ANALISIS HAYATI

KELOMPOK 2

 NANDA DESMALINDA .R (18334776)

 YOVONE THERESIA .M .M (18334777)
 RIZKY FIRMANSYAH (18334778)
 TITIS TRIYAMULIYANA (18334784)
 FATIAH NURUL .H (18334785)
 PERALATAN

Semua peralatan harus dicuci bersih

sebelum dan sesudah digunakan.
Peralatan gelas untuk menyimpan
dan memindahkan mikroorganisme
uji, disterilkan dengan pemanasan
kering atau dengan uap air.
 PENGEDALIAN SUHU
Pengendalian termostatik diperlukan dalam
beberapa tahap penetapan secara mikrobiologi,
waktu membiakkan mikroorganisme dan penyiapan
inokulanya, selama inkubasi dalam penetapan pada
lempeng dan tabung. Suhu pada penetapan
dengan cara lempeng dipertahankan pada lebih
kurang 0,5°C dari suhu yang dipilih. Pengendalian
suhu yang lebih dekat (lebih kurang 0,1°C dari
suhu yang dipilih) sangat penting untuk inkubasi
pada penetapan dengan cara tabung, hal ini dapat
diperoleh dengan sirkulasi udara atau air, kapasitas
panas dari air yang lebih besar lebih
menguntungkan daripada sirkulasi udara.
 SPEKTOFOTOMETRI
Pengukuran transmitans dalam pita frekuensi yang sempit,
membutuhkan spektrofotometer yang sesuai dan mempunyai
sumber cahaya panjang gelombang yang dapat diubah atau
dibatasi menggunakan filter 530 nm untuk pengukuran serapan
pada pengujian dengan cara tabung. Untuk tujuan tersebut, alat
dapat diatur hingga dapat menerima tabung yang digunakan
untuk inkubasi dan menggunakan sel yang dimodifikasi yang
dilengkapi dengan pipa pembuangan untuk memudahkan
pertukaran isi dengan cepat, atau lebih disukai sel yang
mempunyai saluran untuk pengaliran secara sinambung selama
pengukuran. Atur serapan dengan blangko untuk serapan nol
menggunakan media cair yang jernih tanpa inokula yang
disiapkan seperti dinyatakan untuk masing-masing antibiotika,
termasuk sejumlah yang sesuai larutan uji dan formaldehida
dalam setiap contoh.
 WADAH UTK PENETAPAN
SECARA LEMPENG SILINDER

Untuk penetapan cara lempeng, gunakan cawan

petri kaca atau plastik (lebih kurang 20 mm x 100
mm) yang mempunyai tutup dari bahan yang
sesuai. Untuk silinder, gunakan silinder besi tahan
karat atau porselen dengan toleransi ukuran
masing-masing lebih kurang 0,1 mm; diameter
luar 8 mm, diameter dalam 6 mm, dan tinggi 10
mm. Cuci silinder dengan saksama untuk
membersihkan semua residu, kadang-kadang
diperlukan suatu asam seperti asam nitrat 2 N
atau asam kromat
 WADAH UTK PENETAPAN
SECARA TURBIDIMETRI
Untuk penetapan dengan cara tabung
reaksi kaca atau plastik dengan ukuran
misalnya 16 mm x 125 mm x atau 18 mm
x 150 mm yang panjang, diameter dan
ketebalannya relatif seragam serta
permukaannya tidak cacat dan tidak
tergores. Tabung yang akan ditempatkan
pada spektrofotometer harus yang sesuai,
tanpa goresan dan tidak cacat. Bersihkan
saksama tabung dari semua residu
antibiotika dan sisa larutan pembersih, dan
sterilkan sebelum digunakan untuk
penetapan berikutnya.
 MEDIA
Media yang diperlukan untuk penyiapan inokula
mikroorganisme dibuat dari bahan-bahan yang
tertera di bawah ini. Sedikit modifikasi dari
masing-masing bahan, atau media kering yang
direkonstitusi, dapat dilakukan dengan syarat
media yang dihasilkan mempunyai daya
menumbuhkan yang sama atau lebih baik dan
memberikan respons kurva baku yang sama.
Larutkan bahan-bahan dalam air hingga 1 L,
dan atur pH larutan menggunakan natrium
hidroksida 1 N atau asam klorida 1 N, hingga
sesudah sterilisasi uap air didapatkan pH media
sesuai.
 MEDIA 1
Pepton 6,0 g
Digesti Pankreatik 4,0 g
kasein
Ekstrak ragi 3,0 g
Ekstrak daging 1,5 g
Glukosa 1,0 g
Agar 15,0 g
air 1000 ml
pH setelah sterilisasi 6,6 ± 0,1
 Media 2
Pepton 6,0 g
Ekstrak ragi 3,0 g
Ekstrak daging 1,5 g
Agar 15,0 g
Air 1000 ml
pH setelah sterilisasi 6,6 ± 0,1
 Media 3
Pepton 5,0 g
Ekstrak ragi 1,5 g
Ekstrak daging 1,5 g
Natrium klorida 3,5 g
Glukosa 1,0 g
Kalium fosafat dibasa 3,68 g
Kalium fosfat monobasa 1,32 g
Air 1000 ml
pH setelah sterilisasi 7,0 ± 0,05

