KROMATOGRAFI KOLOM SEDERHANA

Kromatografi Kolom Sederhana

Bergerak / aliran karena gaya grafitasi
↓
Pemilihan fase diam + fase gerak
↓
Kepolaran
↓
Pita-pita kromatogram
↓
Terbentuk fraksi-fraksi
↓
Dianalisis dengan KLT / KK↓
Pemisahan Secara Kromatografi

Mikhail Tswett
↓
Pigmen tumbuhan
↓
Pita-pita
 Pengisian Kolom
• fase diam homogen
Fase diam • fase diam ukuran sama
• fase diam bentuk seragam
Pasir
• bebas gelembung udara

Kapas / glass
wool

Tehnis : fase diam + pelarut → bubur (fase gerak)

Kolom kromatografi sederhana
(learning kolom)
Isolasi hasil fraksi dengan KLT Preparatif
CHCl3 : MeOH : H2O = 6,5 :2,5:0,4

Isolat yang diambil

Profil KLT preparatif di bawah UV 254 nm fase diam silika dan

fase gerak = kloroform: metanol: air = 6,5: 2,5: 0,4
 Identifikasi kemurnian isolat dengan KLT
CHCl3:MeOH:H2O= 6,5:2,5:0,4

A: isolat hasil isolasi I

B: isolat hasil isolasi II

A B
Gambar KLT hasil purifikasi pada lampu UV 254 nm.
fase diam = silika GF 254 nm, fase gerak= kloroform: metanol: air = 6,5: 2,5: 0,4
Hasil spektra Spektrofotometri UV
 Hasil spektra Infra Red
65

60

677.34
55

1125.61

603.34
1548.63

408.40
428.60
454.51
50

2349.20
2298.27

1636.87
45
%T

40

35

30

25

20
3469.93

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

Wavenumbers (cm-1)
 Gambar. berbagai metode pemisahan
• Contoh:

11
 Klasifikasi Sistem Kromatografi
Umum Tehnik Fase diam Keseimba
Spesifik ngan
1. K. Cair  LLC Cair pd padatan Partisi
(LC)  LSC Padatan Adsorbsi
 IEC Resin Tukar ion

2. K. Gas  GLC Cair pd padatan Partisi

(GC)  GSC Padatan Adsorbsi
 Gas terikat Padatan P/A
 Kromatografi

Fase diam fase gerak

↓ ↓
Statinary phase mobile phase

Pemisahan
↓
Perbedaan laju migrasi
Polaritas senyawa
 Hukum Distribusi Kromatografi
↓
perbedaan distribusi komponen di dalam
FG & FD
↓
koefisien distribusi / partisi (K)
↓
K = CS /CM
CS : kons. Molar komponen dlm FD
CM: kons. Molar komponen dlm FG
 Elusi dalam kolom kromatografi
Sp Solvent Elusi : proses terbawanya
E komponen dlm suatu camp,
B+E shg ada pemisahan
komponen yg dibawa oleh FG
kolom

E
A+E dari ujung atas kolom →
E bawah
D tR : waktu yg diperlukan oleh
komponen untuk bermigrasi
sepanjang kolom
Vr : volume FG yg
signal

dibutuhkan untuk membawa

komponen dari titik awal
tR kolom → akhir kolom
 F : laju alir FG yang menyatakan jumlah vol FG per satuan waktu
↓
F = VR / tR
tR = VR / F

Dalam kolom yang ideal

↓
Komp. yang tidak teretensi
↓
t=0
↓
Komp. di atas memerlukan waktu untuk bermigrasi →
tM : waktu FG melewati kolom
VM : fraksi volum kolom yang dilalui komponen
→
tR’ = tR – tM
VR’ = VR – VM
terkoreksi
Untuk menerangkan proses pemisahan dlm kromatografi ada
2 macam teori :

1. Teori Lempeng (Plate Theory)

↓
Martin & Synge (1941)
↓
Efisiensi kolom
↓
Apabila jumlah kesetimbangan makin besar
→ efisiensi >> → menambah jumlah lempeng (N)
→ tebal lempeng teoritik → H
N & H → menyatakan efisiensi
↓
Secara matematis : N = L / H
Kelemahan teori :
tidak mampu mengidentifikasi variabel-variabel yang
mempengaruhi pelebaran pita kromatogram
2. Teori Kinetik ( Kinetics Theory)

Dapat mengatasi kelemahan teori Plate.

