Chordata

Isolasi
Isolasi Dan
Dan Karakterisasi
Karakterisasi Aktivitas
Aktivitas Aktivitas
Aktivitas Antitrombin
Antitrombin Low
Low Heparin
Heparin Dari
Dari
Styela
Styela plicata
plicata (Chordata-tunicata).
(Chordata-tunicata). Efek
Efek Trombosis
Trombosis Yang
Yang Jelas
Jelas Pada
Pada Model
Model
Vena
Vena Dan
Dan Arteri
Arteri

Oleh :
Fairuz Syafira Rahmah (1608109010017)
Riska Fitria (1608109010013)
 Chordata
Chordata adalah filum dari kelompok hewan vertebrata (hewan yang memiliki tulang belakang) dan
beberapa binatang yang mirip invertebrata yang memiliki ciri ciri yang serupa. Semua anggota
kelompok ini dalam hidup mereka memiliki notokorda, tali saraf dorsal berongga, celah faring
(pharyngeal slits), endostyle dan ekor berotot yang melewati anus.
Chordata meliputi hewan-hewan yang memiliki ciri-ciri sebagai berikut :
• Memiliki notokord, yaitu kerangka berbentuk batangan keras tetapi lentur. Notokord terletak di antara
saluran pencernaan dan tali saraf, memanjang sepanjang tubuh membentuk sumbu kerangka.
• Memiliki tali saraf tunggal, berlubang terletak dorsal terhadap notokord, dan memiliki ujung anterior
yang membesar berupa otak.
• Memiliki ekor yang memanjang ke arah posterior terhadap anus.
• Memiliki celah faring
 Filum Chordata terbagi atas 5 subfilum

Subfilum
Subfilum
Hemichordata Cephalochordata
(Lancelet)
Subfilum Subfilum
Urochordata/Tun
Terbagi 2 Kelas : icata
Gnathostomata
Subfilum
Terbagi 1 Kelas : Agnatha
- Kelas Enteropneusta
- Kelas Leptocardii
- Kelas Pterobranchia
Terbagi 3 Kelas : Terbagi 2 Kelas :
Terbagi 2 Kelas : - Kelas
- Kelas Larvacea Placodermi
- - Kelas Ostracodermi
Kelas Ascidiacea - Kelas
- Kelas Thaliacea - Kelas Cylostomata Chondrichthyes
 Styela plicata
Styela plicata adalah tunica tropis ke subtropis yang telah menginvasi Teluk Meksiko dengan
menumpang lambung kapal. Berbentuk bulat telur keabu-abuan hingga kecokelatan. Ketika terganggu secara
fisik, Styela plicata mengeluarkan air, disebut semprotan laut atau muncrat laut.

