Immunoassays

Tehnik ELISA
 Pendahuluan

• Immunoassay merupakan metode uji dengan

menggunakan reaksi antibodi dan antigen sebagai
cara yang menghasilkan produk yang dapat diukur.

• Kompleks antibodi:antigen juga dikenal sebagai

immuno-complex.
 “Immuno”& “assay”
• “Immuno” berarti suatu respon imun yang
menyebabkan badan menghasilkan antibodi
• dan
• “assay” berarti uji, sehingga immunoassay
merupakan uji dengan menggunakan imuno-
kompleks dengan reaksi antibodi dan antigen
• Immunoassay berbeda dengan uji
laboratorium jenis lain, seperti uji kolorometri,
karena menggunakan kompleks
antibodi:antigen untuk menghasilkan signal
yang dapat diukur

• Beda, dengan uji kimia klinik rutin

menggunakan reaksi kimiawi antara reagen
(larutan kimia) dan sampel pasien untuk
menghasilkan hasil uji
 Immunoassay: Antibodi, Antigen dan
Analit tertentu

• Antibodi merupakan suatu protein yang

diproduksi oleh tubuh sebagai respon terhadap
senyawa asing yang masuk dalam tubuh.

• Antibodi diproduksi sebagai bagian respon imun

tubuh untuk menjaga diri. Sebagai contoh, uji
immunoassay untuk adanya antibodi molekul
kanker. Jika ada antibodi, berati ada sel kanker.
 Ikatan Antibodi Antigen
Epitop

Antigen

Antibodi

ANTIGEN = ANTIbody GENerating

Setiap antigen mempunyai beberapa epitop

Setiap Antibodi mengenal Satu epitope spesifik
 Antigen
• Antigen merupakan senyawa yang
menyebabkan badan berusaha
mengeliminasi atau mengurangi dengan
menaikkan respon imun.
• Beberapa uji immunoassays untuk antigen
langsung, bukan mengukur antibodi.
Sebagai contoh, uji utk mengukur
konsentrasi obat. Dalam hal ini obat sebagai
antigen yang berikatan dengan antibodi.
 Analit
• Analit merupakan suatu senyawa yang
diukur oleh suatu metode uji. Pada uji
immunoassay, analit dapat berupa
antibodi, atau antigen.
 Immunoassays
• Immunoassays menggunakan satu antibodi
atau lebih untuk mendeteksi analit tertentu.
Analit yang diukur mungkin berupa senyawa
yang secara alami terdapat dalam badan,
seperti hormon tiroid, atau yang dibuat badan
oleh badan tetapi tidak biasa, seperti suatu
antigen kanker, atau senyawa yang
umumnya tidak terdapat dalam badan,
seperti obat
 Antibodi

• Antibodi menunjukkan
a) spesifisitas
dan
b) afinitas tinggi
antigen spesifik. Ikatan spesifik antara antibodi
dan antigen menyebabkan deteksi analit dengan
berbagai metode immunoassay.
 Struktur Antibodi

• Antibodi (Ab) merupakan jenis protein

yang dinamakan immunoglobulin.
• Paling umum adalah immunoglobulin G
(IgG).
• IgG merupakan protein yang tersusun oleh
dua bagian utama: bagian protein
structural dan fungsional
 Struktur IgG

Variabel: setiap antigen

berbeda
Konstan: sama pada setiap
inang
Fab (mis., semua kelinci ~ Fc, bagian
konstannya sama)

Antigen mempunyai lokus

Fc
penempelan terdiri dari
VH+VL
Setiap molekul mempunyai
2 lokus penempelan Ag
 Preparasi Antibodi Poliklonal dan
Monoklonal
• Antibodi dapat berupa antibodi poliklonal atau
monoklonal