→ teori laju / rate theory

↓
Partikel komponen bermigrasi diantara FG & FD
↓
Migrasi sangat tidak teratur
↓
Energi thermal
↓
Gerakan partikelnya random
↓

Ditribusi simetrik Gauss

 H.E.T.P

H = 16 L x (Wb / tR)2

N = 16 x (tR / Wb)2 = (4tR/W)2

Simetrik Gauss → t (waktu) lama →puncak lebar

 Menurut Van Deemter
↓

Ada 3 proses secara stimultan yg mempengaruhi variabilitas laju

migrasi komponen diantara FG & FD :

1. Difusi Eddy (Eddy diffusion)

2. Difusi longitudinal (longitudinal diffusion)
3. Proses transfer massa
↓
Pada tebal lempeng teoritik (H) → merupakan fungsi linier
variabilitas laju migrasi komponen
↓
Persamaan Van Deemter
H = A + B /µ + C.µ

A = koefisien Difusi Eddy

B = koefisien Difusi longitudinal
C = (CS + CM) = koefisien total
 Difussi longitudinal
↓
Pelebaran pita
↓
Molekul komponen dlm FG → bermigrasi dari konsentrasi tinggi ke
konsentrasi rendah
↓
Kontribusi variabilitas laju migrasi yg menurun secara hiperbolik
terhadap kenaikan kecepatan linier FG (µ)
↓
Pada tebal lempeng teoritik

2ΨDM B
HLD = =
µ µ
DM = koefisien difusi komponen FG
Ψ = kualitas packing FD
↓
0,6
 Pelebaran pita Transfer Massa
↓
Konstribusi H akan naik apabila kec. Linier FG naik
↓
Makin cepat kec. FG akan makin singkat proses transfer
massa → pemisahan rendah

• Pelebaran pita diffuse Eddy

↓
Akibat tidak homogen pori dalam packing kolom
↓
Ada yang jalannya pendek dan ada yang panjang
 tA
Sinyal analitik

tM

0
t (waktu)
W
Kromatografi camp. 2 komp, yang mengalami retensi &
tidak
konsentrasi

A B
Jarak migrasi

Profil konsentrasi komp. A & B dalam kolom pada

jarak migrasi yang berbeda
 VARIABEL TERMODINAMIKA PADA PEMISAHAN

Mempengaruhi kualitas kolom

1. Waktu Retensi
tR
V= xµ Laju migrasi komponen
tM

2. Faktor-faktor kapasitas kolom (k’)

Ratio jumlah molekul komponen dalam FD
terhadap jumlah molekul komponen dalam FG
Lanjutan…

nS [ CS x VS ]
k’ = = Pengalaman : k’ < 1
nM [ CM x VM ] ↓
Tidak memisah
VS
k’ = xk Disarankan : k’ semakin besar
VM
↓
( tR – tM) tR ’ Pemisahan ↑
k’ = = ↓
tM tM k’ > 10
↓
Tidak ekonomis
3. Faktor selektivitas (α)
↓
Ratio koef. Distribusi 2 komponen yang akan
dipisahkan
↓
Menggambarkan kemampuan pemisahan suatu kolom
↓
α = KB / KA
KB / KA = koef. Distribusi komp. B / A
Dimana : KB = koef. Distribusi komponen B yg teretensi
kuat dalam kolom
KA = koef. Distribusi komponen A yg teretensi
lemah dalam kolom
Ada hubungan dengan k’
↓
α = KB’ / KA’
↓
(tR)B - tM
α=
(tR)A - tM
4. Resolusi Kolom (Rs)
ΔZ 2 ΔZ
RS= =
0,5WA + 0,5WB ( WA + WB )

2 [ (tR)B – (tR)A ]
RS=
WA + WB
ΔZ = jarak puncak A & puncak B
WA = lebar dasar kromatogram A
WB = lebar dasar kromatogram B
Disarankan RS ≥ 1,5
↓
Hubungan dengan faktor-faktor lain
VN ( α – 1) k’B
RS = x α x
4 ( 1 + k’B )
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
(KCKT)
HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY (HPLC)
 SKEMA HPLC

