Human Reproduction Vol.19, No.1 pp.

3040, 2004

DOI: 10.1093/humrep/deh032

Ekspresi nitric oxide synthase dan pengaruh substrat

manipulasi oksida nitrat dalam jalur folikel ovarium tikus
1

Leila M.Mitchell , C.Richard Kennedy dan Geraldine M.Hartshorne

Departemen Ilmu Biologi, University of Warwick, Coventry CV4 7AL, UK

1
Present address: Bourn Hall, Bourn, Cambridge CB3 7TR, UK
2

To whom correspondence should be addressed. E-mail: geraldine.hartshorne@warwick.ac.uk

Key words: folikel tikus/oksida nitrat/nitric oxide synthase/oosit/ovulasi

Pendahuluan
Produk bioaktif terkecil yang dikenal sel mamalia adalah
oksida nitrat (NO), yaitu gas radikal bebas dengan paruh
waktu <5 s (Nathan, 1992). NO, pertama kali diidentifikasi
sebagai endothelial derived relaxing factor (EDRF;.
Ignarro et al, 1987), menyebabkan relaksasi otot polos
pembuluh darah dan memediasi proses fisiologis normal
dalam banyak sistem termasuk kekebalan tubuh, inflamasi
dan sistem kardiovaskular ( Bredt dan Snyder, 1994; Xie
dan Nathan, 1994). NO dibentuk dari L-arginine (L-arg)
dalam reaksi yang dikatalisis oleh nitrat oksida sintase
(NOS). NOS ada tiga isoform, bisa diinduksi (iNOS),
endotelial (eNOS) dan neuronal(nNOS) (Palmer et al,
1988;. Forstermann et al, 1994;. Nathan dan Xie, 1994a).
NOS mengoksidasi L-arg untuk menghasilkan L-citrulline
(L-cit) dan NO melalui perantara arginin NG-hidroksi-L
(NG-OH-L-arg; Stuehr et al, 1991.). Hanya senyawa ini
saja yang dapat mendukung reaksi lengkap (Grifth dan
Stuehr, 1995).
NO terlibat dalam berbagai aspek fungsi reproduksi,
termasuk kontraktilitas uterus, ereksi penis, ovulasi dan
pembuahan (Burnett et al, 1996;. Kuo et al, 2000.). NO
dapat
mempengaruhi
pertumbuhan
folikel
dan
perkembangan melalui aksi vasodilatasi mempengaruhi
30

aliran darah ke folikel (Jansen, 1975;

Bonello et al., 1996), atau melalui efek langsung pada
interaksi seluler lokal, seperti spesies oksigen reaktif
lainnya. Sebagai contoh, NO mungkin terlibat dalam
perusakan dinding folikel pada ovulasi (Jablonka-Shariff
dan Olson, 1997) atau memiliki efek pada proses apoptosis
yang diperlukan untuk renovasi jaringan (Chun et al., 1995).
Peran radikal bebas seperti NO dalam sistem reproduksi
yang kompleks, karena dapat mempengaruhi proses seluler
melalui berbagai mekanisme dan dengan kedua dampak
baik positif maupun negatif. Radikal bebas harus dikontrol
ketat untuk menghindari kerusakan jaringan yang tidak
direncanakan; Namun, sedikit yang diketahui tentang
bagaimana hal ini dapat terjadi dalam suatu sistem yang
terintegrasi seperti folikel. Transferin merupakan salah satu
faktor yang ditemukan dalam folikel yang dapat menekan
pembentukan spesies oksigen reaktif. Hal ini sering
ditambahkan ke media kultur sebagai suplemen, biasanya
dalam kombinasi dengan insulin dan selenium. Meskipun
efek menguntungkan kombinasi telah diamati dalam kultur
folikel manusia dan sapi (katska dan Rynska, 1998;. Wright
et al, 1999), dalam kultur folikel tikus, insulin adalah
merugikan (Eppig et al, 1998.). Peran transferin sendiri
dalam kultur folikel belum diteliti sebelumnya, jadi kami
mengambil kesempatan ini untuk melakukan studi
percontohan memeriksa kemungkinan

Human Reproduction vol. 19 no. 1 European Society of Human Reproduction and Embryology 2004; all rights reserve

Downloaded from http://humrep.oxfordjournals.org/ by guest on September 11, 2014

LATAR BELAKANG: oksida nitrat (NO) adalah penyampai pesan sel dengan beberapa cara dalam sistem biologis
yang berbeda, diimplikasikan dalam kontrol folikel dan fungsi oosit. NO dibentuk dari L-arginine oleh isoform nitric
oxide synthase (NOS) melalui NG-hidroksi-L-arginine, dengan L-citrulline sebagai produk sampingan. Penelitian
ini bertujuan untuk menunjukkan bagaimana modulasi NO dengan memanipulasi substrat NOS akan
mempengaruhi pertumbuhan folikel mouse dan ovulasi in vitro, dimana efek vaskuler NO dilemahkan. METODE:
Imunohistokimia [endotel (eNOS) dan diinduksi (iNOS)] dan hibridisasi in situ (iNOS) yang diterapkan pada
ovarium tikus. Folikel yang dikultur juga terwarnai untuk iNOS dengan imunohistokimia. Untuk folikel yang dikultur
dengan ada atau tidaknya L-arginin, kemampuan L-citrulline atau NG-hidroksi-L-arginin untuk menggantikan Larginine dinilai dalam hal pertumbuhan folikel dan ovulasi. HASIL: iNOS dan eNOS ditemukan pada oosit dan
teka, dengan beberapa pengecatan di granulosa. iNOS mRNA terjadi terutama di granulosa dan oosit. Kelalaian
dari L-arginin secara signifikan mengurangi kelangsungan hidup folikel dan ovulasi. Kompensasi parsial untuk
penarikan L-arginine dicapai dengan L-citrulline dan arginin NG-hidroksi-L. Kelainan spesifik pertumbuhan folikel
dicatat. KESIMPULAN: NOS hadir dalam folikel tikus, dan aksinya diperlukan di tingkat lokal untuk perkembangan
folikel normal in vitro. Pertumbuhan yang terhambat, membran dasar yang persisten dan berkurangnya ovulasi
dikaitkan dengan gangguan NO in vitro.

Effects of NO in mouse
follicles

interaksi transferin dengan jalur radikal bebas NO dalam

kultur folikel.
Ada ketidakpastian tentang NOS isoform(s) mana yang
mungkin terlibat dalam produksi NO selama perkembangan
folikel ovarium dalam mamalia in vivo. Dalam folikel terkultur,
sistem vaskular fungsional berkurang, meskipun beberapa
carry-over dari sel endotel penduduk di lapisan teka baru lahir
dapat terjadi. Model ini menawarkan kesempatan untuk
mempelajari efek lokal jalur NO pada pertumbuhan folikel. Jika
TIDAK terlibat, maka perubahan signifikan dalam setidaknya
salah satu isoform NOS mungkin terjadi selama pertumbuhan
folikel dan ovulasi, yang tampaknya memang terbukti dengan
iNOS dan eNOS, meskipun tidak dengan nNOS (Srivastava et
al., 1997).
Kami berangkat untuk mempelajari lokasi dan peran NO
dalam perkembangan folikel menggunakan model in vitro
pertumbuhan folikel tikus dan ovulasi (Cortvrindt et al, 1996;.
Mitchell et al, 2002.). Dalam sistem ini, folikel individu yang
secara manual didiseksi tetap berhubungan dengan sel teka,
tetapi tidak memiliki suplai darah dan persarafan yang akan ada
in vivo. Namun, arsitektur folikel yang menipis memungkinkan
pengamatan yang jelas dari perkembangan folikel, dan
menghasilkan oosit yang layak (Cortvrindt et al., 1996). Kami
menilai keberadaan iNOS dan eNOS di ovarium tikus dewasa
yang tidak terstimulasi, dan dalam folikel kultur dari sumber
yang sama, menggunakan imunositokimia. Jalur NO kemudian
dimanipulasi dalam kultur folikel tikus untuk menentukan apakah
prekursor (L-arg), menengah (NG-OH-L-arg) dan produk akhir
(L-cit) dari NOS mempengaruhi perkembangan folikel tikus,
kelangsungan hidup dan ovulasi in vitro. Sebuah penilaian awal
terhadap kemungkinan interaksi apo-transferin dengan sistem
NO juga disajikan.

