TEKNIK PEMERIKSAAN

LABORATORIUM
- IMUNOLOGY Kuliah Imunologi 13
9,10, 13 Desember 2013

LABORATORY AUTOMATION SYSTEM (LAS)

Sample Manager

LIS, Central Link,

Line Master

Chemistry
Chemistry

Immunolo
gy
Immunolo
gy

Hematolo
gy
Urinalysis

PRINSIP YANG DIGUNAKAN

UNTUK ALAT DIAGNOSTIK
Antigen

dan antibodi yang sesuai

dapat berinteraksi dan membentuk
ikatan non-kovalen yang reversibel
menjadi suatu kompleks.

Reaksi primer:
Antibodi direaksikan langsung dengan antigen
dan kompleks ini diukur dengan visualisasi
sebagai presipitat, pengukuran
dengan menentukan derajat absorpsi atau
penghamburan cahaya atau mengukur
besarnya radioaktivitas yang terikat pada
reagen antigen atau antibodi.

Reaksi sekunder:
Komponen lain diaktifkan atau diubah, atau
partikel-partikel yang lembam (latek atau sel darah
merah) diaglutinasikan.

Cara Pemeriksaan Imunologik

Aglutinasi
Uji Hambatan Aglutinasi
Immunochromatograf
Imuno-enzym
Nefelometri

(EIA / ELISA)

Radio Imuno Assay

Imunofloresensi
CMIA (Chemilluminescent

immuno assay)

ECL (electrochemilluminescent
immuno assay)

Reaksi pangikatan
Uji Netralisasi
Presipitasi

komplemen

di dalam gel

Immunoblot
Flow cytometry
Nucleic Acid
Technique
PCR
Sequensing
Microarray

Immuno-detection
Antibody-based

methods allowing

the specifc:
Detection
Quantification
Localisation

of antigens by means of antibody

binding

Structure of an antibody

Aglutinasi
Prinsip:

Sel darah dan bakteri digumpalkan oleh

anti serum yang mengikat Ag-Ab pada permukaan
partikel tsb.

Pemeriksaan:

Golongan darah
Deteksi kenaikan titer antibodi terhadap virus
atau bakteri setelah terjadi infeksi ; contoh:
salmonella typhii

Uji

Coombs
Partikel lateks yang telah diselubungi oleh
imunoglobulin digunakan untuk mendeteksi
antiglobulin rematoid

Blood type

Uji Hambatan Aglutinasi

Pemanfaatan:

Pregnancy test mendeteksi hormon

gonadotropin (HCG) dalam urine
Penetapan Fibrinogen degradation product
(FDP)
Tes Kehamilan
Prinsip: Anti-HCG akan bereaksi dengan HCG
dari urin

Hal yang perlu diperhatikan :

1.
2.

3.

Urin yang diperiksa urin pagi (HCG)

Adanya proteinuria, hematuria,
glukosuria
dapat menggangu
pengujian
Urin OS minum pil KB positif palsu

Immuno-chromatography

POCT
(Point of care
testing)
Rapid test
Sensitive & Spesific
E.g:
- Anti-HIV
- Anti-Dengue IgG/Ig

http://www.nature.com/nrmicro/journal/v4/n9_supp/fig_tab/nrmicro1525_F6.html

Teknik Imuno-enzim
EIA (Enzyme Immunoassay)
ELISA (Enzyme linked Immunosorbent Assay)
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.

Penempelan antibodi/ antigen pada permukaan microplate

well coated with antibody
Dimasukkan standard, control & sampel
Inkubasi optimasi ikatan antigen & antibodi (kompleks)
Pencucian protein/zat yang tidak terikat washing with
buffer
Dimasukkan antibodi berlabel enzim (antibodi
konjugat)
Inkubasi optimasi ikatan kompleks dgn antibodi konjugat
Kompleks (Ab-Ag-Ab*) dideteksi dengan penambahan
substrat enzim warna
Stop solution menghentikan reaksi warna
Ukur warna dengan metode spektrofotometer ELISA
reader

ELISA

Prosedur Kerja
Microplate pre-coated with
mouse monoclonal Ab specific for
human IL-1

Add standard, control and sample

Incubate 1,5 hrs

Aspirate and wash (buffer)

E
Add IL-1 conjugate (monoclonal
Ab against IL conjugated to
enzyme horseradish peroxidase)

