VII.

Pembahasan
Pemurnian protein adalah suatu rangkaian proses isolasi jenis tunggal dari dari satu
campuran kompleks.Pemurnian ini bertujuan untuk mengetahui lebih jauh mengenai struktur,
sifat-sifat kimia maupun fisika suatu senyawa yang terdapat di bahan alam,sehingga diperoleh
senyawa protein dalam keadaan murni.(Mayes, P.A et al,1990)
Pada praktikum ini,dilakukan pemurnian protein laktat dehidrogenase (LDH) dari ayam
dengan cara pengendapan protein oleh ammonium sulfat.Proses pengendapan protein dapat
dilakukan dengan menggunakan amoniumsulfat berkonsentrasi tinggi atau larutan jenuhnya
(salting out). Salting out merupakan metode yang digunakan untuk memisahkan protein yang
didasarkan pada prinsip bahwa protein kurang terlarut ketika berada pada daerah yang
konsentrasi kadar garamnya tinggi.Kelarutan protein akan berkurang bila kedalam larutan
protein ditambahkan garam- garam anorganik. Pengendapan terus terjadi karena kemampuan ion
garam untuk menghidrasi, sehingga terjadi kompetisi antara garam anorganik dengan molekul
protein untuk mengikat air.Hal ini terjadi karena garam anorganik mempunyai kemampuan
untuk mengikat air maka jumlah air yang tersedia untuk molekul protein akan berkurang.
(Bintang,2010)
Laktat dehidrogenase (LDH) merupakan enzim intraseluler yang terdapat pada hampir
semua sel yang bermetabolisme, dengan konsentrasi tinggi yang dapat ditemukan pada jantung,
otot rangka, hati, ginjal, otak, dan sel darah merah.LDH juga dapat mengkatalisis perubahan
piruvat menjadi laktat.(Girindra,1986)
Langkah pertama yang dilakukan adalah penyiapan jaringan, dada ayam yang akan
diambil LDHnya di buang jaringan ikat dengan lemaknya,yang digunakan hanya dagingnya
karena LDH muncul atau dapat diambil jika ada kerusakan pada jaringan dan dapat disimpulkan
bahwa adanya peningkatan LDH merupakan pertanda telah terjadinya kerusakan jaringan.
(Girindra,1986)
Kemudian daging ayam tersebut di gerus menggunakan blender dengan campuran dapar
pengekstrasi yang telah dibekukan.Tujuan penggerusan ini untuk memperoleh protein dari organ
jantung tersebut maka protoplasma akan keluar dan akan diperoleh protein,sedangkan tujuan dari
penambahan dapar pengekstrasi yang telah dibekukan adalah agar protein tidak terjadi

denaturasi,karena pada saat di blender suhu didalam menjadi panas jadi harus ditambahkan dapar
dengan suhu dingin sehingga dapat menstabilkan suhu pada saat penggerusan dan juga bertujuan
agar dapat menginaktivasi enzim yang bekerja pada sampel, LDH (protein dari ayam)
mempunyai suhu aktif >800C.jika pada suhu aktif LDH akan tercerna oleh lisosom maka
LDHnya tidak bisa diambil.(Girindra,1986)
Larutan

dapar

pengekstraksi

tersebut

terdiri

dari

Tris-HCl,2-

mercaptoethanol,phenylmetylsulfonyl florida (PMSF) dan ethylenediamine tetraacetic acid

(EDTA).Tris-HCL merupakan senyawa organik dengan rumus (HOCH2) 3CNH2.Tris secara luas
digunakan dalam biokimia dan biologi molekuler. Dalam biokimia, Tris HCL banyak digunakan
sebagai komponen larutan buffer.Tris HCL juga merupakan bahan kimia dengan sifat dasar, yang
memiliki pKa 8,1. Hal ini dapat digunakan untuk penyangga dan solusi dari perubahan pH yang
drastis,

menjaga

mereka

di

kisaran

pH

7,0-9,0.

