Contoh salah satu pelitian dengan penerapan metode :

BIOASSAY GUIDED ISOLATION

ISOLATION AND STRUCTURE ELUCIDATION OF TRACHEOSPASMOLYTIC
COMPOUNDS FROM Piper cubeba L.f FRUITS

ISOLASI DAN PENENTUAN STRUKTUR SENYAWA

TRAKEOSPASMOLITIK DARI BUAH Piper cubeba L.f
 LATAR BELAKANG

• MASALAH ASMA MERUPAKAN MASALAH YANG PERLU MENDAPAT

PERHATIAN DI DUNIA MAUPUN DI INDONESIA. KHUSUS DI
INDONESIA MASALAH YANG MENYANGKUT SESAK NAFAS INI
CENDERUNG MENINGKAT.
• ASMA, BATUK, SESAK NAPAS, RADANG, MUKUS KENTAL (Wrdlaw, 1993)
• BUAH KEMUKUS (PIPER CUBEBA) SECARA TRADISIONAL DALAM
BENTUK JAMU DIGUNAKAN OLEH MASYARAKAT UNTUK OBAT
SESAK NAPAS, PENGELUARAN LENDIR PADA BRONKITIS,
ANTISEPTIK PELANCAR SENI (Heyne, 1950, Dharma, 1981)

• EKSTRAK N-HEXANA DAN ETANOL MEMPUNYAI KEMAMPUAN

UNTUK MENGHAMBAT KONTRAKSI TRAKEA MARMUT TERISOLASI
YANG DIPENGARUHI OLEH PEMBERIAN METAKOLINA (Wahyuono,
dkk, 1999). OTOT POLOS TRAKEA COCOK UNTUK PENELITIAN
(Hooker, 1977; Veenendal, 1986)
• SPESIES PIPER LAIN MENGANDUNG SENYAWA NEOLIGNAN SEBAGAI
ANTAGONIS RESEPTOR platelet activating factor(paf= SALAH SATU
PENCETUS TIMBULNYA SESAK NAPAS) DIISOLASI DARI
P.FUTOKADSURA (Chang dkk., 1985) DAN PUBERELIN A,B,C DARI P.
PUBERULUM (Zhang dkk., 1995).
-KUBEBIN MERUPAKAN SENYAWA LIGNAN PERTAMA DITEMU-
KAN MENYUSUL KEMUDIAN DITEMUKAN LIGNAN YANG LAIN
SEPERTI HINOKININ, KLUSIN, DIHIDROKUBEBIN,
DIHIDROKLUSIN (Prabhu dan Mulchandani, 1985)

• JAMU SPESIAL DARI INDONESIA DIBUAT DARI BEBERAPA TA-

NAMAN, UNTUK PENCEGAHAN, PENGOBATAN, KESEGARAN MA-
UPUN KECANTIKAN (Beers, 2001; Sutrisno, 1996)

• PEMAKAIAN JAMU DENGAN JALAN DIGODOG ATAU DITAMBAH

DENGAN AIR PANAS DIMINUM (Beer, 2001)

• EKSTRAK DALAM AIR MENGANDUNG SENYAWA YANG

MEMBANTU MELARUTKAN SENYAWA KURANG POLAR
(Samuelson, 1999)
• UNTUK MENDAPAT NILAI TAMBAH JAMU DAPAT DIKEMBANG-
KAN MENJADI FITOFARMAKA (Pramono, 2002)
• FAKTOR IKLIM, CURAH HUJAN, PENYINARAN MEMPENGARUHI
KANDUNGAN SENYAWA DALAM TANMAN
(Evans, 2002, Samuelsson, 1999)
 PERMASALAHAN

