Sustain
Prosedur:
a. Bila menggunakan biakan padat, pindahkan dengan jarum
inokulum satu ulasan saja;
b. Kemudian beri aquades dan disebarkan supaya sel merata dengan
jarum ose
c. Bila menggunakan biakan cair, pindahkan dengan pipet tetes atau
dapat juga menggunakan dengan jarum ose
d. Sebarkan secara merata dengan menggunakan jarum ose
e. Ulasan dikering udarakan
f. Lakukan fiksasi dengan api bunsen (lewatkan di atas api 2-3 kali)
Pewarnaan sederhana (positif dan
negatif)
• Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan perbesaran 100 x 10
yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat.
• Dengan menggunakan mikroskop cahaya, umumnya sel bakteri sulit untuk diamati atau tampak
transparan karena indeks bias sitoplasma sel hampir sama dengan indeks bias lingkungan yang
bersifat cair.
• Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke
permukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras
sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatkan.
• Prosedur pewarnaan sederhana dapat dilihat di Petunjuk Praktikum
• Evaluasi dan Pembahasan:
• Apa yang dimaksud dengan cat biologis?
• Apa yang disebut cat asam dan cat basa?
• Jelaskan mengapa pengecatan sederhana disebut dnegan pengecatan positif?
• Sebutkan faktor-faktor yang mempengaruhi hasil pengecatan sederhana?
Ilustrasi Pewarnaan sederhana (+)
Prosedur:
a. Letakkan Object Glass berisi ulasan pada Staining Loop,
kemudian tetesi dengan pewarna (MB, Safranin, Crystal
Violet) dan tunggu kurang lebih 30 s
b. Cuci dengan aquades
c. Keringkan dengan kertas penyerap
Pewarnaan negatif
• Prinsip pewarnaan negatif adalah mewarnai latar belakang obyek atau sel,
tidak mewarnai obyek.
• Hasil pemanasan menunjukkan latar belakang tampak gelap dan se
transparan (tembus pandang) karena sel tidak mampu menyerap cat
tersebut
• Cara ini banyak digunakan untuk mengetahui morfologi dan ukuran sel
untuk sel yang sulit diwarnai
• Prosedur pewarnaan dapat dilihat di Petunjuk Praktikum
• Evaluasi dan pembahasan
• Sebutkan faktor-faktor yang mempengaruhi hasil pengecatan negatif
• Jelaskan mengapa pewarnaan negatif berguna untuk pengukuran sel
• Jelaskan mengapa disebut pewarnaan negatif
• Sebutkan keuntungan dan kelemahan pewarnaan negatif
Ilustrasi Pewarnaan negatif
Prosedur:
a. Ambil biakan lalu diulaskan atau diteteskan di ujung kanan slaah
satu object glass
b. Teteskan nigrosin tepat di posisi biakan yang sudah diulaskan atau
diteteskan di object glass
c. Tempelkan siss object glass yang lain
d. Kemudian gesekkan ke samping kiri
e. Preparat dikering udarakan.
Pewarnaan gram
• Pewarnaan gram termasuk perwarnaan diferensial karena dapat digunakan untuk membedakan
antara bakteri gram positif dan gram negatif. Pewarnaan ini sering digunakan untuk klasifikasi dan
identifikasi bakteri.
• Komposisi dinding sel antara bakteri gram positif dan negatif berbeda, sehingga hasil reaksi
pewarnaan gram juga berbeda.