• Antiserum poliklonal (serum darah yang

mengandung antibodi tertentu yang diinginkan)
biasanya dari kambing, domba, atau kelinci
 Cont’ed
• Hewan menghasilkan antiserum – sebagai
mekanisme pertahanan jika terpapar oleh suatu
antigen.
• Antiserum mengandung campuran antibodi,
masing-masing berikatan dengan lokus
pengenalan antigen berbeda, atau epitop.
 Pembuatan antiserum
• Proses pembuatan antiserum dimulai dengan
mengijeksikan larutan yang mengandung antigen
tertentu pada hewan. Antigen tersebut kadang dinamakan
immunogen, karena senyawa tsb memacu respon imun.
Setelah waktu tertentu, dan dalam beberapa kasus
dengan injeksi ulang, sistem imun hewan memproduksi
antibodi terhadap antigen yang diinjeksikan.
Darah dikumpulkan dari hewan itu, dan serum diisolasi
dari darah. Serum ini biasanya kaya akan antibodi yang
mengenali antigen itu, dan dinamakan antiserum.
 Antibodi poliklonal
• Antiserum biasanya mengandung campuran
antibodi yang mengenal dan berikatan dengan
antigen yang sama, tetapi mereka dapat berikatan
dengan epitop yang berbeda.
• Suatu antigen yang mempunyai banyak lokus
untuk antibodi berikatan dinamakan suatu antigen
multivalen. Jenis antibodi ini, terdapat sebagai
campuran berbagai antibodi, dinamakan antibodi
poliklonal.
 Antibodi Monoklonal
• Antibodi Monoklonal berbeda dengan antibodi
poliklonal dalam hal mereka sangat spesifik untuk
satu epitop pada antigen multivalen. Mereka
diproduksi dari satu jenis sel dengan menggunakan
teknologi hibridoma dan jenis sel myeloma tikus
(mouse myeloma cell lines).
• Hibridoma adalah sel tumor penghasil antibodi
yang memproduksi antibodi yang sama dalam
jumlah besar dan mudah tumbuh pada biakan sel di
laboratorium.
 Keuntungan
• Keuntungan antibodi monoklonal adalah jenis sel
hibridoma yang menghasilkan AbM bersifat
“immortal” dan dapat memproduksi antibodi yang
sama terus menerus tidak terhingga.
• Antisera poliklonal diproduksi oleh hewan yang
imunisasi dapat bervariasi dari satu hewan dengan
hewan lainnya, dan antiserum tertentu itu tidak
dapat diperoleh lagi jika hewan tunggal itu
meninggal.
 Prosedur
Hibridoma diproduksi dalam prosedur berbagai tahap :
• injeksi suatu antigen specifik pada hewan inang (biasanya
tikus);
• isolasi sel penghasil antibodi (sel B) dari limpa tikus;
• fusikan sel B ini dengan sel tumor jenis tertentu yang
mudah tumbuh dalam biakan dan menghasilkan antibodi;
• isolasi hibridoma itu (sel fusi) yang menghasilkan
antibodi spesifik untuk antigen yang diinginkan.
 Pada immunoassays
• Pada immunoassays, baik antibodi monoklonal dan
poliklonal digunakan untuk deteksi antigen, masing-
masing dengan kekuatan spesifik untuk penggunaan
tertentu.
• Immunoassays yang mendeteksi antibodi dalam
sera pasien seperti deteksi antibodi poliklonal yang
dihasilkan oleh sistem imun pasien.
 ELISA:
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

96-well
microtiter Volume kecil
plate
Pereaksi yg
Dapat digunakan
dilakukan sedikit
beberapa uji
pada satu
plate

Dapat menggunakan Ab terikat utk kuantifikasi

antigen terlarut atau menggunakan antigen terikat
utk kuantifikasi serum Ab
 Scoring ELISA

• Bandingkan warna thdp kontrol positif

dan kontrol negatif
• Perhatikan rentang warna biru tua
• Semakin besar rentang warna, semakin
tinggi konsentrasi antibodi
• Konsentrasi antibodi tertinggi dalam
sampel berarti terinfeksi
 Katagori Metodologi Immunoassay

• Metodologi immunoassay meliputi:

• immunoassay noncompetitif dan competitif ,
dan

• Immunoassay homogenus dan heterogenus

 Material terlabel

• Semua immunoassays memerlukan penggunaan

material terlabel supaya dapat diukur jumlah antigen
atau antibodi yang terdapat.
• Label merupakan suatu molekul yang akan bereaksi
sebagai bagian dari uji ini, sehingga perubahan
signal dapat diukur dalam larutan darah:pereaksi.
 Contoh label
• Contoh suatu label meliputi senyawa radioaktif,
suatu enzim yang menyebabkan perubahan warna
larutan, atau senyawa yang menghasilkan warna.
• Label dapat ditambahkan selama pembuatan
pereaksi atau pada antibodi atau antigen.
• Teknologi immunoassay menggunakan format
berbeda untuk membedakan ikatan kompleks
antigen-antibodi dari label tidak berikatan.
 Immunoassay Kompetitif dan
Nonkompetitif