IL-1
Anti IL-1

Anti IL-1
conjugat
ed
enzyme

Add substrate (chromogen

tetramethylbenzidine) to each
well, incubate for 20 min room
temparature (protect from light)

P
S

Add STOP solution (2 N Sulfuric

acid) to each well

Read at 450 nm and correction

540 nm
IL-1
Anti IL-1
P Product (color)

Anti IL-1
conjugat
ed
enzyme
Substrate

Standard color & Standard curve

Standard
0 ng/mL

Standard
50 ng/mL

Standard
6,25 ng/mL

Standard
100 ng/mL

Standard
12,5 ng/mL

Standard
200 ng/mL

Standard
25 ng/mL

Sample
OD
49,8 ng/mL
CONCENTRATION

Commercial production of antibodies:

polyclonal vs monoclonal

Host animals ca be used to raise

antibodies against a given antigen

Selected clones from a polyclonal

each recognizing a single epitope
can be fused to a tumor cell
(hybridoma) to proliferate
indefinitely

Nefelometri
Prinsip:

perubahan sifat antigen dan

antibodi yang dapat menghamburkan
cahaya jika antigen dan antibodi tersebut
bergabung membentuk suatu kompleks.
Sumber cahaya: laser helium-neon
Cepat , mudah

Radioimmunoassay
Antigen

atau antibodi diberi label dengan isotop

radioaktif ( I131)
Antigen atau antibodi yang berlabel diberikan
secara berlebihan pada sampel Ab/Ag,
radioaktivitas pada kompleks antigen-antibodi
diukur dgn gama counter.
Digunakan: molekul kecil (hormon steroid dan
peptida obat-obatan seperti digoksin atau morfin)
untuk autoantibodi (anti-DNA), antigen hepatitis B,
Ig E dan prostaglandin

Imunoflorensi
Kompleks

antigen-antibodi dilihat dengan sinar

Ungu ultra.
Digunakan: untuk mendeteksi antigen atau
antibodi pada irisan jaringan.
Antigen dan antibodi diberi label dengan
fluorokrom
Tipe ada :
Langsung
Tidak langsung (metode sandwich)

Chemiluminescent
Emisi cahaya
(luminescence), karena
reaksi kimia
Keuntungan:
Sensitivitas
Linearitaslebih baik

Interferensi pada pemeriksaan

Immunoassay
Spesimen

Pengambilan darah, tabung sampel, hemolisis

& Hiperbilirubinemia, Lipemia
Matrix effect
Saliva, Serum, Plasma, Amnion, dll
Reagent effect
Buffer, Polyclonal antibody, Monoclonal
antibody, Immunoassay label
Pengaruh protein lain
Albumin, Rheumatoid factor

Flowcytometry
Identifikasi

otomatis
(FACS)

sel dengan menggunakan instrumen

flowcytometer dan cell sorter

FACS Flourescent-Activated Cell Sorting:

alat pengukur jumlah sel dan fluoresensi dari
suspensi partikel, bila sel tersebut melewati
penyinaran laser atau sumber cahaya lainnya.
Alat

ini dapat mengidentifikasi setiap jenis dan

aktivitas sel dan menghitung jumlah masingmasing dalam suatu populasi campuran.

Flowcytometry
Prinsip:

identifkasi karakteristik permukaan

setiap sel dengan kemampuan memisahkan
sel-sel yang berada dalam suatu suspensi
menurut karakteristik masing-masing secara
otomatis melalui suatu celah yg ditembus oleh
seberkas sinar laser.
Setiap sel yg melewati berkas sinar laser
menimbulkan sinyal elektronik yg dicatat oleh
instrumen sebagai karakteristik sel yang
bersangkutan.

Aplikasi FACS:
1.

2.

3.
4.
5.

Analisis pemisahan sub-populasi limfosit

dengan menggunakan antibodi monoklonal
terhadap antigen permukaan (CD) yang dilabel
dengan zat warna fluorokrom
Pemisahan limfosit yang memproduksi berbagai
kelas imunoglobulin dengan menggunakan
antibodi monoklonal terhadap kelas dan subkelas
Ig spesifk dan tipe L-chain
Memisahkan sel hidup dan sel mati
Analisis kinetik atau siklus sel dan kandungan
DNA atau RNA
Analisis fungsi atau aktivitas sel dengan
mengukur produk yang disintesis oleh sel setelah
distimulasi.