• Pewarnaan gram membutuhkan gram A (kristal violet), Gram B (lugol iodin), Gram C
(etanol:aseton=1:1) dan Gram D (safranin)
• Hasil reaksi pewarnaan Gram yaitu Gram positif akan berwarna violet dan Gram negatif akan
berwarna merah
• Prosedur pewarnaan sesuai dengan Petunjuk Praktikum
• Evaluasi dan Pembahasan:
• Sebutkan perbedaan bakteri Gram positif dan negatif
• Sebutkan fungsi Gram A, B, C, D
• Sebutkan faktor-faktor yang mempengaruhi hasil pengecatan Gram
• Jelaskan terjadinya reaksi gram tersebut
Ilustrasi Pewarnaan Gram
Prosedur:
a. Teteskan crystal violet dan diamkan selama 30 detik pada preparat
oles yang telas difiksasi
b. Cuci dengan aquades yang mengalir selama 5 detik
c. Teteskan lugol iodine dan diamkan selama 1 menit
d. Cuci dengan aquades yang mengalir selama 5 detik
e. Teteskan larutan pemucat tetes demi tetes hingga etanol yang jatuh
berwarna jernih. Jangan sampai terlalu banyak
f. Cuci dengan aquades yang mengalir selama 5 detik
g. Teteskan safranin dan diamkan selama 60-80 detik
h. Cuci dengan aquades yang mengalir selama 5 detik
i. Keringkan dengan kertas pengering
Enumerasi Bakteri
• Enumerasi Bakteri berarti melakukan perhitungan jumlah bakteri.
• Perhitungan menjadi penting untuk mengetahui tingkat pencemaran
suatu sampel oleh mikroba
• Beberapa teknik yang digunakan untuk menghitung jumlah bakteri
adalah:
• Angka Lempeng Total
• Most Probable Number
Angka Lempeng Total Standard Plate
Count (ALT SPC)
• Prinsip dari metode ALT SPC
• Jumlah koloni yang dipilih dan dihitung tiap cawan adalah 30-300 koloni
• Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan suatu kumpulan
koloni yang besar dimana jumlah koloni diragukan maka dihitung sebagai satu
koloni
• Suatu deretan koloni yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung sebagai
suatu koloni
Kriteria Data dengan Metode SPC
• Pilih cawan yang ditumbuhi koloni dengan jumlah 30-300 koloni.
Untuk koloni > 300 termasuk TNTC (Too Numerous To Count) dan
untuk koloni < 30 termasuk TFTC (Too Few To Count)
• Jumlah koloni yang dilaporkan terdiri dari 2 digit, yaitu angka satuan
dan angka sepersepuluh yang dikalikan dengan kelipatan 10
(eksponensial), misal 2,3x104 bukan 2,34x104 pembulatan ke aras
dilakukan pada angka seperseratus yang sama atau lebih dari 5, misal
2,38x104 menjadi 2,4x104
1
jumlah koloni = rata − rata jumlah koloni ×
faktor pengenceran
• Bila diperoleh perhitungan < 30 dari semua pengenceran maka data
yang diambil hanya dari pengenceran terendah
Jumlah koloni per pengenceran
SPC Keterangan
10-2 10-3 10-4
15 1 0 1,5x103 Semua < 30
• Bila diperoleh perhitungan > 300 dari semua pengenceran maka data
yang diambil hanya dari pengenceran tertinggi
Jumlah koloni per pengenceran
SPC Keterangan
10-2 10-3 10-4
TNTC TNTC 358 3,6x106 Pengenceran tertinggi (10-4)
TNTC 325 18 3,3x105 Pengenceran tertinggin (10-3)
• Bila ada 2 cawan, masing-masing dari pengenceran rendah dan tinggi
yang berurutan dengan jumlah koloni 30 – 300 dan hasil bagi dari
jumlah koloni pengeceran kedua cawan tersebut 2 maka jumlah
yang dilaporkan adalah nilai rata-rata. Namun, jika hasil bagi dari
jumlah koloni pengenceran tinggi dan rendah > 2 maka jumlah yang
dilaporkan adalah dari cawan dengan pengenceran rendah
Jumlah koloni per pengenceran
SPC Keterangan
10-2 10-3 10-4
295 40 5 3,5x104 40000/29500 < 2
140 35 1 1,4x104 35000/14000 >2
• Bila tiap pengenceran digunakan dua cawan petri (duplo) maka
jumlah angka yang digunakan adalah rata-rata dari kedua nilai jumlah
masing-masing setelah perhitungan
Jumlah koloni per pengenceran
SPC Keterangan
10-2 10-3 10-4
175 15 5 15 dan 20 < 30
(17500+20800)/2=1,9x104
208 20 2 Dilaporkan hasil rata-rata
135 45 5 45000/13500
(13500+16500)/2=1,5x104 45000/16500
165 45 8 Dilaporkan pengenceran terendah
Jumlah koloni per pengenceran
SPC Keterangan
10-2 10-3 10-4
275 35 5 (27500+35000)/2=a 27500/35000 < 2
(28500+40000)/2=b 28500/40000 < 2
285 40 7 (a+b)/2=3,3x104 Dilaporkan hasil rata-rata
290 25 5 25 dan 28 < 30
(29000+30500)/2=3x104 Meskipun 305 > 300
305 28 0 Dilaporkan hasil rata-rata
Metode MPN
• Metode MPN ini umumnya digunakan untuk menghitung jumlah bakteri pada air
khususnya untuk mendeteksi adanya bakteri koliform yang merupakan
kontaminan.