Klasifikasi :
• Kingdom : Animalia
• Filum : Chordata
• Subfilum : Tunicata
• Kelas : Ascidiacea
• Ordo : Stolidobranchia
• Famili : Styelidae
• Genus : Styela
• Spesies : Styela plicata
 Ciri – Ciri
1) Habitat
 Tahap larva dan remaja : Styela plicata hidup di laut dan dermaga, terumbu
tiram, batu dan puing-puing kayu kasar
 Tahap dewasa : Styela plicata hidup di laut, dermaga dan substrat berbatu
keras
 Styela plicata juga hidup di habitat terumbu karang dan ditemukan dari zona
intertidal rendah hingga kedalaman 30m.
2) Reproduksi
 Styela plicata mengalami siklus reproduksi setiap tahun bersamaan dengan
perubahan suhu tahunan. Fertilisasi bersifat eksternal; telur dan sperma
dilepaskan ke kolom air pada sore hari dan berubah menjadi larva kemudian
menetas keesokan paginya dan menetap pada hari itu.
3) Nutrisi
 Styela plicata memangsa terutama fitoplankton, zooplankton dan bahan
organik. Sedangkan Siput, Krustasea, Bintang laut dan ikan telah diketahui
memangsa S. plicata
Step 1 Step 2 Step 3
• Diambil Tubuh ascidia yang • Tubuh ascidia yang telah beku/kering • Campuran yang telah diinkubasi
terpisah dari cangkang, yang telah diambil sebanyak 1 gram lalu disentrifugasi (2000 × g selama
dibuang • Lalu disuspensikan dalam 20 ml 0,1 M 10 menit pada suhu kamar)
• Tubuh ascidia dipotong kecil-kecil larutan penyangga natrium asetat (pH • Supernatan terpisah dan
• Dan direndam dalam aseton dan 5,5) endapannya diinkubasi dengan
disimpan selama 24 jam pada suhu • Dan dimasukkan 100 mg papain, 5 papain sebanyak dua kali, seperti
4 °C. mM EDTA, dan 5 mM sistein dan yang dijelaskan sebelumnya.
diinkubasi pada 60°C selama 24 jam
Step 4 Step 5 Step 6
• Setelah diinkubasi, dilakukan • Selanjutnya dilakukan • lalu diambil endapan yang
sentrifugasi kembali, sehingga pengendapan dengan cara terbentuk kemudian dikumpulkan
diperoleh supernatan sentrifugasi (2000 × g dan dikeringkan dengan teknik
• Supernatan yang jernih mengandung selama 10 menit pada freeze dried.
polisakarida yang kemudian suhu kamar) • Hasil ekstraksi berupa glycans
ditambahkan dengan 2 vol etanol 95 %
 Analisis Elektroforesis
Analisis Elektroforesis Gel Agarosa
• Glycans mentah dari tubuh atau heparin murni dari Styela
plicata diinkubasi dengan GAG lyases, lalu dianalisis Elektroforesis adalah metode pemisahan atau analisis
dengan elektroforesis gel agarosa. fisika berdasarkan migrasi partikel bemuatan yang
Pembuatan Gel Agarosa terlarut atau terdispersi dalam larutan elektrolit dengan
• Panaskan bubuk agarosa 0,5 % dengan menambahkan bantuan medan listrik.
buffer 0,05 M 1,3-diaminopropane asetat (pH 9.0)
• Glycans, dan campuran GAG standar, mengandung
kondroitin sulfat, dermatan sulfat dan heparan sulfat (1,5 Analisis Elektroforesis Gel Poliakrilamida
μg sebagai asam uronat) masing-masing diaplikasikan ke
gel agarosa dan dilakukan elektroforesis selama 1 jam
• Sebanyak 10 μg sampel diaplikasikan pada plat poliakrilamida
pada 110 mV.
6% setebal 1 mm
• Setelah dielektroforesis, glikan difiksasi dengan air 0,1%
• Setelah dielektroforesis pada 100 V selama 1 jam dengan fase
larutan cetylmethylammonium bromide dan diwarnai
gerak 0,06 M natrium barbital (pH 8,6), gel ini digunakan
dengan 0,1% toluidine biru dalam asam asetat / etanol /
dengan penampak bercak 0,1% toluidine biru dalam asam
air (0,1: 5: 5, v / v).
asetat 1%.
• Setelah pewarnaan, gel dicuci semalaman dalam 1% asam
asetat.
 Hasil

 Styela aplicata dipisahkan atau dipecahkan dengan menggunakan 3

enzim proteolitik.
 Polisakarida yang didapat dari ekstraksi di endapkan dengan etanol dan
dianalisis secara elektroforesis dengan menggunakan gel agragosa.
 Pita metakromatik yang diperoleh menunjukkan glycan yang berbeda
yaitu Pita migrasi heparan sulfat standar (HS), dan dermatan sulfat
(DM).
 Ekstraksi pertama pita yang tersaji mendekati DS
 Ekstraksi kedua kaya akan HS akan tetapi terkontaminasi dengan DS
 Ekstraksi Ketiga terlihat jelas bahwa mengandung HS dan DS pada
pitanya.
PEMURNIAN HEPARIN

