1

I.

STERILISASI ALAT, PEMBUATAN LARUTAN STOK, DAN

PEMBUATAN MEDIA

A. Pendahuluan
1. Latar Belakang
Kultur jaringan didefinisikan sebagai suatu teknik menumbuh
kembangkan bagian tanaman baik berupa sel, jaringan atau organ dalam
kondisi aseptik secara in vitro, yang dicirikan kondisi kultur yang aseptik,
penggunaan media kultur buatan dengan kandungan nutrisi lengkap dan
ZPT (Zat Pengatur Tumbuh) serta kondisi ruang kultur yang suhu dan
pencahayaannya terkontrol. Kultur jaringan tanaman merupakan salah satu
aplikasi dari bioteknologi tanaman yang merupakan budidaya tanaman
yang dikerjakan secara in vitro (dalam wadah tertutup atau dalam botol).
Kultur jaringan dalam bahasa asing disebut sebagai tissue culture, weefsel
cultures atau gewebe kultur.
Penggunaan kultur jaringan mempunyai kelebihan yaitu mampu
memproduksi bibit yang seragam dalam jumlah banyak dan dalam waktu
yang relatif singkat. Kultur jaringan sering dijadikan solusi sebagai metode
perbanyakana tanaman dan juga dapat digunakan sebagai suatu metode
penyimpanan plasma nutfah yang tidak membutuhkan temapat yang besar.
Keberhasilan dari kultur jaringan sangat bergantung dari ketepatan
konsentrasi nutrisi yang berada di dalam media kultur.
Ketepatan konsentrasi ini menyangkut pada ketersediaan nutrisi bagi
eksplan tanaman. Kelebihan nutrisi dari tanaman akan menyebabkan
tanaman mengalami keracunan unsur hara. Oleh karena itu, pembuatan
larutan stok dan sterilisasi media dianggap penting untuk diketahui sebagai
sarana penunjang kebutuhan informasi akan kultur jaringan.
Lingkungan aseptik juga menjadi syarat utama suksesnya kegiatan
kultur jaringan perlu diterapkan dengan sungguh-sungguh. Untuk itu perlu
adanya usaha sterilisasi peralatan yang akan digunakan dalam proses
kultur. Tidak hanya terbatas pada peralatan, namun ruangan yang akan
digunakan pun harus dalam kondisi aseptik. Tujuan utama dari sterilisasi
ruangan maupun peralatan kultur pada dasarnya untuk menghindari

kontaminasi oleh mikro organisme yang ada di peralatan maupun di udara

bebas sekitar ruangan.
2. Tujuan Praktikum
Praktikum tentang Pembuatan Larutan Stok, Media Kultur, dan
Sterilisasi bertujuan sebagai berikut:
a. Mengetahui metode dan macam sterilisasi dalam kultur jaringan yang
meliputi sterilisasi alat, ruang dan eksplan.
b. Megetahui prosedur sterilisasi alat-alat penanaman (diseksi) dan alat
kaca seperti botol kultur,petridish, erlenmeyer, dan lain-lain.
c. Mengetahui langkah-langkah dalam pembuatan media kultur jaringan
terutama dalam pembuatan stok makro nutrien,mikro nutrien,larutan
buffer (Fe-EDTA),vitamin dan Zat Pengatur Tubuh (ZPT)
3. Waktu dan Tempat Praktikum
Praktikum tentang Pembuatan Larutan Stok, Media Kultur, dan
Sterilisasi dilaksanakan pada hari Rabu, 18 Maret 2015 jam 07.00-09.00
WIB di Laboratorium Kultur Jaringan Fakultas Pertanian Universitas
Sebelas Maret.
B. Tinjauan Pustaka
Sterilisasi adalah suatu proses penghancurkan segala bentuk-bentuk
kehidupan (Pelczar 2008). Medium dan alat-alat yang kita pergunakan dalam
inokulasi jika tidak steril tidak akan mungkin memperoleh biakan bakteri yang
diinginkan. Selain itu juga, dalam sterilisasi harus menguasai teknik inokulasi
agar mendapat hasil pengamatan yang baik. Sterilisasi yang selanjutnya adalah
sterilisasi secara kimia. Sterilisasi ini menggunakan disinfektan, larutan
alkohol, larutan formalin (Dwidjoseputro 2005).
Bahan-bahan kimia komponen media dibutuhkan dalam jumlah yang
relatif kecil, oleh karena itu bahan-bahan tersebut disediakan dalam bentuk
larutan yang disebut sebagai larutan stok. Larutan stok merupakan larutan
bahan-bahan komponen media yang besarnya telah dikalikan menjadi beberpa
konsentrasi. Sehingga larutan stok ini berfungsi untuk memudahkan
penimbangan dan menghindari kesalahan penimbangan bahan-bahan yang
diperlukan dalam jumlah yang relative kecil (Yuniastuti 2008)
Keberhasilan penggunaan metode kultur jaringan sangat tergantung pada
media yang digunakan. Media kultur jaringan menyediakan tidak banyak