MEDIA 5
Sama seperti media 2, kecuali pH sth sterilisasi
7,9 ± 0,1
Media 8
Sama spt Media 2, kecuali pH sth sterilisasi 5,9 ±
0,1

Media 9
Digesti pankreatik kasein 17,0 g
Digesti papaik kedelai 3,0 g
Natrium Klorida 5,0 g
Kalium fosfat dibasa 2,5 g
Glukosa 2,5 g
Agar 20, 0 g
Air 1000 ml
pH sth sterilisasi 7,2 ± 0,1
Media 10
Sama spt media 9, kecuali menggunakan 12 g agar sbg
pengganti 20 g agar, dan sth pendidihan media utk
melarutkan agar, tambahkan 10 ml polisorbat 80. pH sth
sterilisasi adl 7,2 ± 0,1

Media 11
Sama spt media 1, kecuali pH sth sterilisasi 8,3 ± 0,1

Media 13
Glukosa 20,0 g
Pepton 10,0 g
Air 1000 ml
pH setelah sterilisasi 5,6 ± 0,1
 Media 19
Pepton 9,4 g
Ekstrak Ragi 4,7 g
Ekstrak daging 2,4 g
Natrium Klorida 10,0 g
Glukosa 10,0 g
Agar 23,5 g
Air 1000 ml
pH setelah sterilisasi 6,1 ± 0,1
 Media 32
Sama seperti Media, kecuali tambahkan 300
mg mangan sulfat.

Media 34

Gliserin 10,0 g
Pepton 10,0 g
Ekstrak daging 10,0 g
Natrium klorida 3,0 g
Air 1000 ml

Ph setelah sterilisasi 7,0 ± 0,1

Media 35
Sama seperti Media 34 , kecuali
ditambahkan 17 g agar.

Media 36
Digesti Pankreatik Kasein 15,0 g
Digesti papaik kedelai 5,0 g
Natrium klorida 5,0 g
Agar 15,0 g
Air 1000 ml

Ph setelah sterilisasi 7,0 ± 0,1

Media 39
Sama seperti Media 3, kecuali pH setelah sterilisasi 7,9 ± 0,1

Dapar Fosfat dan Larutan Lain

Dapar fosfat, yang diperlukan untuk antibiotik yang ditetapkan, dibuat
seperti di bawah atau dengan cara lain yang sesuai. Dapar disterilkan
setelah pembuatan, pH yang tertera pada masing – masing dapar adalah pH
sterilisasi.
Dapar nomor 1 : 1% ; pH 6,0; Larutkan 2,0 g kalium fosfat dibasa dan 8,0 g
kalium fosfat monobasa dalam 1000 ml air. Atur pH hingga 6,0 ± 0,05 dengan
asam fosfat 18 N atau kalium hidroksida 10N.
Dapar nomor 3; 0,1M; pH 8,0; Larutan 16,73 g kalium fosfat dibasa dan
0,523 g kalium fosfat monobasa dalam air 1000 ml. Atur pH hingga 8,0 ± 0,1
dengan asam fosfat 18 N atau kalium hidroksida 10 N.
Dapar nomor 4 :
0.1 M; pH 4,5; Larutkan 13,61 g kalium fosfat monobasa dalam 1000 ml
air. Atur pH hingga 4,5 ± 0,05 dengan asam fosfat 18 N atau natrium
hidroksida 10 N.