• Ciri-ciri utama dari koliform adalah gram negatif, batang pendek, tidak
membentuk spora, memfermentasikan laktosa menjadi asam dan gas yang
dideteksi dalam waktu 24 jam inkubasi pada 37 OC. Berdasarkan sifat koliform
maka bakteri ini dapat memfermentasikan media Lactose Broth (LB) menjadi
asam dan gas yang dideteksi oleh berubahnya warna dan gas dalam tabung
durham. Nilai MPN ditentukan dengan kombinasi jumlah tabung positif (asam dan
gas) tiap serinya setelah inkubasi.
• Secara sederhana prinsip penghitungan mikroba dengan metode MPN adalah
menghitung jumlah bakteri koliform dalam setiap 100 gram atau mililiter sampel
dengan cara menuangkan sejumlah sampel secara seri (3 tabung atau 5 tabung)
pada medium sesuai. Dalam pemeriksaan bakteri koliform dalam suatu sampel
umumnya terdiri dari 3 tahap, yaitu:
• Uji penduga (persumptive test) untuk mengetahui adanya bakteri yang mampu
memfermentasikan laktosa, biasanya dilakukan inokulasi sampel pada media laktosa
cair
• Uji penguat/penegas (confiment test) untuk mengetahui adanya bakteri coliform
dengan cara menumbuhkan pada media selektif Brilliant Green Lactose Bile (BGLB) cair
• Uji pelengkap (complete test) untuk mengetahui adanya bakteri dengan cara
identifikasi pada media uji biokimia (IMVIC) atau ciri koloni pada media selektif (Endo
Agar) dan hasil pengecatan gram
Teknik Pengenceran Bertingkat
Isolasi dan Inokulasi
Pour Plate vs Spread Plate
Hasil
Streak Plate
• Streak Plate adalah metode
isolasi paling efektif dan biasa
digunakan di laboratorium
• Efektif yang dimaksudkan adalah
dengan menggunakan metode
ini dengan mudah didapatkan
pure culture
Macam-macam streak plate
Tipe Koloni pada
Lempeng Agar
Tipe Koloni pada Biakan Miring
Stab Method
UKD I : TUGAS
• Buatlah sebuah ringkasan yang berisi: jenis uji, metode uji, fungsi dan
kegunaan pengujian, kandungan media, reaksi yang terjadi,
perubahan warna yang terjadi, interpretasi visual dari hasil. Jenis Uji:
• Uji Sulphite Indole Motility (SIM)
• Uji Methyl Red-Voges Proskauer (MR-VP)
• Uji CITRAT
• Uji Klinger Iron Agar (KIA)
• Uji Lysin Iron Agar (LIA)
• Isolasi pada Endo Agar
• Isolasi pada Mac Conkey Agar
• Isolasi pada Blood Agar
ENZIM
• Pada tahun 1878, ahli fisiologi Jerman Wilhelm
Kühne (1837–1900) pertama kali menggunakan istilah
"enzyme", yang berasal dari bahasa Yunani ενζυμον yang
berarti "dalam bahan pengembang" (ragi), untuk
menjelaskan proses ini.