unsur hara (unsur hara makro dan mikro), tetapi kebutuhan kabohidrat yang
pada umumnya berupa gula untuk menggantikan karbon yang didapat dari
fotosintetis. Penggunaan media MS+IBA dengan konsentrasi antara 10
sampai dengan 100 mg/l yang ditambah dengan ZPT NAA 1mg/l mampu
mengindukasi akar sampai 70%. Kombinasi ZPT auksin dan sitokinin yang
diberikan bersamaan kedalam media yang sama nampaknya selalau berhasil
(Herawan et al 2006).
Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur
jaringan. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman
yang akan diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam
mineral, vitamin, dan hormon. Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan
seperti agar, gula, dan lain-lain. Zat pengatur tumbuh yang ditambahkan juga
bervariasi, baik jenisnya maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari
kultur jaringan yang dilakukan. Media yang sudah jadi ditempatkan pada
tabung reaksi atau botol-botol kaca. Media yang digunakan juga harus
disterilkan dengan cara memanaskannya dengan autoklaf (Gunawan 2005).
Tujuan utama sterilisasi yaitu mematikan, menyingkirkan atau
mengahambat pertumbuhan mikroorganisme adalah:
a.

Untuk mencegah inflasi pada manusia, hewan dan tumbuhan.

b.

Untuk mencegah makanan dan lain-lain menjadi rusak.

c.

Untuk mencegah gangguan kontaminasi terhadap mikroorganisme.

d.

Untuk mencegah kontaminasi bahan-bahan yang dipakai

Sterilisasi adalah setiap proses kimia, fisika dan mekanik yang membunuh
semua bentuk kehidupan, terutama mikroorganisme (Adi 2010).

C. Alat, Bahan dan Cara Kerja

1. Alat
a. Peralatan untuk penanaman eksplan, meliputi:
1) Laminar Air Flow Cabinet (LAFC), lengkapdengan lampu bunsen
yang berisi spirtus
2) Petridish dan botol-botol kuljur
3) Peralatan diseksi, yaitu pinset besar/ kecil, pisau pemes, gunting
eksplan
b. Peralatan untuk pembuatan media, meliputi:
1) Timbangan analitik
2) Botol-botol kultur
3) Magnetik stirer
4) pH meter
5) Gelas piala
6) Pipet
7) Tutup botol kultur
8) Kertas label
2. Bahan
Bahan-bahan untuk pembuatan media:
1) Aquadest
2) Larutan Stok, terdiri atas hara makro dan mikro, vitamin serta ZPT
3) Agar-agar
4) Gula
5) NaOH 1 N dan HCl 1 N
3. Cara Kerja
a. Pembuatan Larutan Stok
1) Larutan stok media
a) Menimbang bahan-bahan kimia yang telah dikalikan menjadi
beberapa kali konsentrasi, misalnya untuk unsur hara makro
dikalikan 20 dan unsur hara mikro dikalikan 100 kali
konsentrasi
b) Melarutkan bahan-bahan kimia tersebut ke dalam aquadest
dengan volume tertentu, misalnya 500 ml
c) Memasukkan masing-masing larutan ke dalam botol dan
menyimpannya ke dalam refrigerator
2) Larutan stok zat pengatur tumbuh
a) Menghitung kebutuhan bahan BAP 100 ppm sebanyak 300 ml
adalah sebagai berikut;
100 ppm = 100 mg/l
= 30 mg/0,3 l
= 30 mg/300 ml

