REACTIVE OXYGEN SPECIES

(ROS),
ASTAXANTHIN, &
ENZYME
LINKED IMMUNE
oleh :
Mutiara Nabilla Jusuf
SORBENT
ASSAY
(131620150005)
ANTI AGING & AESTHETIC MEDICINE
UNIVERSITAS PADJAJARAN
2015

REACTIVE OXYGEN
SPECIES

Reactive Oxygen Species

(ROS)

Molekul reaktif >> & radikal bebas yg mengandung molekul oksigen hasil
sampingan dari metabolism aerobic selama proses :
Transport electron mitokondria pada pernapasan aerobik
reaksi
yang merugikan,
Oksidoreduktase enzim & oksidasi logam katalis
merusak jaringan
Katakteristik :
Umur pendek
Tidak stabil
Harus bereaksi dgn molekul lain stabil
Peran ganda : senyawa yg bermanfaat dan merugikan (toksik)
Konsentrasi rendah dan sedang :
Apoptosis
Ekspresi gen
Aktivasi sel sinyal kaskade
Konsentrasi tinggi : menyebabkan stress oksidatif

Tipe ROS

PEMBENTUKAN ROS
Sumber

Enzimatik dan non-enzimatik

Endogen : aktivasi sel imun,

inflamasi, stres mental, aktivitas yang
berlebihan, iskemia, infeksi, kanker dan
penuaan.

Rx enzimatik : reaksi rantai

pernafasan, fagositosis, sintesis
prostaglandin dan sistem enzim sitokrom
P-450.

Eksogen : Polusi air dan udara, rokok,

alcohol, logam berat (Cd, Hg, Pb, Fe,
As), obat-obat tertentu (cyclosporine,
tacrolimus, gentamycin, bleomycin),
pelarut industri, masak (daging asap,
minyak, lemak) dan radiasi

Rx non-enzimatik : reaksi antara

oksigen dengan senyawa organik yang
diinisiasi oleh radiasi ionisasi, dan juga
terjadi selama fosforilasi oksidatif
(respirasi aerobik) pada mitokondria

KEUNTUNGAN &
Proses maturasi struktur sel
KERUGIAN
Senjata (sistem pertahanan tubuh) c/ : fagosit

(neutrophil,makrofag, monosit) menghasilkan radikal bebas

u/ membunuh MO patogen
Peran fisiologis dalam beberapa sistem signaling intra
& inter sel c/ : NO mrpkn pembawa pesan interselluler
u/memodulasi aliran darah & aktivitas sel saraf
Induksi respon mitogenik.

Stress oksidatif ketidakseimbangan antara

pembentukan dan netralisasi ROS
Lipid : merusak rantai lipid permeabilitas membran
tidak stabil
Protein : modifikasi AA, inaktivasi enzim, proteolisis
DNA : merusak untai DNA, menghilangkan nukleotida,
modifikasi basa mutasi DNA

ROS vs ANTIOKSIDAN

PROSES PADA MULTI

ORGAN

STRESS OKSIDATIF
kondisi saat produksi Reactive Oxygen Spesies
(ROS) >>
sistem pertahanan antioksidan
dalam tubuh untuk mengatasinya
Pengukuran : (tidak langsung) mengukur
biomarker yang dibentuk dari reaksi radikal
bebas dengan target biomakromolekulernya
(protein, lipid, DNA)

ASTAXANTHIN

 3,3-dihydro-, -carotene-4, 4-diodine

adalah pigmen merah, termasuk grup pigmen
karotenoid alami
Aktivitas biologis : antioksidan poten (500x Vit E
& 6000x Vit C memiliki gugus radikal yang
mampu melindungi tubuh terhadap proses
peroksidasi lipid & kerusakan yang diakibatkan
oleh proses oksidasi pada membran sel &
jaringan tubuh
Sumber : natural atau sintetik

KERJA ASTAXANTHIN

KERANGKA PEMIKIRAN

Slide Title

ENZYME LINKED IMMUNE

SORBENT ASSAY (ELISA)

Pertama kali : (imunologi) mengetahui adanya interaksi Ag & Ab dalam

sampel, ditandai dengan enzim berkembang :
Kualitatif : keberadaan Ab atau Ag dengan menggunakan Ab atau
Ag spesifik
Kuantitatif : mengukur kadar Ab atau Ag menggunakan
spektofotometer

Tes yg mengidentifikasi perubahan warna

Min. 1 Ab Ag spesifik particular

KOMPONEN ELISA
Antibodi
: fraksi serum IgG
Enzime
: Horse Radish Peroxidase (HRP) MW 44, 000, glycoprotein
dgn residu 4 lysine
Substrate : TMB (3,3',5,5', tetramethylbenzidine) enzim sbg katalis
oksidasi substrat hydrogen peroksida warna biru rx berhenti : warna
kuning (acid)