• APAKAH BUAH KEMUKUS YANG SECARA TRADISIONAL DIGUNAKAN

UNTUK OBAT SESAK NAPAS DAPAT BERKHASIAT SEBAGAI TRAKEO-
SPASMOLITIK PADA OTOT POLOS TRAKEA MARMUT TERISOLASI

. BILA HAL TERSEBUT DAPAT DIBUKTIKAN SENYAWA APA YANG

TERKANDUNG DALAM KEMUKUS YANG BERKHASIAT SEBAGAI
TRAKEOSPASMOLITIK

• BAGAIMANA CARA EKSTRAKSI, ISOLASI , PEMURNIAN SERTA IDEN-

TIFIKASI SENYAWA AKTIF TERSEBUT

. APAKAH SENYAWA HASIL ISOLASI TERSEBUT BERPENGARUH SEBAGAI

ANTIINFLAMASI

.* APAKAH INFUSA BUAH KEMUKUS JUGA MEMPUNYAI KHASIAT

TRAKEOSPASMOLITIK

# APAKAH DALAM DAUN TANAMAN KEMUKUS JUGA MENGANDUNG

SENYAWA BIOAKTIF SEPERTI DALAM BUAH
 BAHAN DAN CARA KERJA
• TRAKEOSPASMOLITIK DAN
ELUSIDASI STRUKTUR SERBUK
• BAHAN UTAMA MAS.N-HEKSAN
• KEMUKUS DIAMBIL DARI BPTO
TAWANG MANGU
• BUAH TUA BELUM MASAK,
KERINGKAN DI OVEN TEMP. 50C
• MARMOT JANTAN BERAT 300-400 EKST.HEKSAN SISA/AMPAS
gr.
• ORGAN PERCOBAAN TRAKEA
MARMUT
KLT
• ALAT DAN BAHAN KIMIA
• SEPERANGKAT ALAT OPERASI EKT.EtOH
• TRANSDUCER
•
.
SEPERANGKAT KLT, SPEKT. IR, UV,
RMI, DAN SM n-heksana
• BAHAN KIMIA DERAJAT
PROANALYSIS, KECUALI UNTUK
EKSTRAKSI Gab.ekst.N-HEKSANA
 UJI AKTIVITAS TRAKEOSPASMOLITIK

1.PREPARASI ORGAN TRAKEA

-MEMBUAT TRACHEA STRIP. OTOT POLOS DIANTARA TULANG RAWAN YANG DI-
POTONG.
-UJUNG ATAS DIKAITKAN DG TRANSDUCER, UJUNG BAWAH DENGAN PENGAIT. ORGAN
DALAM BEJANA YANG BERISI LARUTAN KREBS, TEMP. 37 C DIALIRI GAS KARBOGEN.
-EKUILIBRASI 60 MENIT SETIAP 15 MENIT LARUTAN KREBS DIGANTI SAMPAI KEADAAN
STABIL
 The tracheal chains of guinea-pigs
 
 

•A. Trakea
•B. Cincin trakea
•C. Cincin dipotong
•D. Cincin trakea dlm organ
bath
a, b, c. tulang rawan
d. otot polos
 PENGUKURAN KONTRAKSI TRAKEA
PREPARASI ORGAN TRAKEA

EKULIBRASI 60 MENIT

PENGENALAN ORGAN THD AGONIS METAKOLINA (REKAM KONTRAKSINYA)

PENCUCIAN ORGAN TIAP 15 MENIT (4 KALI)

PEMBERIAN AGONIS METAKOLINA FAKTOR KUMULASI ½ LOG 10 (REK. KONTR)

PENCUCIAN ORGAN TIAP 15 MENIT (4 KALI)

PEMBERIAN EKSTRAK/SENYAWA (SAMPAI STABIL)

PEMBERIAN AGONIS METAKOLINA FAKTOR KUMULASI ½ LOG 10 (REK.KONTR.)

 SKEMA ISOLASI
EKSTRAK N-HEKSANA

KLT (DCM:EtOCH =8:2)

VLC (PELARUT BERJENJANG)

123 4/5 6/7 8/9/10/11 12/13/14 15/16/17/18/19/20 21/22/23/24/25

-UJI AKTIVITAS/DETEKSI KLT

FRAKSI AKTIF
PEMURNIAN,KLT PREP

ISOLAT AKTIF

ELUSIDASI STRUKTUR/UJI TRAKEOSPASMOLITIK(UV,IM,RMI,SM)

 110

Metach.
Et.OH
90
Hexane

70

% response 50

30

10

-9.0 -8.5 -8.0 -7.5 -7.0 -6.5 -6.0 -5.5 -5.0 -4.5 -4
-10

log dose metacholine

Inhibition of methacholine-stimulated smooth muscle contraction on the

isolated guinea-pig trachea preparation in the presence of ethanol and
n-hexane extract (0.25 mg/ml)
 Fraksi 6,7 • Fraksi 8,9,10,11