Materials and methods

Tikus B6CBF1 disimpan di University of Warwick dengan
siklus terang:gelap 12:12 h dan makanan dan air ad libitum.
Tikus-tikus tersebut dipantau setiap hari dan perempuan
berusia antara 24 dan 30 hari yang digunakan dalam
percobaan ini.
Metode kultur folikel seperti yang dijelaskan dan ekstensif
dicirikan sebelumnya (Mitchell et al., 2002). Briey, folikel
preantral kecil yang dibedah secara manual dari ovarium
Quartered menggunakan 29 alat ukur jarum. Folikel yang
dipilih untuk kultur yaitu bulat, basement membrane utuh dan
oosit terletak sentral. Diameter rataa-rata pada awal kultur
adalah ~ 135 m. Setiap tikus menghasilkan ~ 30 60
folikel. Folikel individu dikultur dalam microdrops bawah
minyak dalam medium esensial minimum (MEM) (Gibco,
UK) yang mengandung 5% serum janin anak sapi (FCS;
Gibco), penisilin (50 g / ml), streptomisin (50 g / ml ) dan
FSH (100 mIU / ml; hpMetrodin, Serono, UK). Media diganti
setiap dua hari. Folikel yang dianggap telah selamat adalah
ketika oosit dipertahankan, mereka tampak berbentuk bulat,
dan sel-sel folikel yang tidak tampak degenerasi. Kriteria ini
sebelumnya telah divalidasi menggunakan Fluoresen
pewarna vital (Mitchell et al., 2002). hCG (1,5 IU / ml; Profasi;
Serono) ditambahkan pada hari 10 dan ovulasi dinilai 16, 24,
40 dan 48 jam kemudian. Respon terhadap hCG, ketepatan
ovulasi, dan penampilan dan perluasan cumulus dari oosit
yang ovulasi digunakan sebagai indikator kesehatan folikel,
seperti yang dijelaskan sebelumnya (Mitchell et al., 2002).
Ovulasi normal dianggap ovulasi dalam 16 jam setelah hCG
dari oosit translusen bulat dikelilingi oleh sel-sel kumulus.
Total angka ovulasi dihitung sebagai jumlah folikel yang
ovulasi sebagai proporsi jumlah awal yang dikultur. Tingkat
ovulasi tepat waktu dihitung sebagai jumlah folikel berovulasi

dalam 16 jam dari dosis hCG, sebagai proporsi dari total

jumlah awalnya berbudaya.
Untuk memudahkan proses histologis, beberapa folikel
dikultur secara individual dalam slide 8-baik ruang (Nunc;
Gibco) dalam 0,5 ml media tanpa minyak. Penampilan
morfologi folikel di sini mirip dengan yang dalam kultur standar.
Untuk imunositokimia, ovarium terisolasi, terfiksasi pada
suhu kamar dalam buffer formalin netral selama 24 72 jam,
dehidrasi dalam etanol dan dibersihkan dalam xylene sebelum
dicelupkan dalam lilin parafin. Bagian dari ~ 6 m dipasang
pada slide Vectabond berlapis (Vector Laboratories, UK).
Folikel dikultur di slide ruang yang terfiksasi di 150 l dari
buffer formalin netral selama 16 jam pada suhu kamar. xative
dihilangkan dan 10% agar cair di ~ 65C ditambahkan dan
dibiarkan mengeras selama 30 menit pada suhu kamar.
Kamar-kamar tersebut kemudian dihapus dan blok agar yang
mengandung folikel dengan lembut copot dari slide sebelum
pemangkasan dan pengolahan untuk histologi seperti di atas.
Karena kesulitan dengan pemotongan dan pengolahan bagian
dari folikel ini yang menipis dalam kultur, hanya iNOS
immunocytochemistry dicoba.
NOS imunositokimia
Deteksi iNOS dilakukan dengan menggunakan salah satu dari dua
antibodi primer:
(I) poliklonal kelinci anti-tikus iNOS (PA3-030; Afnity Bioreagents,
UK) dan (ii) poliklonal kelinci anti-tikus iNOS (N52920, Transduksi
Laboratories, USA). Pengenceran 1/400 ditemukan menjadi optimal.
eNOS dideteksi dengan menggunakan kelinci poliklonal anti-sapi
eNOS (Affinity Bioreagents) menggunakan konsentrasi optimal dari
1/300. Antibodi ini dilaporkan oleh produsen mengalami reaksi silang
dengan mouse eNOS.
Deparafinisasi, slide terehidrasi diinkubasi dalam 1,5% serum
blocking normal dalam phosphate-buffered saline (PBS) selama 20
menit. Slide dihapuskan diinkubasi dalam antibodi primer selama 1
jam pada suhu kamar. Deteksi dilakukan dengan menggunakan antikelinci IgG Vectastain Elite ABC kit, menurut instruksi pabrik,
menghasilkan merah warna coklat di daerah-daerah antibodi
primer terikat. Hematoksilin Harris memberikan counterstain biru.
Untuk setiap percobaan, kontrol terdiri bagian negatif diinkubasi
tanpa antibodi primer. Dalam beberapa percobaan, iNOS bagian
tikus KO paru-paru dan rahim memberikan kontrol negatif kedua.
Sampel dari tikus knockout iNOS yang baik yang diberikan oleh Dr
Andrew Thomson dari Glasgow Royal Infirmary, Skotlandia.
In situ hybridization for iNOS mRNA
Hibridisasi in situ dilakukan dengan menggunakan variasi metode
yang dijelaskan oleh Heidaran et al. (1988) dan Shih dan Kleene
(1992). Sebuah digoksigenin (DIG) sistem deteksi asam nukleat
digunakan sesuai dengan petunjuk pabrik.
Dalam hibridisasi in situ dilakukan dengan menggunakan anti-sense
probe RNA iNO. Sense probe sesuai digunakan sebagai kontrol
negatif. Probe RNA diproduksi dari cDNA clone parsial untuk tikus
iNOS (95% homolog dengan tikus iNOS), dengan murah hati
disediakan oleh Dr Bruce Kone, University of Texas, Houston,
Amerika Serikat. Probe yang dihasilkan adalah ~ 250 300
pasangan basa panjang dan bebas dari kontaminasi (data tidak
ditampilkan).
Ovarium tikus Seluruh yang terfiksasi segera setelah diseksi dengan
inkubasi semalam di paraformaldehyde 4%, pH7, di 4 oC. Ovarium
kemudian diseimbangkan dalam segar 0,5 mol / l sukrosa di PBS
pada suhu kamar selama 1 jam sebelum dimasukkan ke dalam
0,85% (b / v) NaCl selama 15 menit pada 4 C. Ovarium kemudian
dehidrasi dalam seri etanol, dibersihkan dalam xylene dan tertanam
dalam lilin parafn untuk sectioning pada 6 ketebalan m

31

Hybridization and detection of probe

Bagian dideparafinisasi di xylene dan terhidrasi dalam seri etanol ,
ditempatkan dalam PBS dan ke 2xsaline natrium sitrat (SSC).
Bagian yang dicerna dengan 10 ug/ml proteinase K (Sigma) dalam
air suling dengan 0,1 mol/l Tris HCl (BDH, pH 8) dan 50 mmol/l
EDTA selama 5, 10, dan 30 menit pada 37oC (Inderdeo et al, 1996;.
Berruti et al , 1998). Bagian diperlakukan dengan 0,25 % (v/v)
anhidrida asetat (Sigma) dalam 0.1 mol/l triethanolamide (BDH)
selama 10 menit dan didehidrasi dalam seri etanol. Bagian
kemudian diprehibridisasi dalam buffer hibridisasi selama 60 menit
pada 40oC. Buffer hibridisasi terdiri 5 ml 50 % formamida, 100 ul 1
mol/l Tris HCl pH 8, 20 ul 0,5 mol/l EDTA, 200 ul solusi
50xDenhart, 500 ul 10 ug/ml tRNA (Sigma), 4.18 ml dH2O. Sulfat
dekstran (0,5 g; Sigma) ditambahkan ke 5 ml buffer hibridisasi, lalu
5 ng/ul probe ditambahkan ke volume hibridisasi penyangga
menghasilkan 20 ul solusi probe/slide. Campuran ini dipanaskan
sampai 80oC, didinginkan di atas es dan diterapkan pada bagian.
Sebuah penutup parafilm digunakan dan slide dipanaskan sampai
80oC selama 10 menit dan kemudian diinkubasi selama 16 jam
pada 40oC dalam kotak kelembaban. Bagian dicuci di 2xSSC pada
suhu kamar selama 30 menit dan kemudian diobati dengan 100
ug/ml RNase A (Boehringer) di 2xSSC selama 60 menit pada 37 oC.
Bagian akhirnya dicuci di 0.5xSSC selama 30 menit pada 50 oC.
Bagian dibilas dalam saline Tris - buffered (TBS) dan solusi
penghalang ditambahkan [8 ml TBS, 0,3 g bovine serum albumin,
10 ul Triton X-100 (BDH), dan 2 ml serum domba normal (Sigma) ]
selama 30 menit pada suhu kamar. Bagian dibilas di TBS, lalu
1/500 pengenceran anti-DIG alkaline phosphatase conjugate