o Glycan yang diperoleh dari ketiga ekstraksi dari spesies Styela plicata
sebanyak 8 mg, mengandung campuran heparin dan dermatan sulfat
diaplikasikan pada sebuah Kolom Q-sepharose-FPLC, diseimbangkan
dengan 20 mM Tris / HCl buffer (pH 8,0).
o Lalu, glycan dielusi oleh gradien linier 3,0 M NaCl (150 ml) dengan laju
aliran 2,0 ml / menit. Fraksi 1,5 ml dikumpulkan dan diperiksa dengan uji
metakromatik menggunakan 1,9-dimethyl-methylene blue.
o Pecahan dielusi dengan konsentrasi NaCl yang berbeda dikumpulkan sebagai
puncak dan dalam denominasi P1, P2 dan P3. Puncaknya didialisis terhadap
air suling dan terliofilisasi.
o Glican sebanyak 2 mg diperoleh dalam fraksi P2 dari kolom Q-sepharose
diterapkan pada Mono QFPLC kolom, diseimbangkan dengan 20 mM Tris /
HCl buffer (pH 8,0).
o Lalu glican dielusi dengan linier gradien 0–3,0 M NaCl 45 ml pada laju
aliran 0,5 ml / menit. Fraksi 0,5 ml dikumpulkan dan diperiksa dengan uji
metakromatik, seperti yang dijelaskan atas.
o Glycan dielusi di tengah puncak dengan 21.2 M NaCl dikumpulkan seperti
ditunjukkan dalam Gambar 1D didialisis terhadap air suling dan terliofilisasi
 Hasil

• Terdapat 3 puncak, bernama P1, P2 dan P3, dielusi dari kolom

dengan konsentrasi NaCl yang berbeda.
• P1 terlihat puncak HS yang sangat rendah sehingga tidak digunakan
untuk pemurnian.
• P3 dilakukan dielusi dengan ion-exchange colomn yang mana fraksi
ini bebas dari kontaminasi, seperti yang ditunjukkan oleh pita
metakromatik homogen pada gel agarosa (Gbr. 1C).
• P2 diperkaya dengan HS, tetapi sedikit terkontaminasi DS. Sehingga
dilakukan pemurnian lebih lanjut.
 Continue

• Pemurnian dilakukan Ion-exchange

chromatography pada kolom Q Mono.
• HS-glycan dielusi dari kolom pada
konsentrasi NaCl yang sama (sebanyak
1,3 M). NaCl ini diperlukan untuk
mengelusi heparin.
• Hasil pecahan dielusi yang berada di
tengah puncak dikumpulkan dan
dianalisis dengan gel agarosa.
• Pita Metakromatik diperoleh ini
menjelaskan bahwa fraksi P2 bebas dari
kontaminasi DS dan digunakan dalam
percobaan selanjutnya.
Perlakuan Enzimatik

• Chondroitin lyases — sebanyak 50 μg Styela plicata

heparin yang dimurnikan diinkubasi dengan 0,01 U
ABC lyase dalam 0,1 ml 50 mM buffer Tris-HCl (pH 8,0),
dimasukkan 5 mM EDTA dan 15 mM natrium asetat.
Setelah inkubasi pada 37 °C selama 12 jam, campuran
tersebut dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa,
seperti yang dijelaskan sebelumnya.
• Lepra sulfat dan heparin — sekitar 50 ug (sebagai
berat kering masing-masing) dari Styela plicata yang
dimurnikan diinkubasi dengan 0,005 U dari kedua
heparan sulfat lyase atau heparin lyase dalam 100 μl
100 mM buffer natrium asetat (pH 7,0), dimasukkan
10 mM kalsium asetat selama 17 jam pada suhu 37 °C.
Di akhir masa inkubasi, campuran dianalisis dengan
elektroforesis gel agarosa, seperti yang dijelaskan
sebelumnya.
 Continue