120.0
120
metach.%
metach.%

extr.(6,7) % extr.8-11
100.0
100
% response

% response
80.0
80

60.0 60

40
40.0

20
20.0

0
0.0
-8.0 -7.5 -7.0 -6.5 -6.0 -5.5 -5.0 -4.5 -4.0
-8.0 -7.5 -7.0 -6.5 -6.0 -5.5 -5.0 -4.5 -4.0

log dose methol

log dose metacholine
 HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

compound: I 5,5µg/ml =28,9 ± 1,8 %

Me tac holine 11µg/ml = 48,3 ± 2,3 %

150.0 11ug/ml 16,5µg/ml=80,5 ± 0,4%

5.5 ug/ml
response in %

100.0
16,5 ug/ml
50.0

0.0
-9.0 -8.0 -7.0 -6.0 -5.0 -4.0

log methacholine (agonis t)

KURVA PENGARUH PEMBERIAN SENYAWA I

 c o mpo und:II 5,5 µg = 15,0 ± 0,3 %
Me tac holine
11 µg = 29,9±0,2 %
120.0 5.5ug/ml
16,5 µg= 65,3 ± 1,3 %
re s po ns e in %

100.0 11 ug/ml
80.0 16.5 ug/ml

60.0
40.0
20.0
0.0
-9.0 -8.0 -7.0 -6.0 -5.0 -4.0

lo g me thac ho line [ag o nis t]

• KURVA PENGARUH METAKOLINA SENYAWA II

HASIL EKSTRAKSI
BERAT SERBUK = 2 kg
BERAT EKSTRAK HEKSANA = 50,17 g
BERAT EKSTRAK ETANOL = 83,13 g (LARUT DI N-HEKSAN 20,10 g)

GABUNGAN EKSTRAK N-HEKSANA = 70,27 g

HASIL PEMISAHAN DENGAN VLC
ekstak n-heksana

VLC

Dichloromethane/ethylacetate 8:2 v/v

 
1/2/3 4/5 6/7 8/9/10/11 12/13/14 15/16/17/18/19/20 21/22/23/24/25
2,81 g 3,20 g 1,56 g 7,84 g 1,13 g 1,69 g 5,91 g
not active not active active active not active not active not active

ORGANOLEPTIK ISOLAT (FRAKSI 6,7)

KRISTAL BENTUK JARUM, WARNA PUTIH, TIDAK BERBAU RASA KHAS
KELARUTAN : LARUT KLOROFORM, N-HEKSANA, DIKLORMETANA,
SEDIKIT LARUT DI ETANOL, TIDAK LARUT DI AIR.
TITIK LEBUR 133˚ C- 134˚ C
SPEKTRUM 1H-NMR UNTUK SENYAWA I1 DAN I2 (CDCl3, TMS)
SPEKTRUM 13C-NMR (DEPT) SENYAWA I1 DAN I2
SPEKTRUM 1H-1H COSY (Expanded) SENYAWA I1 DAN I2
SPEKTRUM HMQC SENYAWA I1 DAN I2
SPEKTRUM HMBC SENYAWA I1 DAN I2
 OH
2' 7'
9'
1' 8'
O
3'
O
4' 6' 8
O 9
5' 7

1
2 6

3 5

4
O

SPEKTRUM MASSA SENYAWA AKTIF

 HO
O O
H+
O O O
AR

m/e 338 (16%)

m*

O
+
O

m/e 135 (100%)

O
+

m/e 203 (2%)

O
+
O

m/e 173 (16%)

POLA FRAGMENTASI SENYAWA KUBEBIN

 OBSERVASI HMBC KUBEBIN

H OH
2' 7'
9'
1' 8'
O
3'