(Boehringer) di TBS ditambahkan pada setiap bagian dan diinkubasi

selama 3 jam pada suhu kamar. Slide dibilas dua kali di TBS dan
kemudian disetimbangkan di penyangga substrat (18 ml air suling, 2
ml Tris pH 9, 0.22 g MgCl2 dan 0,12 g NaCl) selama 5 menit pada
suhu kamar. Alkaline fosfatase substrat (Boehringer, 10 ml substrat
penyangga, 80 ug/ml tetrazolium nitro-biru dan 175 ug/ml 5-bromo-4chloro-3-indolyl-fosfat) diaplikasikan pada bagian, ditutupi dengan
parafilm dan dibiarkan selama 3 hari dalam gelap. Slide dibilas di
bawah air mengalir selama 15 menit, didehidrasi dalam seri etanol,
dibersihkan dalam xylene dan dipasang dengan DPX.
Bagian kontrol diinkubasi tanpa probe atau dengan sense probe.
Selain itu, bagian dari paru-paru dari tikus KO iNOS diinkubasi
dengan anti -sense probe.
Modulation jalur NO
Dalam rangka memodulasi jalur NO, berbagai konsentrasi substrat
NOS diterapkan secara in vitro. Folikel dikultur dalam L-arg bebas
MEM (special order, Gibco) dengan suplemen kultur lainnya tidak
berubah dan menggunakan kultur dan analisis teknik standar yang
sebelumnya sudah divalidasi untuk sistem ini (Mitchell et al., 2002).
Setiap percobaan diulang minimal enam kali dengan > 30 folikel per
eksperimen dan hasil eksperimen disusun untuk menghasilkan hasil
tabel. Tingkat kelangsungan hidup folikel dan ovulasi dibandingkan
dengan kultur yang di MEM lengkap (L-arg konsentrasi 600 umol/l)
atau media bebas L-arg dengan L-arg (Sigma) ditambahkan kembali
pada 600 umol/l. Pengaruh apo-transferin (10 ug/ml) pada
perkembangan folikel dinilai dengan ada tidaknya L-arg.
Untuk menentukan efek relatif intermediet yang berbeda dari jalur
NO, L-cit (0, 6, 60, 600 umol/l ; Sigma) atau NG-hidroksi-Larg
(Sigma, 0, 6, 60, 600 umol/l) ditambahkan sebagai suplemen untuk
L-arg bebas MEM. Ovulasi dan kelangsungan hidup in vitro
dibandingkan dengan folikel yang dikultur dengan atau tanpa L - arg.
Sebelum digunakan, L-cit dan NG-hidroksi-L-arg dibuat sebagai
x100 stok konsentrasi di media tanpa L-arg dan FCS. Reagen stok
tersebut ditambahkan dalam volume 1% pada media kultur yang
diuji. Hal ini menghindarkan kemungkinan L-arg yang terbawa
mempengaruhi hasil. Percobaan modulasi jalur NO dilakukan tanpa
adanya apo-transferin .
Statistik
Tingkat kelangsungan hidup dan ovulasi dinilai dengan 2x2 tabel
kontingensi, dengan x2 -test . P < 0,05 dianggap signifikan.

Hasil
Deteksi iNOS
Pada potongan ovarium, antibodi anti-iNOS PA3-030
menghasilkan pewarnaan positif pada teka dan ooplasma
dengan pewarnaan lemah pada granulosa folikel semua
ukuran preantral-antral. Kedua anti-iNOS antibodi (N52920)
menunjukkan distribusi yang sama dengan pewarnaan yang
lebih intens (Gambar 1a). Bagian kontrol negatif tanpa
antibodi primer tetap tidak terwarna (Gambar 1b). Bagian dari
iNOS tikus yang diinkubasi sesuai dengan protokol penuh
tidak menunjukkan pewarnaan. Folikel tikus tertanam setelah
kultur 10 hari mengalami penipisan, sehingga hanya sel-sel
granulosa dan kadang oosit ada pada bagian horisontal.
Antibodi PA3-030 terhadap iNOS mewarnai oosit dan
beberapa sel folikel luar (Gambar 1c, d). Kontrol negatif tanpa
antibodi primer tetap tidak terwarna. Pembagian dan

Downloaded from http://humrep.oxfordjournals.org/ by guest on September 11, 2014

DIG-UTP-labelled probes
CDNA clone parsial tikus iNOS diklon 5 hingga 3 ke situs
EcoRI dan BamHI dari pBluescript KS +. Sampel disentrifugasi
selama 15 menit pada 13 000 g , supernatan dibuang dan
pelet dicuci dengan 100 ul 75 % etanol . Etanol telah dihapus
dan dibuang , dan etanol tersisa dibiarkan menguap dari pelet
DNA pada suhu kamar selama 20 menit . DNA disuspensi
kembali dalam 10 ul dari dH2O dan konsentrasi ditentukan
secara spektrofotometrik
Mencerna enzim restriksi dilakukan sesuai dengan instruksi
pabrik. Plasmid DNA (4 ug) dicerna dengan 1 ul BamHI
(Gibco , 10 IU/ul ) atau 1 ul EcoRI (Gibco, 10 IU/ul) dengan
buffer reaksi 1 ul (Gibco) dan 4 ul air suling . Hal ini dicampur
secara merata dan dibiarkan selama 60 menit pada 37oC .
DNA terlinearisasi itu dibersihkan menggunakan kit QIA Gel
Ekstraksi Cepat (Qiagen) dan berjalan dalam 13TBE (Tris,
borat, EDTA buffer) pada gel agarosa 1 % dengan standards
untuk menentukan jumlah DNA yang hadir .
Plasmid kemudian dituangkan dalam reaksi 20 ul yang
terkandung ~ 1 ug DNA , 50 IU T3 atau T7 (Boehringer, UK),
1xtranscription penyangga (Boehringer), 10 IU RNase inhibitor
(Gibco) dan 0,5 mmol/l DIG-UTP berlabel nukleotida (Boehringer).
Solusinya adalah benar-benar dicampur dan diinkubasi selama 2
jam pada 37oC. Reaksi dihentikan pada 65 oC selama 10-15 menit
dan kemudian DNase (RNase bebas; Boehringer) ditambahkan
pada 1 IU/ug DNA dan diinkubasi pada 37oC selama 15 menit .
Reaksi ini dihentikan dengan penambahan 2 ul dari 0,2 mol/l EDTA
(BDH, UK) pH 8,0. RNA diendapkan pada 70 oC untuk > 30 menit
dengan 0,5 volume 10 mol / l amonium asetat (BDH) dan 2,5
volume 100% etanol. RNA ditemukan oleh sentrifugasi pada 3000 g
selama 20 menit pada 4oC, dicuci dalam 100 ul 70% etanol dan
disentrifugasi lagi selama 5 menit. Etanol ini kemudian dihapus
dengan hati-hati dan pelet disuspensikan dalam 20 ul dH2O dan
ditempatkan di atas es. Salah satu mikroliter persiapan RNA
dijalankan pada 1 % gel agarosa (Gibco), bersama-sama dengan
jumlah yang telah diketahui DNA dan difoto di bawah sinar UV .
Probe RNA disimpan pada 70oC sampai dibutuhkan

Downloaded from http://humrep.oxfordjournals.org/ by guest on September 11, 2014

Figure 1. Lokalisasi iNOS, iNOS mRNA and eNOS pada ovarium tikus. Ovarium tikus 4 minggu diwarna dengan (a) anti-iNOS
antibody (N52920, 1/400) mendeteksi iNOS (coklat) di oosit dan sel teka dan faint staining pada sel granulosa. Nukleus vesikel
germinal, terlihat di satu oosit berarti negative iNOS. (b) Kontrol negatif. (c dan d) Potongan folikel tikus kultur 10 hari. Anti-iNOS antibody
(PA3- 030, 1/400) menunjukkan pewarnaan coklat positif di oosit dan sel granulosa luar. Beberapa sel granulosa dalam juga positif
terhadap iNOS. Ovarium tikus 4 minggu dengan hibridisasi in situ iNOS mRNA. (e) Anti-sense probe menunjukkan sinyal positif
(ungu) pada oosit dan sel granulosa sekitarnya. (f) Anti-sense probe mewarnai positif pada oosit dan sel granulosa dan lemah pada sel
teka. Nukleus dalam oosit tidak terwarna. (g) kontrol negatif, hanya buffer. (h)Kontrol negatif, sense iNOS mRNA probe. Ovarium
tikus 4 minggu terwarna dengan (i) anti-eNOS antibody (1/300) mendeteksi eNOS (coklat) pada oocyte, sel teka dan sel granulosa
beberapa folikel. Pembuluh darah juga terwarna. (j) kontrol negatif. Bar = 100 m.