Sumber: Wikipedia.org/Enzim
ENZIM dan FUNGSI
• Katalis proses biologi Hidrolisa pada komponen organik
kompleks dan oksidasi pada komponen yang sederhana
• Terdapat lebih dari 2000 enzim yang telah diketahui
• Umumnya, berukuran lebih besar dibandingkan substrat
• Di dalam sel, sejumlah enzim diproduksi dalam nukleus sel
saat biosintesis protein terus menerus tanpa menghiraukan
lingkungan tempat sel berkembang
• Jika berada dalam media yang tidak sesuai, sel dapat
menghasilkan enzim adaptif
• Beberapa contoh enzim:
• Alkaline protease disekresi secara alami oleh Bacillus
licheniformis dalam proses pemecahan senyawa protein
• Bacillus licheniformis secara alami mensekresi ά amylase yang
dapat memecah pati
• Jamur Aspergillus memproduksi enzim glucoamylase
• Jamur Trichoderma & bakteri Celulomonas menghasilkan enzim
asam cellulase yang memecah selulosa menjadi glukosa
SIFAT UMUM ENZIM
• Biokatalisator Mempercepat jalannya
reaksi tanpa ikut bereaks (> 1020 x lebih
cepat)i
• Termolabil Bila dipanasi melebihi suhu
kritis, enzim mengalami denaturasi
(kerusakan)
• Dibutuhkan dalam jumlah sedikit
• Dapat digunakan berulang-ulang
Setelah produk terbentuk, enzim
terbebaskan kembali
• Umumnya bekerja mengkatalisis reaksi
satu arah
• Spesifik Bagian yang aktif (permukaan
tempat melekatnya substrat) hanya
setangkup dengan permukaan substrat
tertentu
TIPE ENZIM
• Bahan yg dikatalisa:
Maltase
Sucrase – penguraian sukrosa
C12H22O11 + H2O 2 C6H12O6
Lipase – penguraian lemak
Amilase – penguraian amilum
REAKSI ENZIMATIS
• Kombinasi enzim dengan
substrat spesifik untuk
membentuk kompleks enzim-
substrat dalam konsep
“lock&key” sebelum
membentuk produk baru
• Reaksi enzimatik merupakan
reaksi kimia reversibel.
• Reaksi tergantung pada
konsentrasi substrat (S),
enzim (E), produk (P).
MEKANISME REAKSI ENZIMATIS
CARA KERJA ENZIM
• Jumlah energi yang diperlukan untuk
mencapai kondisi teraktifasi atau fase
transisi dari suatu molekul substrat
pada suhu tertentu
pH
Suhu
Inhibitor
HUBUNGAN SUBSTRAT DENGAN
KECEPATAN PERTUMBUHAN
HUBUNGAN KONSENTRASI SEL
TERHADAP WAKTU
SUHU
• Hampir semua laju reaksi
enzimatik meningkat menjadi 2
x lipat pada setiap kenaikan 10
C hingga batas kestabilan
enzim.
Pada suhu 70˚C, sebagian
besar enzim menjadi inaktif
Jika suhu meningkat, denaturasi
lebih mudah terjadi
• Suhu optimum umumnya
berada pada kisaran 40-60 ⁰C
Suhu optimum beberapa enzim
100 ⁰C
PH
• Enzim peka terhadap
perubahan pH
• Semua enzim mempunyai
kisaran pH optimum untuk
aktivitas
• Enzim aktif hanya di kisaran pH
kecil
• Untuk kebanyakan enzim, pH
optimum berada dalam kisaran
5-7
Pada pH terlalu tinggi atau
rendah, enzim mengalami
denaturasi
INHIBITOR
• Zat selain substrat yang dapat membentuk kompleks dengan
enzim
Contoh : logam berat, zat organik, zat anorganik, dll
• Dapat mengurangi kuantitas enzim sehingga produk berkurang
• Enzim mudah mengalami inaktivasi (denaturasi) dengan
adanya keberadaan inhibitor
• Menghambat reaksi enzimatik
• Dapat berikatan dengan enzim
COMPETITIF INHIBITOR
• Inhibitor akan berikatan pada
active site yang sama dengan
substrat, namun peristiwa ini tidak
dapat berlangsung pada waktu
yang sama.