10' H O
4' 6' 8
9
O
5' 7 H
H
H
1
2 6

3 5

4
O

O
10
SPEKTRUM 1H-NMR UNTUK SENYAWA II (CDCl3, TMS)
SPEKTRUM 13 C-NMR (DEPT) SENYAWA II
SPEKTRUM 1 H-1H-COSY SENYAWA II
HMQC SENYAWA II
SPEKTRUM MASSA SENYAWA II
 Cubebin 30 mg/kg b.b;
dihydrocubebin 30 mg/kg bb; Anti-inflammatory activity of P.cubeba
P.cubeba extract 1,8 kg/kg bb; (-) extracts,cubebin and dihidrocubebin on
control 1 % CMC; (+) control carrageenin-induced paw oedema in rats
indomethacin 10 mg/kg b.b
Test Dose Paw Inhibiti
material (mg/kg) volume on (%)
b.w; p.o (ml)a

0.30 Negative 0.1ml 0.26   

control 0.01
0.25 (1 %
Neg.ctrl CMC-
0.20 Positive 10 mg 0.19  27 %
oedema volume (ml)

Na)
Pos.ctrl
control 0.01
0.15 CB (indomet
DHC hacin)
0.10 Dihydroc 30 mg 0.26   
PC Ext.
ubebin 0.01
0.05
P. cubeba 1.8 g 0.18  30 %
0.00 Extr. 0.01
0 1 2 3 4 5
hours Cubebin 30 mg 0.15  42 %
0.01

 
Values, determined 3 h after carrageenin , are mean  SD (n=5)
Area (dm2), linear equation is obtained  
by plotting weight (ug)  

  Cubebin yield in the month of

Y= bx + a March, June, September,
  December in Piper cubeba plants
Y= 2.167x + 0.166 growing in the field.
 

No Volume ug area (dm2) No Harvest Concentration  SD

1 0.5 ul 0.06 0.20773 1 March 0.046  0.009

2 1 ul 0.12 0.491281
2 June 0.050  0.003

3 2 ul 0.24 0.7780343
3 September 0.058 0.010

4 4 ul 0.48 1.199838
4 Desember 0.042  0.005

5 8 ul 0.72 1.558304 INFUSA 0,562 ±0,082

4 10 ul 0.96 2.345575
Total AUC, rata-rata ± SD (n=5), p<0.005 vs kontrol, Oneway Anova

AUC (ml/h)

1.2
1
0.8 Neg.contr
AUC(ml/h)

0.6 Pos.ctr

0.4 PC extr.

0.2 DHC
CB
0
Neg.contr Pos.ctr PC extr. DHC CB
Treatmeant
PENGARUH PENGHAMBATAN INFUSA BUAH KEMUKUS

Me tac holine
Pcubeb a fruit infusa 50 ul

100 ul • 50µl = 46,2 ± 0,11 %

120.0
100.0 • 100 µl = 77,4 ± 0,11 %
response in %

80.0
60.0
40.0
20.0
0.0
-9.0 -8.0 -7.0 -6.0 -5.0 -4.0
lo g [a g o nist]
 PEMBENTUKAN MDA-TBA
OH
O O
H H
O O
N H+ N N
+ 2
H H
HO N SH
N OH HO N
HS SH

O OH O
H H
O O
NH H+
N N
+ 2
H H
O N S
N OH HO N
S SH
H
MDA TBA MDA-TBA
IC-50 of cubebin, PGVO and indomethacin

No Compound a) IC-50 b)

1 Indomethacine 2.26

2 PGV-O 9.55

3 Cubebin 14.61

a)
Concentration of PGVO and cubebin 0.6, 3, 15,
and 30 M, indomethacin 0.06, 0.3, 1,5 and 3
M
b)
IC-50 (50 % effective dose) was measured by using
linear regression n=5 for each gradual dose
 SENYAWA KUBEBIN BERSAMA EPIMERNYA

H OH
H OH 2' 7' 9'
2' 7' 9'
O 3' 1'
O 3' 1'
8'
a H O 10' 8 Ha H O
10' 8 H
4' 6' 9
4' 6' 9 O
O 5' 7
5' 7
H
H H
H
1
2 2 6
6

3 3 5
5
4 4
O O

O O
10 10
epicubebin
cubebin
2
1

Compound I
 2' 7' H 9'
3' 1' CH2OH
O
8'
10'
8 9
4' 6'
O CH2OH
5' 7
H
1
2 6

3 5

O 4

O
10

(3,4),(3’,4’)-bis-methylendioxy-9,9’ dihydroxylignan or dihydrocubebin

DIHYDROCUBEBIN
Compound II
 V. KESIMPULAN
Atas dasar hasil tersebut diatas dapat diambil suatu kesimpulan sebagai
berikut :
• 1. Kubebin dengan epimernya merupakan lignan utama dalam buah kemukus
(Piper cubeba), serta aktifitas trakeospasmolitik sesuai dengan fraksi yang
kasar (crude fraction).