sehingga dapat menjaga pHnya agar dapat bekerja dengan baik.Lalu terdiri dari EDTA yang
berfungsi sebagai larutan buffer dan sebagai pengkelat yang dapat mengikat ikatan kation
sehingga dapat menurunkan tegangan dan menghasilkan ion untuk menghantarkan arus,
umumnya mengikat ion logam jika terdapat pada sample, sampel yang digunakan berupa dada
ayam yang umumnya bnyak ion Ca2+ karena merupakan jaringan yang berotot,lalu terdiri dari 2Mercaptoethanol yang berfungsi menghilangkan senyawa polifenol yang terkandung dalam
daging tersebut, dan mendetarurasi protein yang mengkontaminasi LDH yang akan dimurnikan.
(Hamid,2001).
Setelah itu,campuran daging ayam dan dapar pengekstraksi yang telah homogen
dimasukkan ke dalam 4 tabung sentrifugasi dan disentrifugasi selama 20 menit dengan kecepatan
pengadukan 15000 rpm.Setelah disentrifugasi terjadi pemisahan,pada bagian atas berupa
supernatant (cairan) yang tidak berwarna sedangkan pada bagian bawah berupa pellet (endapan)
yang berwarna peach.Hal ini sesuai dengan literatur (Hendra,1989).
Prinsip sentrifugasi didasarkan pada pemisahan molekular dari sel atau organel
subselular. Pemisahan tersebut berdasarkan konsep bahwa partikel yang tersuspensi di sebuah
wadah akan mengendap (bersedimentasi) ke dasar wadah karena adanya gaya gravitasi.Sehingga
laju pengendapan suatu partikel yang tersuspensi tersebut dapat diatur dengan meningkatkan atau
menurunkan pengaruh gravitasional terhadap partikel.Pengaturan laju pengendapan tersebut

dapat dilakukan dengan cara menempatkan wadah yang berisi suspensi partikel kemesin
sentrifugasi tepatnya pada bagian rotor yang kemudian akan berputar dengan kecepatan
tertentu.Hal tersebut tergantung pada ukuran dan bobot jenis,Hasil sentrifugasi terbagi menjadi
dua, yaitu supernatan dan pellet. Supernatan adalah substansi hasil sentrifugasi yang memiliki
bobot jenis yang lebih rendah. Posisi dari substansi ini berada pada lapisan atas dan warnanya
lebih jernih. Sementara pelet adalah substansi hasil sentrifugasi yang memiliki bobot jenis yang
lebih tinggi. Posisi dari substansi ini berada pada lapisan bawah dan warnanya lebih keruh
(Hendra,1989).
Pada sentrifugasi ini digunakan kecepatan pengadukan 15.000 rpm dengan waktu 20
menit,hal ini menunjukan semakin besar kecepatan pengadukan semakin banyak pula endapan
(pellet) yang dihasilkan dan semakin lama juga waktu yang dibutuhkan untuk memisahkan
campuran antara supernatant dan pellet.Dapat disimpulkan bahwa kecepatan pengadukan (rpm)
sebanding dengan waktu yang dibutuhkan.( Hendra,1989).
Lalu langkah selanjutnya adalah filtrasi,supernatant disaring menggunakan kain kasa dan
filtratnya di peras hingga tidak ada supernatant yang terkandung di dalamnya.Supernatant di
ambil karena di dalam supernatan tersebut mengandung protein. Supernatan yang diambil
kemudian ditambahkan dengan Amonium Sulfat/ (NH4)2SO4 sedikit demi sedikit sebanyak 5,07
gram dan di aduk secara perlahan.Pengerjaan tersebut dilakukan di dalam gelas kimia yang berisi
es batu.Tujuan penambahan ammonium sulfat adalah untuk mengendapkan protein,ion garam
tersebut mengikat air dan akan borkempetisi dengan molekul protein dalam mengkit air sehingga
kelarutan protein akan berkurang dan protein akan mengendap.(Hamid,2001)
Dalam pengerjaannya di aduk secara perlahan agar tidak terjadi denaturasi pada protein
dan dilakukan di dalam gelas kimia yang berisi es batu yang bertujuan agar dengan suhu yang
rendah akan memudahkan proses pengendapan dan mengakibatkan turunnya daya larut protein
sehingga protein mudah berikatan dengan ammonium sulfat.(Bintang,2010)
Kemudian langkah selanjutnya adalah disentrifugasi kembali,pada sentrifugasi kedua ini
yang diambil adalah pelletnya karena pellet tersebut mengandung protein yang dihasilkan dari
protein yang berikatan dengan ammonium sulfat lalu diresuspensi yaitu disuspensikan kembali
dengan penambahan dapar.Tetapi protein tersebut masih belum murni,masih ada ammonium
sulfat yang tersisa sehingga harus di lakukan kromatografi sebagai tahap pemurnian selanjutnya
agar ammonium sulfat dapat dipisahkan dengan protein.(Bintang,2010)

Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola

pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang
berada pada larutan.Kromatografi yang digunakan pada praktikum ini adalah kromatografi
filtrasi gel.Prinsip dari kromatografi filtrasi gel adalah pemisahan berdasarkan perbedaan ukuran,
molekul yang mempunyai ukuran besar yang tidak dapat masuk ke daerah gel yang merupakan
rongga-rongga gel sehingga akan keluar dari kolom,sedangkan molekul yang mempunyai ukuran
kecil akan terjerap pada fase diam yang berupa rongga/butiran berpori.(Poedjiadi,2005)
Kemudian digunakan salting kolom,kolom kromatografi yang digunakan adalah
sephadex G-150 dengan eluen buffer Tris-HCl pH 7,2. Sephadex terbuat dari protein berhidrat
tinggi dengan pori-pori yang sangat halus. Kolom Sephadex G-150 yang terjadi dielusi dengan
buffer pengembangnya dengan kecepatan tetesan 6 menit per tetes.(Williamson,1992)
Lalu kolom tersebut digunting bagian bawahnya agar dapar keluar,setelah dapar keluar
seluruhnya kemudian ditambahkan sample berupa pellet yang telah diresuspensi.Diperoleh
sample (protein) adalah 4,1 mL.Sebenarnya protein yang di hasilkan masih belum murni,dan
harus di lakukan dengan tahap selanjutnya yaitu dengan cibacron blue.Namun pengerjaannya
tidak dilakukan karena di dalam laboratorium tidak memiliki cibacron blue,sehingga hanya
dilakukan sampai tahap kromatografi filtrasi gel dan didapatkan protein yang belum murni
seluruhnya.

DAPUS PEMBAHASAN

Mayes, P.A., Granner, D.K., Rodwell, V.W., dan Martin, D.W., 1990, Biokimia Harper

Edisi 20, Penerbit Buku Kedokteran. Jakarta

Bintang, Maria.2010. Biokimia Teknik Penelitian. Jakarta: Erlangga
Girindra, Aisjah. 1986. BIOKIMIA I. Jakarta: Gramedia
Hamid,Abdul,2001.Biokimia Metabolisme Biomolekul.Jakarta:Penerbit Alfabeta
Poedjiadi, A., 2005,Dasar-Dasar Biokimia,UI Press, Jakarta

Hendra Adijuwana. 1989. Teknik pemisahan Dalam Analisis Biologis. Bogor: IPB Press
Williamson,K.L & L.F.Fieser. (1992). Organic Experiment 7th Edition. D C Health ang
Company. United States of America.

Kesimpulan

1. Metode yang digunakan untuk Pemurnian protein LDH (Laktat Dehidrogenase) dari bagian
daging dada ayam adalah dengan metode pengendapan protein dengan ammonium sulfat.
2. Kromatografi yang digunakan adalah kromatografi filtrasi gel,yaitu pemisahan protein dari
ammonium sulfat berdasarkan perbedaan ukuran.
3. Diperoleh protein sebanyak 4,1 ml dan ammonium sulfat yang harus ditambahkan sebanyak
5,07 gram.