Injektor

Kolom analitik
C18 D

Ke penampungan

POMPA

Integrator
Instrumen HPLC
1. Reservoir Fase Gerak
↓
Bisa lebih dari 1
↓
dari gelas / stainless steel
↓
Daya tampung 1- 2 L
Dilengkapi degasser (menghilangkan gas terlarut) → gas
NO2 & O2 → membuat gelembung-gelembung di
dalam kolom & detektor
↓
- Pelebaran pita analit
- Respon detektor terganggu
• Degassing → pompa vakum dihubungkan reservoir &
diaduk / dipanaskan

Solven disaring dengan kertas Millipore

Pemisahan dengan 1 jenis FG dengan konsentrasi konstan

→ Elusi Isokratik

Bila dengan 1 atau lebih FG yang polaritasnya berbeda →

Elusi Gradien

Digunakan FG segar → mendapatkan hasil yang

reprodusibilitas optimum dalam pemisahan
2. Pompa
Tekanan ≥ 1000 psi (4000 – 6000psi)

Kec. Alir 1-3ml/menit

Bahan harus resisten secara kimiawi

Ex : dari teflon & stainless steel

Tidak ada pulsa getaran

Kontinyu
 3. Peredam Pulsa Fase Gerak

Ada beberapa detektor sensitive terhadap

variasi kec. Alir FG → ex : index refraksi,
elektrokimia & konduktometer

Peredam aliran dengan gas yang ditekan

4. Sistem Injeksi Sampel

Menentukan presisi perhitungan → reprodusibilitas

sampel
Sampel dimasukkan dengan tekanan tinggi → merupakan
pita dengan sampel tipis → pelebaran diperkecil
Konvensional atau automatik
Injektor Automatik
5. Kolom Kromatografi

Bentuk tabung, permukaan dalam rata

Dari gelas / stainless steel
Lapisan luar kadang dilapisi logam → menahan
tekanan ad 6000 psi, rx kimia dari FG
Sambungan kolom → tidak menyebabkan FG
stagnant
Panjang kolom (10 – 30) cm
Analisis pemisahan cepat (3 – 8) cm
Internal diameter (4 – 5)mm
Partikel diameter (3 – 5) µm
Guard kolom → sebelum kolom analitik
Kolom dari stainless steel
 6. Detektor

Pemilihan didasarkan pada problem pemisahan

↓
Harus sensitif (menghindari pelebaran)

Ada 2 macam :

1. Berdasarkan sifat umum larutan

Refraktif indeks → control temperatur
Kurang sensitive
2. Berdasarkan sifat solut/analit/sampel

UV – Vis
Fluorescence
Elektrokimia
↓
Sinyal analit yang berbeda dari FG
↓
Lebih sensitif (µg – ng)
↓
Dikembangkan dengan derivatisasi pre & post kolom
Derivatisasi/modivikasi Instrumen HPLC

46
Alur sampel ke Detektor
 7.Interpretasi output dari
Detektor/integrator

• Direkam berupa rangkaian puncak-puncak

• Puncak untuk data kualitatif dan kuantitatif
 Profil kromatogram

Dalam gambar, area di bawah puncak Y < dibanding

dengan area dibawah puncak X. Hal ini mungkin
disebabkan :
a.Karena Y lebih sedikit dari X
b.Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang lebih
sedikit dibanding dengan X.
 Rangkaian HPLC pada spektrometer massa

Pada saat detektor menunjukkan puncak, beberapa

senyawa sementara melewati detektor dan pada
waktu yang sama dapat dialihkan pada spektrometer
massa. Pengalihan ini akan memberikan pola
fragmentasi yang dapat dibandingkan pada data
komputer dari senyawa yang polanya telah diketahui.
Ini berarti bahwa identifikasi senyawa dalam jumlah
besar dapat ditemukan tanpa harus mengetahui
waktu retensinya.
 Fase Normal HPLC
• Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan
pelarut non polar misalnya heksan. Sebuah kolom
sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm panjang
150 sampai 250 mm.

Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom

akan melekat lebih lama pada silika yang polar
dibanding dengan senyawa-senyawa non polar. Oleh
karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan
lebih cepat melewati kolom.
 Fase Balik/Reverse Phase HPLC
Silika dimodifikasi menjadi non polar berupa atom
karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar
digunakan berupa campuran air dan alkohol
seperti metanol.

Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan

bereaksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya
dispersi gaya van der Waals. Molekul-molekul polar akan
bergerak lebih cepat melalui kolom.

Fase balik HPLC adalah bentuk yang biasa digunakan

dalam HPLC.
Hasil Analisis dengan menggunakan HPLC