Normal

Mutasi

Clinical need

Predict cancer

Pharmacogenomic

Paternity

Identification and
Quantitation

SNP and Mutation

Sequencing and
typing

Use of Nucleic Acid Amplifcation

Immune-based Detection
Probe-based
detection

Array-based
Detection

Heterogeneous Nucleic Acid

Amplifcation
Assay
Size-based
Discrimination

Homogenous
Assay
Sequencing

Electrochemical Detection

Elucidation
Detection

Probe based Detection

Match

Not match

Light

No Light

PCR (Polymerase Chain Reaction)

Suatu

cara sederhana dan cepat untuk membuat multiple

copies atau memperbanyak sekuen DNA spesifk
yang diinginkan dengan cara meniru replikasi DNA in vivo.
Diperlukan templete DNA untai tunggal (ss-DNA)
Templete DNA untaian tunggal dapat diperoleh dengan
cara denaturasi ds-DNA yang menguraikan ds-DNA
menjadi ss-DNA
Perlu 2 primer oligonukleotida yang komplementer
terhadap sekuen yang mengapit (terletak pada kedua
ujung) fragmen DNA spesifik yg akan di copy.

PCR (Polymerase Chain Reaction)

Primer

inilah yg menentukan segmen mana yg ak

mengalami siklus berulang-ulang agar
jumlahnya berlipat ganda.

Primer

yg terdiri atas untaian tunggal DNA akan

bergabung dengan untaian tunggal DNA
template, dan sintesis DNA, akan dibantu enzim
polimerase.

PCR (Polymerase Chain Reaction)

Reaksi PCR terdiri dari 3 tahapan :

1. Denaturasi ds DNA pada suhu 92-96 oC
2. Annealing (penggabungan)primer pada situs
komplementer DNA templete pada suhu 4572oC
3. Pemanjangan (Extension) primer mulai 3 OH.

Proses denaturasi, annealing dan extension yg

berlangsung dalam waktu yg ditentukan
dinamakan satu siklus
Setelah 30 siklus jumlah DNA sasaran menjadi
berlipat ganda, bahkan hingga satu juta kali,
sehingga dalam suatu campuran hanya sekuen
inilah yg dapat dideteksi.

PCR (Polymerase Chain

Reaction)
Kelemahan

harus ada primer spesifik untuk

setiap ujung segmen DNA sasaran yg
diamplifikasi

Sensitivitasnya

sangat tinggi perlu kontrol utk

menghindari salah interpretasi karena adanya
DNA eksogen

Sequencing

Microarrays (Gene Chips)

APPLICATIONS

Genome mutational analysis

Multiple drug resistance
Monitor gene expression in cells
Pharmocogenomics
Screening for multiple infectious
agents

From well to chip

IMMUNOLOGY
NAMA ALAT

METODE

JENIS TES

AXSYM

MEIA & FPIA HBsAg, Anti-HBs, HBeAg,

Anti-Hbe, Anti-HBC, Anti-HBC
IgM, Anti-HIV, Phenitoin,
Phenobarbital, Theophilin,
Digoxin, Carbamazepin,
Cyclosporin

ARCHITECT,
Immulite 2000

Chemilumin
escent

PSA, Free PSA, Anti-TPO,

Tacrolimus, Ferritin, hs-CRP,
IgE Total, IgE Spesifik,
Insulin, C-Peptide, Cortisol,
Asam Folat, Tiroglobulin,
Growth Hormone, PTH, IGF-1

IMMUNOLOGY
NAMA
ALAT

METODE

JENIS TES

Reader 530 ELISA/EIA

HSV1 IgG/M, HSV2 IgG/IgM, ACA

IgG/M, H. pylori IgG, Anti-CCP IgG,
Anti Chlamydia IgG/M, Protein
C/S, ANA, Adiponektin, Anti dsDNA, Faecal Elastase, Anti EBV
VCA IgA

Uerolinesca Imunoblot
n
Assay

IgE Atopy

Minineph

Prealbumin

Nefelometri

FACS Count Flow

cytometry

CD4, CD8

Manual

Widal, ASTO, RF, CRP, LE Tes,

RPR, VDRL, TPHA, Tymun T/M
Anti Tb-IgG, Anti S. typhi IgM,
NS1, IgG/M Anti Dengue,

Aglutinasi
Immunochro
matograf

Molecular diagnostic is not an alien

Thank you ....