b) Menghitung kebutuhan bahan IBA 100 ppm sebanyak 100 ml

adalah sebagai berikut:
100 ppm = 100 mg/l
= 10 mg/0,1 l
= 10 mg/100 ml
c) Melarutkan bahan dengan Alkohol atau NaOH 1 N kemudian
ditambah dengan aquadest sampai 300 ml untuk BAP dan 100
ml untuk IBA
d) Memasukkan masing-masing larutan tersebut ke dalam botol
dan menyimpannya ke dalam refrigerator
b. Pembuatan Media
1) Mengambil masing-masung larutan stok sesuai dengan ukuran
yang telah ditentukan dan memasukkannya ke dalam gelas piala
2) Mengambil larutan stok ZPT sesuai dengan perlakuan, misalnya:
a) Untuk membuat media 1 L dengan konsentrasi BAP 2 ppm,
maka volume larutan stock yang diambil adalah:
V1 x M2
= V2 x M2
V1 x 100 ppm = 1000 l x 2 ppm
V1 = 20 ml/L

b) Untuk membuat media 1 L dengan konsentrasi IBA 0,5 ppm,

maka volume larutan stok yang diambil adalah:
V1 x M1
= V2 x M2
V1 x 100 ppm = 1000 ml x 0,5 ppm
V1 = 5 ml/L
Ket: V1 = volume larutan stok yang diambil
M1 = dosis larutan stok yang diambil
V2 = volume media yang akan dibuat
M2 = dosis media yang akan dibuat
3) Menambahkan aquadest sampai 1500 ml
4) Menambahkan gula sebanyak 45 gr
5) Mengukur pH dalam kisaran 5,8-6,3 dengan menambahkan
beberapa tetes NaOH untuk menaikkan pH atau HCl untuk
menurunkan pH. Pada saat pengukuran pH, larutan media diaduk
dengan magnetik stirrer
6) Menambahkan agar-agar 12 gr kemudian dididihkan
7) Menuangkan larutan media ke dalam botol-botol kultur kurang
lebih 25 ml tiap botol
8) Menutup botol berisi larutan media dengan tutup botol plastik
9) Memasukkan botol-botol berisi media ke dalam autoklaf untuk
proses sterilisasi pada tekanan 1,5 kg/cm2 selama 45 menit
10) Menyimpan media pada rak penyimpanan media yang bertujuan
untuk mengantisipasi ada tidaknya kontaminasi pada media
sehingga

dapat

dicegah

penggunaan

media

yang

telah

terkontaminasi pada saat penanaman.

DAFTAR PUSTAKA
Gunawan, L. W. 2005. Teknik Kultur Jaringan. IPB: Bandung
Yuniastuti E 2008. Buku Petunjuk Praktikum Kultur Jaringan. Surakarta: UNS
Press.

Herawan T dan M Naiem. 2006. pengaruh Jenis Madia dan Konsentrasi ZPT
Kinetin Terhadap Perakaran Pada Kultur Jaringan Cendana ( Santalum
album Linn ). Agrosains Volume 19 ( 2 ) : 198
Adirianto 2010. Daftar Koleksi Mikro. Surabaya: Pusat Penelitian dan
Pengembangan Pelayanan Kesehatan.
Dwidjoseputro D 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan.
Pelczar MJ, Chan ECS 2008. Elements of Microbiology. New York: Mc Graw Hill
Book Company.