Dapar nomor 6; 10%; PH 6,0; Larutkan 20,0 g kalium fosfat dibasa dan
80,0 g kalium fosfat monobasa dalam 1000 ml air. Atur Ph hingga 6,0 ±
0,05 dengan asam fosfat 18 N atau natrium hidroksida 10 N.

Dapar nomor 10; 0,2 M; Ph 10,5; Larutkan 35,0 g kalium fosfat dibasa
dalam 1000 ml air tambahkan 2 ml kalium hidroksida 10 N. Atur pH
hingga 10,5 ± 0,1 menggunakan asam fosfat 18 N atau kalium hidroksi
10N

Dapar nomor 16; 0,1 M; Ph 7,0; Larutkan 13,6 g kalium fosfat dibasa dan
4,0 g kalium fosfat monobasa dalam 1000 ml. Atur Ph hingga 7,0 ± 0,2
dengan asam fosfat 18 N atau kalium hidroksida 10 N
Larutan lain untuk air gunakan air suling; untuk natrium klorida,gunakan
injeksi natrium klorida;formaldehida encer adalah larutanformal dehida
yang diencerkan dengan air 1: 3

Unit dan Baku Pembanding

Pengertian ”µg” aktivitas berasal dari sediaan antibiotic yang dipilih
sebagai baku pembanding yang secara keseluruhan dianggap terdiri dari
bahan kimia tunggal. Oleh karena itu, potensi dinyatakan 1000 ”µg” per
mg.

Dalam hal ini “µg” aktivitas dinyakan dalam “unit”

“µg” aktivitas tidak boleh dianggap sama dengan µg (bobot) bahan

antibiotic.
Untuk amfoterisin B dan nistatin, buat larutan baku pembanding dan larutan
uji secara bersamaan.