• Dapat bereaksi bolak balik dengan
enzim, membentuk senyawa
kompleks enzim-inhibitor (EI)
E + I EI
• Dapat diatasi dengan menambah
konsentrasi substrat untuk
mencapai laju reaksi maksimum.
NONCOMPETITIF INHIBITOR
• tipe penghambatan enzim dimana
penghambat menurunkan aktifitas dari
sebuah enzim dengan berikatan
dengan enzim pada sisi aktifnya
namun tidak pada sisi aktif tempat
dimana substrat juga berikatan
dengan enzim.
• Tidak berikatan dengan enzim yang
bebas.
ES + I ESI
• Penambahan substrat mengakibatkan
peningkatan derajat inhibisi
• Jarang terjadi pada reaksi enzimatik
satu substrat.
UNCOMPETITIF INHIBITOR
• terjadi ketika inhibitor hanya
dapat terikat pada kompleks
enzim-substrat. Target
inhibitor bukan pada enzim
bebas, namun ketika enzim
dan substrat telah berikatan.
Enzyme Kinetics
Enzyme activity
Student A
Score
Student B
Student C
0 1 2 3 4 0 1 2 3 4
Exam Chapters Substrate concentration
20
0
0 2 4 6 8
Substrate (mmole)
Juang RH (2004) BCbasics
Essential of Enzyme Kinetics
E + S E S E +P
In steady state, the production and consumption of
the transition state proceed at the same rate. So the
concentration of transition state keeps a constant.
Juang RH (2004) BCbasics
Constant ES Concentration at Steady State
S
P
Concentration
ES
E
Reaction Time
Juang RH (2004) BCbasics
Penurunan k1 k3
Persamaan E S E S E P
k2
Michaelis Menten
Berdasar Asumsi Kesetimbangan Berdasar Asumsi Pseudo-Steady-State
𝑉𝑚 𝑆 𝑉𝑚 𝑆
𝑣= 𝑣=
𝐾′𝑚+ 𝑆 𝐾′𝑚+ 𝑆
• Dengan • Dengan
• 𝑉𝑚 = 𝑘3 𝐸0 • 𝑉𝑚 = 𝑘3 𝐸0
𝑘2 𝑘2 +𝑘3
• 𝐾′𝑚 = • 𝐾′𝑚 =
𝑘1 𝑘1
Enzyme Kinetics
Direct plot Significance
kcat /Km Vmax [S] zero order
vo=
Km + [S] 1st order
kcat Observe vo change
E3
Turn over under various [S],
E2
number resulted plots
E1
yield Vmax and Km
Inhibition
min
Non-competitive
Specific Activity Bi-substrate reaction also
unit Activity follows M-M equation, but
mg one of the substrate should
be saturated when estimate Uncompetitive
the other
Juang RH (2004) BCbasics
Significance of Enzyme Kinetics
v0 = Vmax × K = k3 [Et] × K
enzyme concentration
zero order
Proportional to
E3
E2
1st order E1
[S] = Low → High [S] = Fixed concentration
Juang RH (2004) BCbasics
Km : Affinity with Substrate
k1 k3
E+S ES (v ) E + P
k2 o
=
– –
H3C–C–N–C–C–O–CH3
–
H H
R= kcat / Km
Glycine –H 1.3 ╳ 10-1
Norvaline –CH2–CH2–CH3 3.6 ╳ 102
(M-1 s-1)
Adapted from Mathews et al (2000) Biochemistry (3e) p.379
Enzyme Activity Unit
S → P mmole
Product [P]
t
vo = [P] / min Slope
tan
Unit = mmole/min 0 10 20 30 40
Reaction time (min)
