Teknik-teknik Pemeriksaan

dan Interpretasi Hasil

dr. Yudha Nurhantari, Ph.D.
Bagian Ilmu Kedokteran Kehakiman
Fakultas Kedokteran UGM Yogyakarta
2005

ATG C
TAC G

Ekstraksi DNA

Sumber DNA : darah, tissue, cultured cell

Lysis buffer + proteinase K
Inkubasi 37 0C semalam
Phenol-chloroform precipitation

transfer
DNA sol
PhenolSampel+lysis Chlorf.
buffer
Phenol-chlorofom
centrifuge

DNA
protein

Ethanol
Garam
centrifuge

1. Polymerase Chain Reaction (PCR)

Adalah suatu cara amplifikasi/penggandaan
suatu segmen DNA tertentu.
PCR mesin : alat termocycle, otomatis
berubah suhunya dalam siklus tertentu.
Bahan :
-1 pasang primer (Forward&Reverse):
18-30 basa, 50-60% GC

 d-NTP mix : dATP,dCTP,dGTP,dTTP

PCR buffer : Mg,pH aktivitas enzyme,
primer-template specificity
H20
Taq polymerase
DNA template

Repeated 25-30 x
a.DNA template

1. Separate/denature

3. Extension : 72 C

b.
Reverse primer
c. Enzyme
Taq polymerase

2. Annealing
t C

DNA template

Purity of DNA template

Jumlah DNA
Hindarkan kontaminasi DNA lain
Shorter fragment amplify more efficient
than longer fragment

Primers
Specific hybridization to the template:
- controlled by ionic strength of the buffer (K)
- Mg++ concentration bind to dNTPs
- annealing temperature
20-25 bases long, 50% G-C 52-580 C
Designing primers :S&E software, etc
Melting temperature = 4x(#G+#C)+2(#A+#T)
Annealing temp. 3-50 C below melting temp.

Agarose gel electrophoresis

Cek DNA hasil isolasi
Cek hasil PCR
Cek hasil restriction enzyme
M

1X TAE buffer
DC power suplay
Loading buffer
Pewarnaan Etbr
Visualisasi :UV
light

Interpretasi hasil electrophoresis

1. Tidak ada band/pita
- PCR gagal perbaiki teknik
suhu annealing, naikkan jumlah DNA
- Hasil negatif : segmen DNA yang ingin
kita
amplifikasi tidak ada.
2. Terdapat band/pita
- expected size : result konfirmasi dengan
sequencing, restriction enzyme mapping,

2. - non-expected size : nonspecific amplf.:

primer-dimer, recombinasi antara 2
PCR produk yang berbeda cycles
mutasi gen

marker

200bp
100bp

180-bp

2. Sequencing
Pembacaan urutan nuleotide/basa pada
segmen DNA tertentu.
Alat : Sequencing machine
Methode dideoxy
DNA disintesa dari dioxynucleotide
triphosphate (dNTP)
Tiap nucleotida baru ditambahkan pada
group 3-OH nucleotide terakhir

 Dideoxy method : sintetik nucleotide yang

tidak punya gugus 3-OH, tetapi 3-H
tidak terjadi elongasi
chain termination method
Procedure
- prepare single strand DNA
- dNTP (dATP,dCTP,dGTP,dTTP)
- ddNTP (ddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTP)
- DNA polymerase 1

 Separation from the longest fragment to the

shortest fragment
Each of ddNTP (ddATP, ddCTP,
ddGTP,ddTTP) fluoresces different color

 Pembacaan :
- tentukan urutan basa primernya
(Forward/Reverse)
- cocokkan antara hasil dengan standar
urutan (gen bank)
- warna : merah (T), biru(C), hijau (A),
hitam (G)

P- P- P

C 5

Thymine

C 4

dATP

ddATP

dTTP

ddTTP

dCTP

ddCTP

dGTP

ddGTP

OH

dTTP
Deoxythymidine triphosphate

ddTTP
Dideoxythymidine triphosphate

Primer

3. Western Blot :
- Deteksi suatu protein
- transfer dari gel ke membran
- antibody terhadap protein
- Hasil : berupa band/pita
-tidak ada pita : antibody/staining lemah
hasil negatif : protein (-)
- terdapat pita : expected size : hasil
non- expected size : nonspecific protein