• 2.Efek dari antiinflamasi dari kubebin menguatkan penggunaan obat

tradisional dari buah kemukus sebagai antiasma dalam praktik.

• 3.Infusa dari buah kemukus menunjukkan adanya efek trakeospasmolitik,

serta adanya kubebin dalam infusa tersebut dapat dideteksi menggunakan
metode KLT. Sehingga sangat beralasan bahwa orang minum jamu rebusan
dari buah kemukus. Kubebin tidak ditemukan dalam jamu meskipun disitu
tercantum keberadaan kemukus dalam formulanya, hal tersebut menyalahi
aturan yang berlaku.

• 4.Kadar kubebin dalam daun paling tinggi ditemukan bila dipanen pada bulan
September dan mulai menurun pada bulan Desember serta mulai naik kembali
pada bulan Maret dan Juni. Sehingga kemungkinan bahwa daun dapat
dipakai sebagai alternatif sumber kubebin.

• 5. Kubebin kemungkinan dapat dijadikan senyawa penuntun untuk

pengembangan senyawa baru antiasma
The TLC chromatogram of n-hexane extract of Piper cubeba fruits

• Method : Ascending, one

• dimensional
• development in trough
• with chamber saturation
• Layer : Silica gel 60 F254 (E.Merck)
• Mobile phase : Dichloromethane/ethyl
• acetate ( 8 : 2 v/v)
• Migration : 7 cm
• Detection : Diluted H2SO4 (50 %)

1 and 2 = n-hexane extract of Piper cubeba

fruits
• 3. = dihydrocubebin (Reference
Standard)
• 4. = cubebin (Reference Standard)
• 5. = mixtures of cubebin and
dihydrocubebin Reference Standard
TLC chromatogram of jamu sesak napas

TLC c
 
 
Method: Ascending, one dimensional
development in trough with

chamber saturation
Layer : Silica gel 60 F254 (E.Merck)
Mobile phase : Dichloromethane/ethyl acetate (
8 : 2 v/v)
Migration : 8 cm
Detection : Diluted H2SO4 (50 %)
A = jamu A
B = jamu B
C = jamu C
D = jamu D
E = jamu E
F = jamu F
G = jamu G
H = jamu H
X = jamu x
Ext = n-hexane extract of Piper cubeba
DHC = dihydrocubebin (Reference Standard)
C. = cubebin (Reference Standard)
TLC chromatogram of leaves Piper cubeba L.f

• Method : Ascending, one dimensional

• development in trough with
• chamber saturation
• Layer : Silica gel 60 F254 (E.Merck)
• Mobile phase : Dichloromethane/ethyl acetate (

• 8 : 2 v/v)
• Migration : 7 cm
• Detection : Diluted H2SO4 (50 %)
• 1, 6 = cubebin (Reference Standard)
• 2 and 3 = n-hexane extract of Piper cubeba leaves
• 5. = n-hexane extract of Piper cubeba fruits

• 7. = dihydrocubebin (Reference Standard)

•  
 K O N VE
VERR SI P ER H ITU N G AN AN T AR JEN IS H E W AN

M encit T ikus M arm ot K elinci K era A njing M anusia

20 g 200 g 400 g 1,5 kg 4kg 12 kg 70 kg
M encit 1,0 7,0 12,25 27,8 64,1 124,2 387,9
20 g
T ikus 0,14 1,0 1,74 3,9 9,2 17,8 56,0
200 g
M rm ot 0,08 0,57 1,0 2,25 5,2 10,2 31,5
400 g
K elinci 0,04 0,25 0,44 1,0 2,4 4,5 14,2
1,5 kg
K era 0,016 0,11 0,19 0,42 1,0 1,9 6,1
4 kg
A njing 0.008 0,06 0,10 0,22 0,52 1,0 3,1
12 kg
M nsia 0,0026 0,0181 0.031 0,07 0,16 0,32 1,0
70 g

11
W ahyono, dkk.