tanpa adanya L - arg, 36 % selamat, 15 % ovulasi (P <

penanganan spesimen ini sulit dan sangat terbatas data

yang dapat diperoleh .
Deteksi iNOS mRNA
Sinyal positif iNOS mRNA terdeteksi pada sel granulosa
dan oosit (Gambar 1e). Sel granulosa dan oosit dalam
folikel berbagai ukuran dari preantral ke antral terwarna.
Terlihat pewarnaan lemah dan ireguler pada sel teka
(Gambar 1f). Tidak ada sinyal yang diproduksi pada
kontrol negative ; penyangga hibridisasi saja (tanpa
penyelidikan, Gambar 1g) , iNOS sense probe ( Gambar
1 h ) atau menggunakan anti-sense probe pada bagian
hati dari tikus (tidak terlihat) .
Deteksi eNOS
Pewarnaan positif untuk eNOS terdeteksi pada pembuluh
darah, seperti yang diharapkan, dan juga dalam oosit dan
sel teka. Pewarnaan juga terlihat di sel-sel granulosa dari
folikel dari berbagai ukuran dari preantral ke antrum , seperti
yang ditunjukkan pada Gambar 1i. Sedikit pewarnaan non
spesifik terjadi di bagian kontrol negatif tertahan tanpa
antibodi primer ( Gambar 1j ) .
Kultur folikel
Pengaruh adanya L arg
Gambar 2 menunjukkan bahwa kelalaian L-arg
mengurangi kelangsungan hidup folikel dan ovulasi.
Folikel dikultur di MEM standar memiliki tingkat
kelangsungan hidup 77 % dengan 71 % ovulasi dan

Gambar 3 Folikel dikultur dengan dan tanpa L - arginine ( semua

pembesaran asli x100 ) . (a) Hari 3 , Arg + . Oosit sentral, sel teka
melekat pada dish, sel-sel folikel sehat dan membran basal utuh .
Folikel ini ovulasi normal karena hCG pada hari 11 ,
menunjukkan statusnya sehat . (b) Hari 3 , Arg . Tidak ada
perbedaan yang jelas dari a. Folikel ini membentuk antrum pada
hari ke 5 dengan membran basal yang tersisa utuh sampai akhir.
Tidak ada ovulasi walau dengan hCG . (c) Hari 5 , Arg + . Sel
telah melewati membran basal dan bermigrasi , oosit pusat dan
sel-sel folikel tampak sehat . Folikel ini membentuk antrum pada
hari ke 6 tapi terlambat berovulasi (> 16 jam setelah hCG). (d)
Hari 5 , Arg- . Sel teka melekat pada piring , sel-sel granulosa
sehat dan rongga antral telah dimulai. Folikel ini tampaknya
berkembang secara normal namun membran basal masih utuh.
Folikel ini tetap sebuah membran basal utuh sampai akhir dan
tidak merespon hCG. (e) Hari 8 , Arg + . Rongga antral terlihat
dengan oosit dikelilingi oleh sel-sel kumulus. Folikel ini berovulasi
secara normal karena hCG. (f) Hari 8 , Arg- . Rongga antral
dengan membran basal yang tersisa utuh sampai akhir. Sel
granulosa menjadi gelap dan tidak ada respon terhadap hCG . ( g
) Hari 8 , Arg-. Sel folikel yang melekat pada dish tapi tampak
degenerasi dan gelap, oosit oval , tidak merespon hCG. (h) Hari
8 , Arg-. Rilis prematur dari oosit telanjang oleh hari ke-8 Bar =
100 um .

0,001) . Ketika 600 umol /l L - arg ditambahkan kembali ke

medium L - arg bebas, tingkat kelangsungan hidup 88 % lebih
besar dari pada dalam medium lengkap (P < 0,05) dan
medium tanpa L - arg (P < 0,001). Dalam media yang
ditambahkan L-arg kembali, 75 % dari folikel ovulasi tidak
berbeda dengan MEM standar, tapi lebih besar dari pada
tidak adanya L - arg (P < 0,001). 85% persen folikel yang
ovulasi normal, dengan L arg ini, oosit dirilis dengan sel
cumulus terpasang, dibandingkan dengan 47 % dari mereka

Downloaded from http://humrep.oxfordjournals.org/ by guest on September 11, 2014

Figure 2. Efek L-arginine pada survival folikel tikus dan ovulasi

in vitro. Folikel di kultur pada medium tanpa L-arginine (Arg-)
memiliki (P < 0.001) survival rate lebih rendah dari yang dikultur
pada medium standar (Arg+), atau Arg- yang ditambahkan
kembali 600 mol/l L-arg. Laju ovulasi mirip dengan Arg+ and
medium yang ditambah kembali L-arg; keduanya lebih besar dari
Arg- (P < 0.001).

dalam medium bebas L arg (P < 0,00)

L.M.Mitchell, C.R.Kennedy and G.M.Hartshorne

Table I. Perbandingan pertumbuhan folikel dan ovulasi pada kondisi dimana L-arginin (600 mikromol/l)dan/atau apo-transferrin
(10 g/ml) tersedia

L-Arginine
Apo-transferrin

Culture
conditions

Total no. of follicles cultured

282
Surviving (%)
7b
Total ovulation rate (%)
14
Timely ovulation rate (<16 h) (%)
12
Features of `surviving' follicles
Healthy (%)
4
Dark (%)
43
Unhealthy/degenerative (%)
24
Arrested growth (%)
17
Cells sparsely attached (%)
Dark or degenerating with basement membrane apparently intact 12d
(%)
Dark mass of cells (%)
Spontaneous release of oocyte (%)
3

+
+

198
55b
9
8

220
90
86a
78c

194
84
75a
59c

2
12
6
1
7
68d
4

61
39

71
29

Data
from
repeat
experiments.
Values
with21same
superscripts
are signicantly different.
aP < 0.01.
b,c,dP < 0.001.
folikel dianggap telah dapat bertahan hidup menggunakan
Morfologi perkembangan folikel yang dibudidayakan
dengan atau tanpa L-arg jelas berbeda dari sekitar hari ke5 dari pembudidayaan (lihat Gambar 3). Pada hari 3,
kedua kultur folikel baik dengan dan tanpa L-arg telah
melekat pada bagian bawah dish. Dalam medium lengkap,
hari 5, sel telah rusak struktur spherical normalnya,
mungkin disebabkan karena menembus membran basal,
dan tersebar di dish; rongga antral dibentuk pada sekitar
hari ke-8 dan folikel tampak sehat dengan sel yang
translusen. Kultur folikel tanpa L-arg dikembangkan
dalam berbagai cara dari hari 5 dan seterusnya (lihat Tabel
I). Beberapa mempertahankan struktur utuh dengan
rongga antral, sementara yang lain merosot. Beberapa
folikel dalam kondisi ini secara prematur merilis oosit
telanjang pada hari ke 8.
Pengaruh apo-transferin pada folikel yang dibudidayakan
dengan dan tanpa L-arg
Tabel I menunjukkan bahwa semua folikel yang
dibudidayakan tanpa L-arg memiliki tingkat kelangsungan
hidup dan ovulasi rendah. Dengan tidak adanya L-arg,
kultur folikel dengan apo-transferin memiliki tingkat
kelangsungan hidup lebih tinggi yang signifikan (55%)
dibandingkan dengan kultur tanpa apo-transferin (27%) (P
<0,001); Namun, berbagai fitur yang abnormal yang
diamati pada folikel ini, termasuk sel-sel granulosa gelap
atau tidak sehat muncul, yang mungkin menunjukkan
degenerasi yang akan datang. Tingkat ovulasi sama
rendahnya masing-masing pada 9 dan 14%. Mayoritas
36

