.