Tabel 2.1 Penyiapan larutan pembanding persediaan dan pengencerannya

Antibiotik Pengerin Pelarut awal Kadar Batas Penge Dosis

dan cara gan (kadar awal persedi waktu ncer tengah
penetapan [ sebelum yang aan penggu akhir (µg
cara digunaka ditetapkan akhir naan aktivita
lempeng n sebelumnya) (per s atau
(CL) atau Y (Ya) [Pengencer ml) unit per
turbidimetri T (Tidak) selanjutnya ml)
(T)] jika berbeda]
Amfoterisin Y Dimetil 1 mg * D.10 1,0 µg
B (CL) T sulfoksida 1 mg 14 hari Air 10 µg
Amikasin (T) T Air 100 µg 7 hari D.3 0,1 µg
Ampisilin Y Air 2U 14 hari D.16 0,04 U
(CL) Y D.16 1 mg 90 hari D.3 1,0 µg
Bleomisin Metanol
(CL) (10mg/ml);[D
Daktinomisi .3]
n (CL)
Antibiotik dan Pengering PTelarut awal Kadar Batas Pengen Dosis
cara an (kadar awal yang persedi waktu cer tengah (µg
penetapan [ sebelum ditetapkan aan penggu akhir aktivitas
cara lempeng digunakan sebelumnya) akhir naan atau unit
(CL) atau Y (Ya) [Pengencer (per per ml)
turbidimetri T (Tidak) selanjutnya jika ml)
(T)] berbeda]
Demeklosiklin Y Asam klorida 0,1 N 1 mg 4 hari air 0,1 µg
(T) Y D.3 1 mg 30 hari D.3 1,0 µg
Dihidrostrepto
misin (CL) Y Air 1 mg 30 hari air 30 µg
Dihidrostrepto
misin (T) T D.1 1 mg 7 hari D.1 5,0 µg
Dikloksalin T Asam hidroklorida 1 mg 5 hari Air 0,1 µg
(CL) Y 0,1 N 1 mg 14 hari D.3 1,0 µg
Doksisiklin (T) Y Metanol 1 mg 30 hari D.3 0,1 µg
Eritromisin T (10mg/ml); [D.3] 1 mg 30 hari Air 10 µg
(CL) T D.3 1 mg 14 hari D.I 20 µg
Gentamisin T Air 1 mg 30 hari D.3 1,0 µg
(CL) D.1
Kanamisin (T) Air
Karbensilin
(CL)
Klindamisin
(CL)
Antibiotik dan Pengeringa PTelarut awal (kadar Kadar Batas Pengenc Dosis tengah
cara penetapan n sebelum awal yang ditetapkan persedia waktu er akhir (µg aktivitas
[ cara lempeng digunakan sebelumnya) an akhir penggun atau unit
(CL) atau Y (Ya) [Pengencer (per aan per ml)
turbidimetri (T)] T (Tidak) selanjutnya jika ml)
berbeda]
Kloksasilin (CL) T D.I 1 mg 7 hari D.I 5,0 µg
Kloramfenikol T Alkohol 1 mg 30 hari Air 2,5 µg
(T) T (10mg/ml);[air] 1 mg 4 hari air 0,06 µg
Klortetrasiklin Y Asam klorida 0,01 N 1 mg 14 hari D.6 1,0 µg
(T) T Air (10MG/ML);[D.6] 1 mg 30 hari air 0,5 µg
Kolistin (CL) T Air 1 mg 2 hari Air 0,085 µg
Linkomicin (T) T Asam klorida 0,1 N 1 mg 14 hari D.I 1,0 µg
Minosiklin (T) Y D.1 1 mg 14 hari D.3 1,0 µg
Mitomisin (CL) Y D.3 100 µg 14 hari D.3 1,0 µg
Neomisin (CL) Y D.3 1000 U * D.6 10 U
Neomisin (T) T Dimetilformanida 1 mg 4 hari Air 0,24 µg
Nistatin (CL) Y Asam klorida 0,1 N 1 mg 21 hari D.3 1,0 µg
Oksitetrasiklin T D.3 1000U 4 hari D.I 1,0 U
(CL) D.I
Paromomisin
(CL)
Penisilin G (CL)
 Penyiapan Baku
Untuk menyiapkan larutan persediaan, larutkan
sejumlah baku pembanding antibiotik yang
ditimbang saksama dan sebelumnya telah
dikeringkan, kemudian encerkan hingga kadar yang
dikehendaki. Simpan dalam lemari pendingin dan
gunakan.

 Penyiapan contoh
Informasi yang ada untuk penyiapan sediaan yang
akan diuji. Penetapan menggunakan 5 tingkat dosis
baku, memerlukan hanya 1 tingkat dosis contoh
pada kadar perkiraan sama dengan aras dosis tengah
baku.
Mikroorganisme uji

Mikroorganisme uji untuk setiap antibiotika

tertera pada Tabel 2.2 beserta nomor identifikasi
American Type Culture Collection (ATCC) yang
bersangkutan. Metode penetapan dengan
mikroorganisme uji tersebut tertera pada Tabel
2.1. pelihara biakan pada media agar miring
dengan kondisi inkubasi seperti tertera pada
Tabel 2.3 dan pindahkan setiap minggu pada
agar miring yang baru. Untuk Klebsiella
pneumoniae gunakan biakan tidak berkapsul.
 Penyiapan Inokula
• Untuk persiapan penetapan, inokulasikan biakan
segar mikroorganisme dari agar miring atau
biakan lain ke permukaan 250 ml media agar
dalam sebuah botol Roux, kecuali untuk
Streptococcus faccium dibiakkan dalam media
cair. Sebarkan suspensi secara merata ke atas
permukaan agar suspensi dengan bantuan
butiran kaca steril dan inkubasikan pada suhu
yang ditetapkan selama waktu tertentu. Pada
akhir periode inkubasi, buat suspensi
persediaan dengan mengumpulkan biakan
permukaan ke dalam 50 ml larutan natrium
klorida 0,9
% steril kecuali untuk Bleomisin (gunakan 50 ml
Media 34)
 Rancangan Penetapan
Penetepan secara mikrobiologi akan
menghasilkan presisi yang meyakinkan
melalui pemisahan sumber-sumber penyebab
kesalahan potensial dan bias yang relatif
besar dengan menggunakan rancangan
penetapan yang sesuai. Pada penetapan
dengan metode lempeng silinder,
perbandingan pokok dibatasi oleh hubungan
pengukuran diameter hambatan antar
lempeng.
Mikroorgani Media Suhu (0C) Waktu Pengenceran Media Jumlah Antibiotik
sme Uji dan (Jam) suspensi (ml/100 ml)
(Nomor persediaan
ATCC) hingga diperoleh
25% T
Bacillus 32 32-35 5 hari 5 ** Daktinomis
Subtilis in
(6633)
8 0,5 Mitomisin