kriteria yang telah kami tetapkan sebelumnya menunjukkan

fitur perkembangan abnormal dan kerusakan (Tabel I). Ada
perbedaan yang tak terduga dan sangat signikan (P <0,001)
dalam proporsi folikel di mana struktur granulosa, biasanya
terkandung dalam membran basal, tetap utuh pada akhir
kultur (68% dengan apo-transferin versus 12% tanpa).
Menariknya, 3% dari kultur folikel tanpa L-arg atau apotransferin secara spontan mengeluarkan oosit yang
dikelilingi oleh sel cumulus, tanpa paparan hCG. Sebanyak
delapan folikel merilis oosit mereka dengan cara ini (6 hari
8, 1 pada hari 9 dan 1 pada hari ke-10) dalam lima
percobaan terpisah, tetapi hanya ketika media kekurangan
L-arg dan apo-transferin. Rilis oosit tersebut adalah jelas
dapat dibedakan dari yang dianggap sebagai `Ovulasi 'in
vitro ketika terjadi sebagai respon terhadap hCG.
Berbeda dengan hasil ketika L-arg tidak ada, folikel
yang dikultur dalam medium yang mengandung L-arg tapi
kurang apo- transferrin memiliki jumlah yang lebih tinggi
secara signifikan (86 vs 75%, P <0,01) dan tepat waktu (<16
jam) dalam hal kecepatan ovulasi (78 vs 59%, P <0,001),
meskipun tingkat kelangsungan hidup tidak jauh berbeda,
dibandingkan dengan yang mengandung L-arg dan apotransferin (Tabel I). Mayoritas kultur folikel dengan L-arg
tampak sehat dalam penampilan, terlepas dari apakah ada
apo-transferin. Oleh karena itu apo-transferin memiliki efek
positif pada kelangsungan hidup folikel ketika L-arg tidak
hadir, tapi efek yang merugikan pada ovulasi ketika L-arg
hadir.

Effects of NO in mouse
follicles

Penambahan L-cit ke media L-arg bebas

Tabel II menunjukkan respon kultur folikel dalam kondisi
di mana L-arg diganti dengan L-cit pada konsentrasi
antara 0 dan 600 mikromol / l, dibandingkan dengan
medium lengkap yang mengandung 600 mikromol / l Larg, semua dalam ketiadaan dari apo-transferin.
Kelangsungan hidup folikel dan kecepatan ovulasi yang
lebih rendah tanpa adanya L-arg dibandingkan dengan
medium lengkap (P <0,001), mengkonfirmasi hasil
sebelumnya. Dimasukkannya konsentrasi L-cit yang
semakin besar mengakibatkan peningkatan kelangsungan
hidup folikel dan kecepatan ovulasi, serta penampilan
cumulus pada ovulasi, meskipun konsentrasi maksimum
600 mikromol / l tidak sepenuhnya mengkompensasi
absen L-arg.
Kultur folikel tanpa L-arg atau L-cit dikembangkan
dengan cara yang sama dengan yang di media kontrol
sampai hari 5 pembudayaan. Sel folikel melekat pada
bagian bawah dish dan kadang-kadang rongga antral

kecil bisa dilihat (Gambar 4a, b). Setelah waktu ini,

folikel tanpa L-cit atau L-arg mulai berubah menjadi
massa gelap dengan sel yang jarang melekat (Gambar
4g) dan pada hari ke 10 jelas terlihat tidak sehat

(Gambar 4l). kultur folikel dengan 6 mikromol / l

L-arg adalah serupa pada hari ke 4 (Gambar 4c) dan
pada hari ke 8 beberapa telah membentuk rongga antral
kecil yang mirip dalam penampilan (Gambar 4h) dengan
kontrol (Gambar 4f). Namun, sampai 10 hari, sel-sel
folikel yang gelap dan jarang melekat pada dish tanpa
rongga antral nampak (Gambar 4m). Daya tahan dan
folikel non-degeneratif dibudidayakan di 60 mikromol /
l L-cit dikembangkan dengan cara yang sama ke folikel
kontrol sampai hari ke-10 (Gambar 4d, i). Pada hari 10
beberapa folikel dalam kelompok kultur ini masih
muncul sehat (Gambar 4n) tetapi yang lain telah merosot
dengan sel yang lebih jarang terpasang. Folikel yang
dibudidayakan di 600 mikromol / l L-cit tumbuh sama
dengan kontrol (Gambar 4e, j, o).

37

T
able II. Perbandingan pertumbuhan folikel dan ovulasi pada keadaan dimana L-arginine (600 mol/l) diganti dengan
0600 mol/l L-citrulline

L-Arginine
L-Citrulline

Culture
conditions
600 mol/l
0

No. of follicles
75d
Surviving (%)
93
Total ovulation rate (%)
88c
Timely ovulation rate (<16 h) (%)
80b
Extent of cumulus attachment for oocytes ovulated <16 h
post hCG mucied (%)
Extensive,
98
Few or dark cells (%)
2
Nude (%)

0
0

0
6 mol/l

76a
20
20
17

76
24
20
20

0
60
mol/l
75
37a,d
34
33

23
8
69

40
7
53

68
4
28

0
600
mol/l
76
74
70c
63b
8
2

90

Data
from
repeatsuperscripts
experiments.
Values
withsix
similar
are signicantly different.
a,bP < 0.02.
cP < 0.01.
dP < 0.001.
Penambahan NG-hidroksi-L-arg ke media kurang L-arg
Tabel III menunjukkan efek pelengkap media bebas Larg- dengan NG-hidroksi-L-arginine pada kelangsungan
hidup dan ovulasi folikel tikus. Demikian pula untuk
suplementasi L-cit, peningkatan konsentrasi NGhidroksi-L-arg diperbolehkan pemulihan parsial
tergantung dosis kelangsungan hidup folikel dan ovulasi,
meskipun kompensasi penuh untuk penarikan L-arg
tidak tercapai pada konsentrasi molar yang sama.
Efektivitas relatif L-cit dan NG-hidroksi-L-arg untuk
menggantikan L-arg, dalam hal kelangsungan hidup
folikel, jumlah ovulasi dan ovulasi tepat waktu,
disajikan pada Gambar 5. log kurva dosis respon
berbeda, konsentrasi yang menghasilkan respon 50%
menjadi ukuran yang lebih besar untuk L-cit
dibandingkan NG-hidroksi-L-arg.

Diskusi

Hasil yang disajikan menunjukkan adanya NOS di

ovarium, menunjukkan potensi produksi NO sebagai
peserta aktif dalam perkembangan folikel perempuan.
Manipulasi L-arg adalah metode standar yang
mempengaruhi produksi NO, digunakan karena
pengukuran langsung dari NO secara teknis sulit
karena sangat pendek waktu paruhnya. Dalam
penelitian ini, memanipulasi jalur unsur NO memiliki
efek merugikan pada fungsi folikel, diukur dengan
menggunakan indikator sensitif in vitro efisiensi
pengembangan dan ovulasi, yang sebelumnya
ditandai di laboratorium kami (Mitchell et al., 2002).
Hasil ini menunjukkan bahwa NO dapat
mempengaruhi pertumbuhan
folikel melalui
mekanisme langsung bahkan tanpa adanya pengaruh
sistemik.
Dalam penelitian ini, protein eNOS terdeteksi pada
oosit, teka dan sel granulosa dari folikel beberapa di
ovarium tikus dewasa. eNOS telah dilaporkan
sebelumnya pada oosit matang dari tikus dan tikus
(Nishikimi et al., 2001), dan kehadirannya di
granulosa lapisan sel meningkat selama pertumbuhan
folikel dirangsang (Jablonka-Shariff dan Olson,
1997). Lain telah menemukan eNOS terletak di
permukaan oosit pra-ovulasi dan ovulasi dan dalam
teka dan stroma folikel tumbuh sehat, sedangkan
pewarnaan sel granulosa adalah belang-belang

(Powers et al, 1996;. Jablonka-Shariff dan Olson, tampaknya sesuai dengan apa yang dikenal iNOS dalam
situasi lain, dan menunjukkan pemisahan antara transkripsi
1998).
dan translasi.

