Kromatografi Kolom Terbuka

Sistem pemasukan sampel: manual, tidak

Color volumetrik  Injector
Waktu analisis lama, mengandalkan gaya
grafitasi dan kapiler  pompa
Hasil pemisahan kurang baik 
pengemasan kolom
Kesulitan Pengamatan hasil pemisahan
untuk analit tidak berwarna  Detektor
Kesulitan penghitungan kadar  integrator
KCKT dikembangkan dari kromatografi kolom terbuka
untuk menjawab kekurang-kekurangan tersebut

Injector: Sistem pemasukan sampel: sample loop dan

robotik injektor, sangat volumetrik
Pompa: Waktu analisis singkat, pengulangan/presisi baik
Kolom: baja, packing kompak, partikel sangat kecil,
tekanan dapat dibuat besar  Hasil pemisahan baik
Detektor: semua zat dapat diamati (tidak harus berwarna)
Integrator:dilengkapi komputer,  mudah penghitungan
kadar 

Sehingga disebut: Kinerja Tinggi

 BAGAN SISTEM KCKT

detektor

kolom
injektor
pompa oven

Wadah
solven
integrator
WADAH FASE GERAK

Merupakan tandon berisi fase gerak

Mempunyai sistem penyaring
POMPA
Merupakan sistem agar fase gerak mengalir.
Kinerja pompa yang diinginkan :
 Tekanan yang dihasilkan tinggi

 Fluktuasi tekanan rendah

 Kecepatan aliran fase gerak tepat
INJEKTOR: Alat untuk pemasukan sampel ke
dalam sistem KCKT
OVEN KOLOM – instrumen pemanas
Syarat :
1. Keseragaman temperatur yang baik
2. Kestabilan temperatur yang baik
3. Ketepatan kontrol temperatur yang baik
Kolom pada KCKT

> Penampang: baja tahan karat, tahan tekanan tinggi

Ukuran partikel sangat kecil: pengepakan lebih
kompak, hasil pemisahan lebih baik
Dapat dipakai berulang
 Metode Pemisahan Umum dalam HPLC
Fasa normal
Kolom (silika yang sangat kecil
dan pelarut non polar misalnya
heksan). Sebuah kolom sederhana
dg i.d <4.6 mm dan panjang 150-
250 mm.
 Senyawa-senyawa polar dalam
campuran melalui kolom akan
melekat lebih lama pada silika yang
polar dibanding dg senyawa-
senyawa non polar,sehingga
senyawa non polar akan lebih
cepat melewati kolom.
 Fasa gerak non polar Fasa diam
polar
Fasa terbalik (RP-HPLC)
Kolom (silika dimodifikasi menjadi
non polar melalui pelekatan rantai
hidrokarbon panjang C8 atau C18
pada permukaannya secara
sederhana dan pelarut polar (misal
campuran air dan alkohol seperti
metanol).
 Molekul-molekul polar akan
bergerak lebih cepat melalui
kolom.
 Fasa gerak polar Fasa diam non
DETEKTOR HPLC

Yang umum dipakai

 Detektor Ultraviolet / Visible (UV/VIS)
 Detektor Photodiode Array (PDA)
 Detektor Fluorescence (RF)
 Detektor Konduktivitas (CDD)
 Detektor Refraktive Indeks (RID)
 Detektor Elektrokimia (ECD)
 Detektor spektrometer massa
DETEKTOR SPEKTROFOTOMETER UV/VIS

Prinsip: penyerapan sebagian energi (hv) oleh molekul

pada panjang gelombang tertentu => tereksitasi elektronik

Eksitasi elektronik
kuvet
Ein Eout

l
Hk.Lambert-Beer
ACl= - log (Eout / Ein)
ACl= - log (Eout / Ein)
absorbansi

1 Kisaran linear

konsentrasi
Pemilihan pjg gelb.: quantitative / preparative?
275 nm
208 nm

275 nm
208 nm
Detektor Photodiode Array

Sample Cell Grating

satu elemen dapat
Mendeteksi absorban
D2 / W lamp Pada satu pjg gelb..

512 Elements Photodiode Array

Detektor Photodiode Array : Kromatogram 3D
Spektrum
kromatogram
Absorbansi

.
elb
gg
an
nj
Pa

waktu
Detektor Photodiode Array
 Puncak dapat di identifikasi dengan spektrum UV.
 Pemeriksaan kemurnian puncak dapat dilakukan.
--overlap 3 spektrum
--rasio kromatogram
Detektor Spektrofluoresen

Excitation Wavelength

+ h1 *
* h2+
A* Emission Wavelength
h1 h2
Fluorescence
A A
Rancangan Cell untuk detektor Fluorescence
 Detektor Refraktive Indeks

Sistem optik
Detektor Refraktive Indeks
 BAGIAN DARI SISTEM HPLC

Kromatogram gula
 Analytical Conditions
 Column : Shim-pack CLC-NH2
 Mobile phase : Acetonitrile / water

=7/3
 Flow rate : 1.0 mL/min
 Temperature : Ambient
 Peaks
1. Glycerol
2. Xylose
3. Fructose
4. Glucose
5. Sucrose
6. Manose
7. Lactose
Detektor Konduktifitas
V K (conductivity) = I [A] / E [V]
I =A [cm2] / L [cm] * k
(k : specific conductivity)

A A k= (I/E)*(L/A)
L elektroda
Detektor Konduktifitas
 Konduktifitas sangat dipengaruhi temperatur.
 Cell harus diletakkan pada kondisi temperatur
terkontrol
Perbandingan detektor
UV/ VIS RF RID CDD ECD
LOD 10 ppb 10 ppt 100 ppb 10 ppb 100 ppt
GC Yes Yes No No No

LOD : Limit deteksi (S/N=3)

GC : Gradient Compatibility
Kromatogram anion dalam air laut
 Analytical Conditions
 Column : Shim-pack IC-A3
 Mobile phase :

8.0 mM p-hydroxybenzoic acid

3.2 mM Bis-Tris *
 Flow rate : 1.5 mL/min
 Temperature : 40 C
 Injection Volume : 100 uL
 Peaks
 1. F (1.4 ppm)
 2. Cl (10200 ppm)
 3. NO2 (10 ppm)
 4. Br (43 ppm)
 5. NO3 (44 ppm)
 6. SO4 (431 ppm)

Bis-Tris : bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane

Contoh kromatogram KCKT
Aplikasi KCKT
Preparative & Analytical Liquid
Chromatography

• Bidang farmasi
• Bidang kimia
• Bidang biokimia
• Bidang
kedokteran
• RP-HPLC
• KPI.
 Solvent dalam KCKT

• N-heksana • Propanon
• Sikloheksana • Asetonitril
• Tetraklorometan • Iso-propanol
a • Etanol
• Metilbenzena • Metanol
• Triklorometana • Asam etanoat
• Diklorometane • Air
• THF
 Fasa diam dalam KCKT

 Bonded phases: Polimer phases:

• ODS (oktadesilsilika, •Cross-linked styrene
C18) atau DVB
• Oktilsilika
• Propilsilika
• Aminopropil
• Asam sulfonat • Untuk Eksklusi
• Amina kuartener atau Pertukaran
Ion