6 0.21
0.1 8 0.214
B 10 0.23
B
0.05 Km
Km ~ 1.3 mM
0 Vmax ~ 0.25
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
[S]
PENENTUAN KM DAN VMAX
14
B [S] Vo
12 2.000 13.333
B 1.333 11.111
10 0.500 6.579
0.250 5.102
8 0.167 4.762
Vo
0.125 4.673
B
6 0.100 4.348
BBB
4 B
-1/Km = -0.8
2 Km = 1.23 mM
1/Vmax = 4.0
0 B
-1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 Vmax = 0.25
[S]
PENENTUAN KM DAN VMAX
• Metode Eadie-Hofstee:
𝑣
𝑣 = 𝑉𝑚 − 𝐾𝑚
[𝑆]
A plot of v versus v/[S] results in a line of slope –Km and y-axis
intercept of Vm
• Metode Hanes-Woolf:
[𝑆] 𝐾𝑚 1
= + [𝑆]
𝑣 𝑉𝑚 𝑉𝑚
A plot of [S]/v versus [S] results in a line of slope 1/Vm and y-axis
intercept of Km/Vm
Enzyme Inhibition Kinetics (Mechanism)
E S I I
I
Compete for S I
Inhibitor active site Different site
→ ES → E + P
E + S← E + S←→ ES → E + P → ES → E + P
E + S←
Equation and Description
+ + + +
I I I I
↓↑ ↓↑ ↓↑ ↓↑
EI EI + S →EIS EIS
[I] binds to free [E] only, [I] binds to free [E] or [ES] [I] binds to [ES] complex
and competes with [S]; complex; Increasing [S] can only, increasing [S] favors
increasing [S] overcomes
not overcome [I] inhibition. the inhibition by [I].
Inhibition by [I].
Glucose Km = 8 X 10-6
Hexose Kinase Allose Km = 8 X 10-3
Glucose + ATP <-> Glucose-6-P + ADP Mannose Km = 5 X 10-6
KURVA PERTUMBUHAN BAKTERI
• Reaksi enzimatis:
Substrat (S) + Cell (X) Produk (P)
• Menghitung laju pertumbuhan bakteri:
1 𝑑𝑋
= 𝜇𝑛𝑒𝑡𝑡
𝑋 𝑑𝑡
Dimana:
X : konsentrasi sel bakteri
dX/dt : laju perubahan konsentrasi sel bakteri
mnett : konstanta pertumbuhan netto konstanta
pertumbuhan kotor (mgross) – konstanta kematian
(kD)
𝜇𝑛𝑒𝑡𝑡 = 𝜇𝑔 − 𝑘𝑑
PERSAMAAN MONOD
• Model Monod adalah salah satu persamaan matematis yang
merepresentasikan pertumbuhan bakteri yang dibatasi oleh
konsentrasi substrat
𝜇𝑚𝑎𝑥 𝑆
𝜇𝑔 =
𝐾𝑠 + 𝑆
Dengan:
mgross : laju pertumbuhan kotor (mgross)
mmax : laju pertumbuhan maksimum
S : konsentrasi substrat
Ks : Konstanta kejenuhan
DOUBLING TIME
• Waktu yang dibutuhkan bakteri untuk melipatgandakan
massanya.
• Doubling time dapat dihitung dengan persmaan:
ln 2
𝜏𝐷 =
𝜇𝑛𝑒𝑡𝑡
Dengan:
D : doubling time
mnett : konstanta pertumbuhan netto
KOEFISIEN Y
• Konsep dan definisi dari koefisien Y mirip dengan konsep Yield,
yaitu perbandingan produk terhadap bahan bakunya
• Jika dalam konsep mikrobiologi, koefisien Y didefinisikan
sebagai perbandingan massa sel yang terbentuk terhadap
substrat yang dikonsumsi
• Secara matematis dapat dituliskan persamaan:
∆𝑋 𝑑𝑋ൗ 𝑑𝑋 𝑑𝑆
=𝑌↔ 𝑑𝑡 = 𝑌 𝑎𝑡𝑎𝑢 =𝑌 −
−∆𝑆 − 𝑑𝑆ൗ𝑑𝑡 𝑑𝑡 𝑑𝑡