Dalam bagian ovarium dan kultur folikel, protein

iNOS dan mRNA, dan protein eNOS yang lokal
paling jelas untuk ooplasma tersebut. Kehadiran
iNOS pada oosit yang belum matang dalam tumbuh
dan
kecil
folikel
belum
sebelumnya
didemonstrasikan, meskipun keterlibatan NOS
dalam pematangan oosit telah disimpulkan dari
percobaan menggunakan inhibitor NOS (Sengoku
et al., 2001). iNOS dikenal untuk meningkatkan
secara substansial setelah pembuahan pada oosit
tikus ovulasi dan embrio (Nishikimi et al., 2001)
dan kehadirannya dirangsang oleh hCG pada tikus
(Jablonka-Shariff dan Olson, 1997).
Sangat menarik bahwa protein iNOS terletak
terutama di oosit dan teka ovarium tikus dewasa,
sedangkan iNOS mRNA terdeteksi pada sel
granulosa dan oosit. Komunikasi timbal balik antara
jenis sel folikel sebagian dapat menjelaskan ikatan
ini. Ribonucleotides ditransfer ke oosit melalui gap
junction dengan sel granulosa (Brower dan Schulz,
1982) dan peningkatan aktivitas polimerase
pertumbuhan oosit dan RNA adalah salah satu
tanda-tanda pertumbuhan folikel (Gosden et al.,
1993). Lainnya, bekerja pada tikus, menunjukkan
variasi tergantung siklus tingkat mRNA dan protein.
Dalam ovarium tikus dewasa sebelum ovulasi,
tingkat tinggi iNOS mRNA (Van Voorhis et al,
1995;.. Srivastava et al, 1997) (. Zackrisson et al,
1996) tetapi rendahnya tingkat protein iNOS terjadi
pada sel-sel granulosa. Setelah ovulasi, iNOS
mRNA berkurang, dan protein iNOS meningkat
(Jablonka-Shariff dan Olson, 1997; Srivastava et al,
1997.). Berbagai faktor transkripsi dan rangsangan,
termasuk NO itu sendiri, dapat mengatur gen iNOS
expression
sion
transcriptionally,
pascatranscriptionally dan translationally (Nathan dan
Xie, 1994b; Lysiak et al, 1995.). Banyak faktor
hadir dalam folikel memiliki kapasitas untuk
mempengaruhi level iNOS mRNA seperti interleukin
(IL) -4, IL-10 dan transforming growth factor (Roy dan
Kole, 1998). Oleh karena itu, kurangnya koinsidensi iNOS
mRNA dan protein terdeteksi dalam penelitian kami

Adanya protein iNOS pada kultur folikel menunjukkan

kemungkinan pembelajaran aksi NO pada perkembangan
folikel in vitro melalui manipulasi substrat. Evidensi untuk
keterlibatan NO pada ovulasi hewan pengerat dari in vivo
atau studi ovarium (e.g. Hesla et al.,1997;Mitsube et
al.1999). NO juga diketahui dapat menghambat
steroidogenesis pada kultur sel granulosa tikus. (Ahsan et al,
1997;. Dave et al, 1997.); Namun, tidak ada studi
sebelumnya telah meneliti peran NO dalam budaya folikel
individu.

Gambar 4 Pengaruh L-citrulline dalam mengganti persyaratan L-arginin dalam folikel tikus (semua magnifications asli 3100).
Kecenderungan progresif terhadap perkembangan normal (ditunjukkan pada baris atas) lebih lama in vitro diamati dengan
meningkatnya konsentrasi L-citrulline. (A) Sel telah menembus membran basal dan melekat pada dish. Folikel ini berovulasi
dalam menanggapi hCG. (B) Sel telah terpasang ke dish dan tampak sehat. Pada hari ke-8, folikel ini spontan merilis oosit
dikelilingi oleh sel-sel kumulus mucifed gelap. (C) Sel yang melekat pada dish. Folikel ini bertahan sampai hari ke 10 dan
ovulasi setelah penambahan hCG tapi gelap dalam penampilan dan merilis oosit telanjang. (D) Follicle muncul sehat pada hari
ke-4 tapi hanya bertahan sampai hari ke-7 ketika secara prematur merilis oosit telanjang.
(E) Sel yang melekat pada piring. Folikel ini membentuk rongga antral hari 8, tetap sehat sampai hari ke-10 dan ovulasi
biasanya dalam menanggapi hCG. (F) Follicle dengan rongga antral besar. Folikel ini berovulasi secara normal dalam
menanggapi hCG. (G) Sel yang melekat jarang dan oosit telanjang dirilis sebelum waktunya pada hari 10 (h) Follicle dengan
rongga antral. Folikel ini selamat namun gelap dalam penampilan. Itu berovulasi segera dalam menanggapi hCG tetapi sel
kumulus gelap dikelilingi oosit. (I) Follicle dengan rongga antral. Folikel ini bertahan sampai hari ke-10 dan berovulasi secara
normal. (J) Follicle dengan rongga antral besar. Sel-sel sehat dalam penampilan dan folikel ini berovulasi secara normal.
(K) Biasanya mengembangkan folikel antral dengan rongga, oosit pusat dikelilingi oleh cumulus. Folikel ini berovulasi secara
normal. (L) Sel adalah gelap dan jarang terpasang. Folikel ini berovulasi dalam menanggapi hCG tapi merilis oosit telanjang.
(M) Sel yang melekat pada piring tapi telah menyebar dan rongga antral belum terbentuk. Beberapa sel tampak gelap. Folikel
ini berovulasi segera dalam menanggapi hCG tapi oosit itu tidak memiliki cumulus. (N) Sel memisahkan dari piring dan
tampak gelap tapi rongga antral hadir. Meskipun penampilannya, folikel ini berovulasi secara normal. (O) Sel yang melekat
pada piring dengan rongga antral membentuk. Folikel ini berovulasi secara normal. Bar = 100 mikrom.

L.M.Mitchell, C.R.Kennedy and G.M.Hartshorne

Table III. Perbandingan pertumbuhan folikel dan ovulasi pada keadaan dimana L-arginine (600 mol/l) diganti dengan
0600 mol/l NG-hydroxy-L- arginine

L-Arginine
NG-Hydroxy-L-arginine

Culture
conditions
600 mol/l
0

No. of follicles
68
Surviving (%)
94a,d
Total ovulation rate (%)
90b,e
Timely ovulation rate (<16 h) (%)
87h
Extent of cumulus attachment for oocytes ovulated <16 h
post hCG
Extensive, mucied (%)
98f,g
Extensive, non-mucied (%)
Few or dark cells (%)
2
Nude (%)

0
0

0
6 mol/l

0
60 mol/l

67
15
12
10

66
23a
19b
17

64
78d
75e
66

43

36c

93g

57

64

0
600
mol/l
65
88
82
68h
71f
7
11
11

Data
from
repeatsuperscripts
experiments.
Values
withsix
similar
are signicantly different.
a,b,c,fP < 0.001.
d,g,hP < 0.01.
eP < 0.05.

Gambar 5 Log dosis kurva respon menunjukkan

eficiency relatif L-citrulline dan NG-hidroksi-Larginin dalam menunjangg kelangsungan hidup
dan ovulasi dari folikel tikus pada kultur
kekurangan L-arginin. r = L-arginin; h = Lcitrulline; A = NG-hidroksi-L-arginin.

Effects of NO in mouse
follicles

Penipisan dan reintroduksi L-arg banyak digunakan

sebagai metode untuk mempelajari peran NOS dan
karenanya NO pada sistem seluler in vitro. Ini
mengasumsikan bahwa tidak ada efek lain dari
penarikan L-arg selain dari yang dimediasi oleh jalur
NO. Literatur tidak memberikan bukti mekanisme lain
yang terlibat, tapi ini saat ini tidak dapat
dikesampingkan sebagai faktor penyumbang mungkin
dalam pengamatan yang kami sajikan. Informasi
tentang tingkat fisiologis substrat NOS hanya tersedia
untuk sel-sel endotel. Intraseluler L-arg konsentrasi
sampai 2 mmol / l dapat terjadi pada sel-sel endotel
baru terisolasi (Hecker et al, 1990b.), Sedangkan pada
sel kultur, tingkat berkisar 100-800 nikromol / l (Emas
et al, 1989.; Baydoun et al, 1990;. Hecker et al,
1990b) dan 200 400mikromol / l setelah 24 jam
kultur tanpa L-arg (Baydoun et al, 1990;. Hecker et al,
1990a.). Tingkat L-cit dari 150 mikromol / l
ditemukan dalam sel endotel aorta sapi berbudaya,
menurun menjadi 50 mikromol / l setelah 24 jam dari
deplesi L-arg (Baydoun et al., 1990). Kelalaian dari Larg dipengaruhi cepat penurunan total pool asam
amino intraseluler, tapi kadar asam amino mulai
menormalkan dalam waktu 24 jam, kecuali untuk Larg dan L-cit.
Jika intraseluler L-arg diatur sama dalam sel
kultur folikel, maka folikel tanpa L-arg dapat
mempertahankan perkembangan yang sama untuk
mengontrol folikel dengan memanfaatkan intra seluler
L-arg sampai kelelahan. Kultur folikel tanpa L-arg
kelihatannya sehat sampai hari 5, yang mungkin
menunjukkan waktu yang dibutuhkan untuk mencapai
tingkat kritis rendah L-arg. Kami dosis data respon
menunjukkan bahwa L-cit dapat didaur ulang menjadi
L-arg, jika L-arg kurang, seperti yang terjadi pada selsel endotel dan makrofag (Hecker et al, 1990a;..
Nussler et al, 1994). Folikel dikultur dengan L-cit
dapat menghasilkan L-arg dari itu melalui enzim
dengan aktivitas yang mirip dengan argininosuccinate
liase dan argininosuccinate sintetase. Sintesis L-arg
dengan cara ini dalam kondisi L-arg rendah dapat
memainkan peran signifikan dalam mengatur produksi
NO (Nussler et al, 1994.); Namun, eficiency dari
proses ini adalah cenderung rendah kecuali
konsentrasi yang berlaku