PRINSIP ELISA
1. Fase Coating
2. Fase Rx Ag & Ab
3. Fase Reaksi Kimiawi

Dasar :
menggunakan enzim deteksi ikatan Ab & Ag mengubah
warna krom warna (spektofotometer) adanya ikatan Ag & Ab

PRINSIP ELISA

KEUNTUNGAN &
KERUGIAN

Relatif sederhana
Relatif ekonomis
Hasil : tingkat sensitivitas yang cukup tinggi.
Dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen
walaupun kadar antigen tersebut sangat rendah (hal ini
disebabkan sifat interaksi antara antibodi atau antigen yang
bersifat sangat spesifik)
Dapat digunakan dalam banyak macam pengujian.

Ab : hanya jenis Ab monoklonal (Ab yang hanya

mengenali 1 Ag)
False - / + : akibat kontrol negatif yang menunjukkan
respons positif yang disebabkan inefektivitas dari larutan
blocking Ab sekunder atau Ag asing dapat berinteraksi
dengan Ab bertaut enzim signal menimbulkan signal.
Rx antara enzim signal & substrat berlangsung relatif
cepat pembacaan harus dilakukan dengan cepat

ALAT & BAHAN

Utama microtiter
Papan plastik dengan cekungan sebanyak 96 buah (8
cekungan ke arah bawah dan 12 cekungan ke samping)
Bahan plistirena
t =1 cm & d = 0,7 cm.

ALAT & BAHAN

Ag yang dimurnikan (jika
sampel yang akan dideteksi
atau dikuantifikasikan berupa
antibodi)
Larutan standard (kontrol
positif dan negatif)
Sampel yang ingin dites
Cairan pencuci (buffer)
Ab atau Ag yang berikatan
dengan enzim signal
Substrat yang bersifat
spesifik terhadap enzim signal
ELISA reader
(spektrofotometer) untuk
pengukuran kuantitatif
Stop solution

METODE ELISA

INDIRECT ELISA

DIRECT ELISA

SANDWICH ELISA

COMPETETIVE ELISA

NON -COMPETETIVE
ELISA

DIRECT ELISA
Paling sederhana

Seringkali digunakan u/ mendeteksi & mengukur

konsentrasi Ag

KEUNTUNGAN &
Metodologi yang cepat karena hanya
KERUGIAN

menggunakan 1 jenis Ab
Kemungkinan terjadinya kegagalan dalam
uji ELISA akibat reaksi silang dengan Ab lain
(antibody sekunder) diminimalisasi.

Immunoreaktifitas Ab kemungkinan akan berkurang akibat

bertaut dengan enzim
Penautan enzim signal ke setiap Ab menghabiskan waktu & mahal
Tidak memiliki fleksibilitas dalam pemilihan tautan enzim (label)
dari antibodi pada percobaan yang berbeda
Amplifikasi signal hanya sedikit
Larutan yang mengandung antigen yang diinginkan harus
dimurnikan sebelum digunakan untuk uji ELISA direct.

INDIRECT ELISA
-dideteksi & diukur konsentrasinya : Ab

KEUNTUNGAN &
Ab sekunder terjual secara komersial di pasar
KERUGIAN
ImmunoreaktifitasAb yang diinginkan (target) tidak
terpengaruh o/ penautan enzim signal ke Ab
sekunder karena penautan dilakukan pada wadah
berbeda
Tingkat sensitivitas meningkat karena setiap Ab yg
diinginkan memiliki beberapa epitop yang bisa
berinteraksi dengan Ab sekunder.

Relatif lebih lama membutuhkan 2x

waktu inkubasi (Interaksi Ag spesifik & Ab
yang dinginkan, Abyang diinginkan & Ab
sekunder tertaut enzim signal

SANDWICH ELISA
Prinsip kerja dari ELISA sandwich = ELISA direct
Perbedaan : (ELISA sandwich) larutan Ag yang diinginkan
tidak perlu dipurifikasi
Ag harus dapat berinteraksi dengan Ab primer spesifik
tertaut enzim signal ELISA sandwich hususkan Ag
memiliki minimal 2 sisi antigenic (sisi interaksi dengan
antibodi) atau Ag yang bersifat multivalent (polisakarida
atau protein).
Ab primer
Ab sekunder

: sebagai Ab penangkap
: Ab deteksi.

FINAL PLATE
ELISA

ELISA READER

COMPETITIVE ELISA
Permukaan padat dilapisi
antibody
Masukan unlabeled antigen &
labeled antigen

Unlabeled and labeled antigen terdete

Formasi berwarna hasil oxidation

substrat

TERIMA KASIH