 Setelah pemurnian, sekitar

2,6 mg bahan dilakukan
elektroforesis. Untuk
melihat tentang sifat glycan
dengan gel agarosa
elektroforesis.
 Hasilnya adalah Glycan HS
tahan terhadap aksi
chondroitin ABC lyases,
serta heparan sulfate lyase,
akan tetapi terdegradasi oleh
heparin lyase, hal ini
menunjukkan heprin
menyerupai
glikosaminoglikan.
 Sifat Anticoagulan
Tindakan antikoagulan diukur dengan aPTT (activated partial thromboplastin time) yang dilakukan dengan cara :
 plasma manusia normal (100 μl) diinkubasi dengan 10 μl larutan S. plicata heparin (HS) (0,01-100 μg) pada suhu 37 ° C selama 1 menit.
Kemudian 100 μl reagen APTT (Celite-Biolab) ditambahkan dan diinkubasi pada suhu 37 ° C. Setelah 2 menit inkubasi 100 μl 0,25 M
CaCl2 ditambahkan ke campuran dan waktu penggumpalan dicatat dalam koagulometer (Amelung KC4A).
 Penghambatan trombin atau faktor Xa oleh antitrombin pada ascidian atau S. heparin (HS)
HASIL
Sifat antikoagulan dari S. plicata heparin dievaluasi melalui uji aPTT menggunakan plasma manusia dan dengan mengukur penghambatan
trombin atau faktor Xa oleh AT dengan adanya peningkatan konsentrasi glycan S.plicata. Dengan menggunakan kurva standar paralel
berdasarkan aPTT aktivitas heparin mengandung 180 unit / mg, sedangkan aktivitas antikoagulan pada ascidian heparin sebesar 18 unit /
mg . Hal ini glycan ascidian dalam menghambat trombin dan faktor Xa dengan adanya AT mirip dengan heparin mamalia. Namun,
penghambatan total trombin atau faktor Xa oleh glycan ascidian itu dicapai dalam dosis yang sangat besar.
 Perlakuan pada hewan
Trombosis vena
• Aktivitas antitrombotik dari S. plicata heparin diprediksi pada tikus dengan tromboplastin otak sebagai
trombogenik stimulus.
• Tikus Wistar (kedua jenis kelamin, 300 g berat badan) disuntikkan secara intramuskuler injeksi ketamin 100
mg/kg berat badan dan Xylasin 16 mg/kg berat badan.
• Perut masing-masing hewan dibuka dan vena cava dibedah dengan hati-hati.
• Panjang pembedahan yang disiapkan 0,7 cm mulai tepat di bawah cabang dari vena ginjal kanan hingga setelah
vena ginjal kiri.
• S. plicata heparin di dosis 0,25-2,0 mg/kg berat badan (180 unit/mg) diberikan intravena 2,0 cm di bawah jahitan
longgar distal dan dibiarkan bersirkulasi selama 5 menit.
• Lalu, otak tromboplastin (5 mg/kg berat badan) secara perlahan disuntikkan intravena 1,0 cm di bawah jahitan
longgar distal dan segmen vena awalnya dijepit di situs proksimal dan kemudian di jahitan distal.
• Setelah 20 menit dari stasis, trombus terbentuk pada bagian yang tersumbat dan dicuci dengan natrium sitrat 5%,
dikeringkan untuk 1 jam pada 60 °C dan ditimbang. Setidaknya 5 hewan digunakan tiap kelompok.
• Berarti berat trombus diperoleh oleh berat rata-rata dari masing-masing kelompok. Hasilnya dinyatakan sebagai
persentase trombosis dan 100% dari trombosis mewakili berat rata - rata trombus pada tidak adanya jumlah
polisakarida.
 HASIL
 Pada heparin mamalia dengan dosis 0,25 mg/kgBB, terjadi penurunan trombosis
sebanyak 50% dan dengan 0,5 mg/kg BB terjadi penurunan trombosis lebih dari
95%.
 S. plicata heparin tidak efektif dalam penghambatan trombosis vena pada dosis
0,5 mg/kgBB hingga dosisnya diaikkan sebanyak 4 kali.
 Pada dosis 1 mg/kg BB, ascidian heparin mampu menghambat 80% trombosis.
Efek Pendarahan
Kesimpulan
• Pada S. plicata mengandung HS-Glycan yang mana sifatnya menyerupai
glikoaminoglycans yang memiliki efek antitrombin
• Sifat antikoaglan S.plicata yang didapat yaitu, dapat memberikan efek terapi
seagai koaguan dengan dosis yang tinggi.
• Penghambatan koagulan pada pembuluh vena tidak memberikan penuruan
trombosis. Aka tetapi pada arteri memberikan efe terapi yang sama dengan
heparin mamalia. Pada heparin mamalia dosis yang digunakan menyebabkan 2-
lipat hemoragik daripada dengan S.plicata. Oleh karena itu, heparin yang
diperoleh dari tubuh S. plicata akan memiliki tindakan terapeutik yang lebih
aman dalam pengobatan arteri trombosis dibandingkan heparin mamalia.
Thank You! 
Any Questions?