Bordetella 1 32-35 24 1:20 10 0,1 Kolistin

Bronchisepti
ca (4617)
Polimiksin

Escherichia 1 32-35 24 1:20 3 0,7 Kloramfeni

Coli (10536) kol
Klebsiella 1 36-37,5 24 1:25 3 0,1 Streptomisi
Pneumoniae n
(10031)
Dihidrostre
ptomisin
39 2 Neomisin

Micrococcus 1 32-35 24 1:40 11 0,5 Ampisilin

luteus (9341)
Klindamisi
n
Mikroorganism Media Suhu Waktu Pengencera Medi Jumlah Antibiotik
e uji dan (0C) (Jam) n suspensi a (ml/100
(Nomor ATCC) persediaan ml)
hingga
diperoleh
25% T
Micrococcus 1 32-35 24 1:35 1 0,3 Basitrasin
Luteus
(10240)
Mycobacterium 36 36-37,5 48 * 35 1,0 Bleomisin
smegmatis
(607)
Pseudomonas 1 36-37,5 24 1:25 10 0,5 Karbenisili
aeruginosa n
(25619)
Saccharomyces 19 29-31 48 * 19 1,0 Amfoterisi
cerevisiae nB
(9763)
 PENETAPAN POTENSI ANTIBIOTIK
SECARA MIKROBIOLOGI

Ada 2 metode umum :

a. Penetapan dengan Lempeng Silinder
(Lempeng)
b. Penetapan dengan Turbidimetri
(Tabung)
 Metode Lempeng Silinder
Pada penyiapan lempeng penetapan menggunakan
cawan petri, tuang 21 ml Media 2 ke dalam
sejumlah cawan yang diperlukan dan biarkan
memadat sebagai lapisan dasar yang licin dengan
ketebalan seragam, kecuali untuk amfoterisin B dan
nistatin yang tidak menggunakan lapisan dasar yang
terpisah.

Untuk ampisilin, klindamisin, eritromisin,

gentamisin, linkomisin, neomisin, gunakan 10 ml
Media 35 ; Untuk dihidrostreptomisin, gunakan
Media 5; untuk daktinomisin, gunakan 10 ml media
5; untuk mitomisin dan vankomisin gunakan 10 ml
media 8; dan untuk karbenisilin, kolistin, dan
polimiksin B, gunakan media 9.
 Metode Turbidimetri
Pada hari penetapan, dipakai dosis yang diperlukan dengan
mengencerkan larutan persediaan baku dan setiap larutan uji seperti
tertera pada Tabel 2.1. Tambahkan 1 ml setiap dosis pada masing-
masing 3 tabung reaksi yang telah disiapkan dan tempatkan 3 replikat
tabung dengan posisi secara acak pada rak tabung. Secara bersamaan,
letakkan 1 tabung atau 2 tabung kontrol yang berisi 1 ml pengencer
pada setiap rak, tetapi tanpa antibiotik.

Setelah semua pengisian larutan selesai (Untuk kandisidin dalam waktu

30 menit ketika air ditambahkan pada larutan persediaan
metilsulfoksida), tambahkan 9,0 ml inokula ke dalam setiap tabung
pada rak, dan setelah pengisian lengkap, rak segera ditempatkan dalam
inkubator atau tangas air dengan suhu yang dipertahankan pada 360C
sampai 37,50C selama 2 jam sampai 4 jam, kecuali untuk kandisidin
(Inkubasi pada suhu 270C sampai larutan formaldehida encer ke dalam
setiap tabung pada satu rak dalam waktu yang bersamaan, dan ukur
transmitans atau serapan pada 530 nm.