dari L-cit adalah> 60 mikromol / l, seperti yang

ditunjukkan pada Gambar 5 NG- Hydroxy- L-arg, jika
ada, akan menjadi substrat yang lebih efektif, tetapi
tingkat serum pada tikus dilaporkan sebagai 3,7
mikromol / l di basal dan 15,8 mikromol / l dalam
kondisi NOS-dirangsang (Hecker et al., 1995).
Sementara tingkat folikular NG-hidroksi-L-arg tidak
diketahui, tingkat digunakan dalam percobaan kami
supraphysiologis dan ketersediaan NG-hidroksi L-arg
mungkin terbatas dalam situasi fisiologis.
Pengamatan ingin mengetahui secara mendalam
penelitian ini adalah pemeliharaan jelas membran
basement utuh dalam lebih dari setengah folikel
dibudidayakan di media di mana L-arg kurang tapi apotransferin dilengkapi. Transferrin mudah memasuki
folikel dari peredaran dan aktif dalam transportasi zat
besi, meskipun mungkin memiliki tindakan lokal juga
(Tilly, 1998). Misalnya, transferin dapat menekan
generasi spesies oksigen reaktif dan mungkin memiliki
fungsi specific dalam sel granulosa, meskipun sedikit
yang diketahui perannya dalam perkembangan folikel
(Briggs et al., 1999). Transferin dinyatakan dalam sel
granulosa tikus, di mana reseptor juga hadir (Briggs et
al., 1999). Hal ini mungkin sangat relevan untuk sistem
kultur folikel, dimana transferin extrafollicular tidak
tersedia kecuali ditambahkan ke media kultur.
Menghilangkan L-arg telah terbukti meningkatkan
radikal bebas dengan pembentukan superoksida dan
NO yang membentuk peroxynitrite, menyebabkan
cedera seluler (Xia et al., 1996). Transferin dapat
melindungi sel-sel dengan bertindak sebagai chelator
kontaminasi logam beracun, sebagai substrat kompetitif
untuk enzim proteolitik (Orly et al., 1980), serta dalam
mengurangi stres oksidatif akibat radikal bebas (Kairo
et al., 2002).
Pengamatan kami karena itu dapat memberikan
beberapa dukungan untuk gagasan bahwa kerusakan
membran basal melibatkan radikal bebas (Keberuntungan
et al., 1995). Penambahan apo-transferin akan cenderung
mengurangi radikal bebas yang mungkin telah meningkat
kelalaian L-arg (Xia et al., 1996), mungkin berkontribusi
terhadap kematian folikel. Atau, adalah mungkin bahwa
transferin dapat menghasilkan efek penghambatan pada
proliferasi sel, mengurangi kecenderungan untuk brane
basement anggota untuk pecah di bawah kondisi kultur
diterapkan. Kami tidak memiliki bukti mekanisme yang
efek ini terjadi, tapi pengamatan ini menjamin
pemeriksaan lebih lanjut, karena penghambatan ovulasi
akan berpotensi berguna secara klinis, dan embrio dan

L.M.Mitchell, C.R.Kennedy and G.M.Hartshorne

gamet dapat terpengaruh oleh kelebihan radikal bebas

(Dinara et al., 2001). Percobaan dalam seri ini akan
dilanjutkan dengan menggunakan inhibitor specifik dari
NOS, untuk menilai dampaknya terhadap pertumbuhan
folikel in vitro.
Kesimpulannya, hasil ini menunjukkan kepentingan dan
relevansi dari L-arg, prekursor NO, dalam perkembangan
folikel normal secara in vitro. Tanpa L-arg dalam media
kultur, kelangsungan hidup folikel dan ovulasi akan
terhambat. Penambahan komponen jalur NO lainnya
(NG-hidroksi-L-arginin, L-citrulline dan NO) tidak
sepenuhnya menggantikan L-arg sebagai tingkat
ketahanan hidup dan kecepatan ovulasi tidak mencapai
tingkat kontrol.
Ucapan Terima Kasih
Penulis ingin mengakui kontribusi berharga dari orangorang yang dibantu dengan pekerjaan ini. Dr Bruce Kone
murah hati memberikan cDNA clone sebagian tikus
iNOS. Dr Andrew Thomson dan staf di Royal Inrmary di
Glasgow dibantu dengan imunositokimia dan tersedia
jaringan dari tikus knockout NOS. Dr Rob Catalano
membantu dengan hibridisasi in situ dan staf teknis dari
Departemen Ilmu Biologi sangat mengucapkan terima
kasih atas dukungan mereka. Pendanaan diberikan dari
Reproductive Medicine Research Fund, Rumah Sakit
Universitas Coventry dan Warwickshire NHS Trust.
References
Ahsan S, Lacey M and Whitehead SA (1997) Interactions
between interleukin- 1, nitric oxide and
prostaglandin E2 in the rat ovary: effects on
steroidogenesis. Eur J Endocrinol 137,293300.
Baydoun AR, Emery PW, Pearson JD and Mann GE
(1990) Substrate- dependent regulation of intracellular
amino acid concentrations in cultured bovine aortic
endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun
173,940 948.
Berruti G, Perego L, Borgonovo B and Mantegani E
(1998) MSJ-1, a new member of the DNAJ family of
proteins, is a male germ cell-specic gene product. Exp
Cell Res 239,430441.
Bonello N, McKie K, Jasper M, Andrew L, Ross N,
Braybon E, Brannstrom M and Norman RJ (1996)
Inhibition of nitric oxide: effects on interleukin-1enhanced ovulation rate, steroid hormones, and
ovarian leukocyte distribution at ovulation in the rat.
Biol Reprod 54,436445.
Bredt DS and Snyder SH (1994) Nitric oxide: a
physiologic messenger molecule. Annu Rev Biochem
63,175195.
Briggs DA, Sharp DJ, Miller D and Gosden RG (1999)
Transferrin in the developing ovarian follicle: evidence
of de-novo expression by granulosa cells. Mol Hum
Reprod 5,11071114.
Brower PT and Schulz RM (1982) Intercellular
communication between granulosa cells and mouse
oocytes: existence and possible nutritional role during

oocyte growth. Dev Biol 90,144153.

Burnett AL, Nelson RJ, Calvin DC, Liu JX, Demas GE,
Klein SL, Kriegseld LJ, Dawson VL, Dawson RM and
Snyder SH (1996) Nitric oxide-dependent penile erection
in mice lacking neuronal nitric oxide synthase. Mol
Med 2,288296.
Cairo G, Recalcati S, Pietrangelo A and Minotti G (2002)
The iron regulatory proteins: targets and modulators of
free radical reactions and oxidative damage. Free Radic
Biol Med 32,12371243.
Chun S-Y, Eisenhauer KM, Kubo M and Hsueh AJW
(1995) Interleukin-1 suppresses apoptosis in rat
ovarian follicles by increasing nitric oxide production.
Endocrinology 136,31203127.
Cortvrindt R, Smitz J and Van Steirteghem AC (1996)
In-vitro maturation, fertilization and embryo
development of immature oocytes from early preantral
follicles from prepuberal mice in a simplied culture
system. Hum Reprod 11,26562666.
Dave S, Farrance DP and Whitehead SA (1997)
Evidence that nitric oxide inhibits steroidogenesis in
cultured rat granulosa cells. Clin Sci (Lond.)
92,277284.
Dinara S, Sengoku K, Tamate K, Horikawa M and Ishikawa
M (2001) Effects of supplementation with free radical
scavengers on the survival and fertilization rates of
mouse cryopreserved oocytes. Hum Reprod 16,1976
1981.
Eppig JJ, O'Brien MJ, Pendola FL and Watanabe S (1998)
Factors affecting the developmental competence of
mouse oocytes grown in vitro: follicle- stimulating
hormone and insulin. Biol Reprod 59,14451453.
Forstermann U, Closs EI, Pollock JS, Nakane M,
Schwarz P, Gath I and Kleinart H (1994) Nitric oxide
synthase isozymes. Characterisation,
purication,
molecular
cloning
and
functions.
Hypertension
23,11211131. Gold ME, Bush PA and Ignarro LJ (1989)
Depletion of arterial L-arginine
causes reversible tolerance to endothelium-dependent
relaxation. Biochem Biophys Res Commun 164,714721.
Gosden RG, Boland NI, Spears N, Murray AA, Chapman
M, Wade JC, Zohdy NI and Brown N (1993) The
biology and technology of follicular oocyte
development in vitro. Reprod Med Rev 2,129152.
Grifth OW and Stuehr DJ (1995) Nitric oxide
synthases: properties and catalytic mechanism. Annu
Rev Physiol 57,707736.
Hecker M, Sessa WC, Harris HJ, Anggard EE and Vane
JR (1990a) The metabolism of L-arginine and its
signicance for the biosynthesis of endotheliumderived relaxing factor: cultured endothelial cells recycle
L- citrulline to L-arginine. Proc Natl Acad Sci USA
87,86128616.
Hecker M, Mitchell JA, Harris HJ, Katsura M,
Thiemermann C and Vane JR (1990b) Endothelial
cells metabolise NG-monomethyl-L-arginine to Lcitrulline and subsequently to L-arginine. Biochem
Biophys Res Commun 167,10371043.
Hecker M, Schott C, Bucher B, Busse R and Stoclet JC
(1995) Increase in