• Pengukuran analit pada immunoassay dapat

diperoleh dengan menggunakan pola

kompetitif
atau
nonkompetitif .
 Pola Kompetitif

• Pada pola kompetitif ,

• analit tidak terlabel (biasanya antigen) dalam
sampel uji diukur dengan kemampuannya
bersaing dengan antigen berlabel pada
immunoassay.
• Antigen takberlabel menghalangi kesempatan
antigen berlabel berikatan dengan antibodi
karena sudah berikatan.
 Con’ted
• Pada immunoassay kompetitif, jika jumlah berlabel
sedikit yang terukur berarti jumlah antigen
takberlabel (dalam sampel) banyak. Jumlah
antigen dalam sampel berhubungan terbalik
terhadap jumlah lebel terukur dalam format
competitif (Figure 1-7).
 Pola kompetitif satu langkah
• Pada pola kompetitif satu langkah (see Figure 1-8),
baik antigen berlabel (Ag*) dan tak berlabel (atau
sampel analit) bersaing untuk berikatan dengan
jumlah antibodi terbatas.
 Format kompetiti dua langkah

• Pada format kompetitif dua langkah, Konsentrasi

antibodi larutan pereaksi terdapat berlebihan
dibandingkan dengan konsentrasi antigen.
Pereaksi antibodi diinkubasi dengan sampel yang
mengandung antigen yang dicari; kemudian pada
langkah kedua, antigen berlabel ditambahkan.
Pada format kompetitif, antigen berlabel yang
berikan rendah menunjukkan bahwa jumlah
antigen yang terdapat dalam sampel tinggi. Pola
kompetitif dua langkah memberikan kepekaan
lebih baik daripada format satu langkah.
 Metode Nonkompetitif (Sandwich)

• Pola uji Nonkompetitif biasanya memberikan hasil

uji dengan kepekaan dan spesifitas tinggi dan
digunakan untuk mengukur analit penting seperti
marker hepatitis dan jantung. Pola ini termasuk uji
“sandwich” karena analit terikat (sandwiched)
antara dua macam antibodi yang spesifik (Figure 1-
10).
 Uji Nonkompetitif
• Pola Nonkompetitif dapat juga menggunakan
metode satu langkah atau dua langkah, seperti pada
kompetitif.
• Pada pola dua langkah menggunakan langkah
pencucuian pada kompleks ikatan diisolasi dan
dicuci untuk menghilangkan perekasi yang tidak
berikatan dan senyawa pengganggu lain.
• Pola nonkompetitif dua langkah biasanya
menghasilkan spesifitas dan kepekaan tertinggi
daripada pola lain.
 Metode Immunoassay Homogenus
dan Heterogenus
• Metode Immunoassay yang memerlukan pemisahan
kompleks Ab-Ag* complex termasuk sebagai
immunoassay heterogenus. Sedangkan yang tidak
memerlukan pemisahan termasuk sebagai
immunoassay homogeneous.
• Metode Homogenus biasanya digunakan untuk
mengukur analit dalam jumlah kecil, seperti pada
penyalah gunaan obat dan pengobatan. Metode
homogenus tidak memerlukan pemisahan Ab-Ag*
dari Ag* bebas. Metode umumnya lebih mudah dan
lebih cepat.
 Competitive
Immunoassays
CompetitiveELISA
ELISA
Immunoassays

no antigen:

Competitive ELISA

color developed
some antigen:

a lot of antigen:

amount of antigen (drug) in sample

 Sandwich
SandwichELISA
ELISA

Pada sandwich ELISA intensitas warna yg terjadi berbanding

lurus dg jumlah antigen yg terdapat dlm sampel:

Sandwich ELISA
Tidak ada antigen
dlm sampel:

Intensitas warna
ada antigen dlm
sampel:

banyak antigen
dlm sampel:
Jumlah antigen (obat) dlm sampel
 Pregnancy Testing
Assay for human chorionic gonadotrophin

1. Bioassay (Rabbit Test)

2. Agglutination inhibition
Agglutination Inhibition Assay for HCG
 Pregnancy Testing
Assay for human chorionic gonadotrophin

1. Bioassay (Rabbit Test)

2. Agglutination inhibition

3. ELISA
HCG
Test
Control HCG
Example:
Pregnancy
Test
COVID-19
PCR Test
Rapid Test
Karakteristik Ig
TERIMA KASIH