unfertilised oocytes and fertilised embryos during

preimplantation development in mice. Reproduction
122,957963.
Nussler AK, Billiar TR, Liu Z and Morris SM (1994)
Coinduction
of
nitric
oxide synthase
and
argininosuccinate synthetase in a murine macrophage cell
line. J Biol Chem 269,12571261.
Orly J, Sato G and Erickson GF (1980) Serum suppresses the
expression of hormonally induced function in cultured
granulosa cells. Cell 20,817827.
Palmer RMJ, Ashton DS and Moncada S (1988)
Vascular endothelial cells synthesise nitric oxide from
L-arginine. Nature 333,664666.
Powers RW, Chambers C and Larsen WJ (1996) Diabetesmediated decreases in ovarian superoxide dismutase are
related to blood-follicle barrier and ovulation defects.
Endocrinology 137,31013110.
Roy SK and Kole AR (1998) Ovarian transforming
growth factor-(TGF-) receptors: in vitro effects of
follicle stimulating hormone, epidermal growth factors
and TGF-on receptor expression in human preantral
follicles. Mol Hum Reprod 4,207214.
Sengoku K, Takuma N, Horikawa M, Tsuchiya K,
Komori H, Sharifa D, Tamate K and Ishikawa M
(2001) Requirement of nitric oxide for murine oocyte
maturation embryo development and trophoblast
outgrowth in vitro. Mol Reprod Dev 58,262268.
Shih, DM and Kleene, KC (1992) A study by in situ
hybridisation of the stage and appearance and
disappearance of the mRNAs encoding transition protein
2 and the mitochondrial capsule seleno-protein
during spermatogenesis in the mouse. Mol Reprod Dev
33,222227.
Srivastava V, Jones BJ, Dookah H, Hiney JK and Dees
LW (1997) Ovarian nitric oxide synthase (NOS)
gene expression during peripubertal development. Life
Sci 61,15071516.
Stuehr DJ, Kwon NS, Nathan CF, Frifths OW, Feldman
PL and Wiseman J (1991) NG-hydroxy-L-arginine is an
intermediate in the biosynthesis of nitric oxide from Larginine. J Biol Chem 266,62596263.
Tilly JL (1998) Molecular and genetic basis of normal
and toxicant-induced apoptosis in female germ cells.
Toxicol Lett 103,497501.
VanVoorhis BJ, Moore K, Strijbos PJ, Nelson S, Baylis
SA, Grzybicki D and Weiner CP (1995) Expression and
localisation of inducible and endothelial nitric oxide
synthase in the rat ovary. J Clin Invest 96,27192726.
Wright CS, Hovatta O, Margara R, Trew G, Winston RM,
Franks S and Hardy K (1999) Effects of follicle-stimulating
hormone and serum substitution on the in-vitro growth of
human ovarian follicles. Hum Reprod 14,15551562. Xia
Y, Dawson VL, Dawson TM, Snyder SH and Zweier JL

Downloaded from http://humrep.oxfordjournals.org/ by guest on September 11, 2014

serum NG-hydroxy-L-arginine in rats

treated
with
bacterial lipopolysaccharide.
Eur J Pharmacol 24,275,R13.
Heidaran MA, Showman RM and Kistler WS (1988) A
cytochemical study of the transcriptional and
translational regulation of nuclear transition protein 1
(TP1), a major chromosomal protein of mammalian
spermatid. J Cell Biol 106,14271433.
Hesla JS, Preutthipan S, Maguire MP, Chang TSK,
Wallach EE and Dharmarajan AM (1997) Nitric
oxide modulates human chorionic gonadotrophininduced ovulation in the rat. Fertil Steril 67,548552.
Ignarro LJ, Buga GM, Wood KS, Byrns RE and
Chaudhuri G (1987) Endothelium-derived relaxing
factor produced and released from artery and vein is
nitric oxide. Proc Natl Acad Sci USA 84,92659269.
Inderdeo DS, Edwards DR, Han VKM and Khokha R
(1996) Temporal and spatial expression of tissue
inhibitors of metalloproteinases during the natural
ovulatory cycle of the mouse. Biol Reprod 55,498508.
Jablonka-Shariff A and Olson LM (1997) Hormonal
regulation of nitric oxide synthases and their cell-specic
expression during follicular development in the rat ovary.
Endocrinology 138,460468.
Jablonka-Shariff A and Olson LM (1998) The role of
nitric oxide in oocyte meiotic maturation and
ovulation: meiotic abnormalities of endothelial nitric
oxide synthase knock-out mouse oocytes. Endocrinology
139,2944 2954.
Jansen PO (1975) Effects of luteinising hormone on
blood ow in the follicular rabbit ovary, as measured
by radioactive microspheres. Acta Endocrinol (Copenh)
79,122133.
Katska L and Rynska B (1998) The isolation and in vitro
culture of bovine preantral and early antral follicles of
different size classes. Theriogenology 50,213222.
Kuo RC, Baxter GT, Thompson SH, Stricker SA, Patton C,
Bonaventura J and Epel D (2000) NO is necessary and
sufcient for egg activation at fertilisation. Nature
406,633636.
Luck MR, Jeyaseelan I and Scholes RA (1995) Ascorbic
acid and fertility. Biol Reprod 52,262266.
Lysiak JL, Hussaini IM, Webb DJ, Glass WF, Allietta M
and Gonias SL (1995) 2-Macroglobulin functions as
a cytokine carrier to induce nitric oxide synthesis and
cause nitric oxide-dependent cytoxicity in the RAW
264.7 macrophage cell line. J Biol Chem
270,2191921927.
Mitchell LM, Kennedy CR and Hartshorne GM (2002)
Effects of varying gonadotrophin dose and timing on
antrum formation and ovulation efciency of mouse
follicles in vitro. Hum Reprod 17,11811188.
Mitsube, K, Mikuni, M, Matousek, M and Brannstrom,
M (1999) Effects of a nitric oxide donor and nitric
oxide synthase inhibitors on luteinising hormoneinduced ovulation in the ex-vivo perfused rat ovary. Hum
Reprod 14,25372543.
Nathan C (1992) Nitric oxide as a secretory product of
mammalian cells. FASEB J 6,30523064.
Nathan C and Xie Q-W (1994a) Regulation of
biosynthesis of nitric oxide. J Biol Chem
269,1372513728.
Nathan C and Xie Q-W (1994b) Nitric oxide synthases:
roles, tolls and controls. Cell 78,915918.
Nishikimi A, Matsukawa T, Hoshino K, Ikeda S, Kira Y,
Sato EF, Inoue M and Yamada M (2001) Localisation
of nitric oxide synthase activity in

L.M.Mitchell, C.R.Kennedy and G.M.Hartshorne

(1996) Nitric oxide synthase generates superoxide and

nitric oxide in arginine-depleted cells leading to
peroxynitrite-mediated cellular injury. Proc Natl Acad
Sci
USA 93,67706774.
Xie Q-W and Nathan C (1994) The high-output nitric
oxide pathway: role and regulation. J Leuk Biol
56,576582.
Zackrisson U, Mikuni M, Wallin A, Delbro D, Hedin L
and Brannstrom M (1996) Cell-specic localisation of
nitric oxide synthases (NOS) in the rat ovary during
follicular development, ovulation and luteal
formation. Hum Reprod 11,26672673.
Submitted on January 22, 2003; resubmitted on June 6,
2003; accepted on
September 24, 2003

40