Polimorfisme Gend MTHFR Reduktase A677 dan Aterosklerosis Karotis

I. Bova, MD, PhD; J. Chapman, MD, PhD; C. Sylantiev, MD;

A.D. Korczyn, MD, MSc; N.M. Bornstein, MD
Latar Belakang dan Tujuan Polimorfisme alanin/ valin (A/V) pada codon 677 gen 5,10
metilenetetrahidrofolat reduktase berkorelasi dengan peningkatan level homosistein plasma dan
dengan peningkatan risiko penyakit aterosklerosis kardiovaskuler. Studi kami didesain untuk
menilai frekuensi alel A dan V pada stenosis arteri karotis asimtomatik (CAS) berat yang dinilai
dengan pemeriksaan ekstrakranial dupleks dalam perbandingan dengan subjek tanpa
aterosklerosis yang telah dicocokkan usia dan jenis kelaminnya.
Metode pasien konsekutif (n=48; 28 pria, rerata SD usia 67,111,4 tahun) dengan keparahan
CAS asimtomatik (>75%) dibandingkan dengan subjek tanpa CAS (n=26; 15 pria, usia
61,211,5). Genotip MTHFR dianalisa dengan polymerase chain reaction (PCR) diikuti dengan
HinfI. Analisis x2dan uji t dilakukan untuk membandingkan dengan subjek kontrol (0,27, uji x 2,
OR 2,4 [95% CI 1,1 5,3]; P<0,02).
Kesimpulan Hasil kami mengindikasikan alel MTHFR A677V dan secara signifikan
berasosiasi dengan CAS berat.
Kata Kunci: amin oksireduktase, aterosklerosis, stenosis karotis, genetik, ultrasonografi,
Doppler
Homosist(e)in [H(e)] mendenotasikan homositen dan bentuk teroksidasinya, homositein dan
sistein-H(e) disulfid, yang diturunkan dari metabolisme intraselular metionin dan
mensirkulasikan ikatan protein di plasma. Konsentrasi H(e) dalam serum meningkat 15%-40$
pada pasien dengan penyakit arteri koroner, serebral, dan perifer. Laporan terbaru menyatakan
bahwa risiko stenosis arteri karotis meningkat pada subjek dengan peningkatan ringan
konsentrasi H(e), yang sebelumnya berada dalam rentang normal. H(e) dapat ditransulfurasi dari
sistein atau menreduksi metilat dari metionin. Reaksi yang menggunakan 5-metiltetrahidrofolat
sebagai donor karbon: 5-metiltetrahidrofolat disintesis dari 5-metilentetrahidrofolat dengan aksi
dari metilentetrahidrofolat reduktase (MTHFR). Abnormalitas MTHFR merupakan penyebab
penting pada hiperhomosisteinemia. Polimorfisme MTHFR termasuk substitusi alanin terhadap
valin pada kodon 677 (A677V) yang membentuk enzim termolabil. Level plasma H(e) yang
mengandung polimorfisme ini, terutama pada individu homozigot, lebih tinggi secara signifikan
daripada individu lainnya, yang membuat mutasi ini menjadi faktor risiko penyakit areteri
koroner (CAD) dan juga memengaruhi keparahan penyakit. Pada studi ini, kami memeriksa
frekuensi alel alanin dan valin pada pasien dengan stenosis arteri karotis (CAS) berat (>75%)
dibandingkan dengan subjek yang dengan jenis kelamin dan usia yang sama namun tanpa CAS.
Kami memperkirakan bahwa alel A677V akan menjadi faktor risiko untuk CAS.
Subjek dan Metode
Seleksi Pasien
Total 74 subjek dirujuk ke laboratorium Doppler untuk penilaian baik bruit karotis asimtomatis
maupun gejala nonspesifik seperti dizziness atau sakit kepala yang diinklusikan dalam studi.
Empat puluh delapan pasien konsekutif (28 pria, rerata SD usia 67,1 11,4 tahun) dengan CAS

berat asimtomatik (75%-99%) dibandingkan dengan 26 subjek kontrol (15 pria, usia 61,211,5
tahun) yang diketahui memiliki stenosis karotis nonsignifikan (<25%). Seluruh subjek adalah
warga Yahudi Israel. Faktor risiko vaskuler dicatat dan ditentukan berdasarkan adanya riwayat
stroke seperti yang dijelaskan sebelumnya.
Penyakit arteri karotis dinilai dan ditentukan menggunakan sonografi dupleks (Diasonics
Gateway2D) pada seluruh subjek berdsarkan kriteria yang divalidasi. Genome DNA diisolasi
dalam sel darah perifer menggunakan prosedur standar.
Deteksi Polimorfisme A677V
Analisis primer dan PCR dilakukan berdasarkan metode dideskripsikan Frosst dkk. Reaksi PCR
membentuk fragmen 198 bp yang mengandung kodon 677. Substitusi poin T terhadap C pada
kodon 677 membentuk sekuens pengenalan terhadap HinfI menghasilkan fragmen 175 dan 23 bp.
Alel pengkode alanin menghasilkan fragmen 198 bp yang dengan mudah dibedakan dari fragmen
175 bp yang dibentuk oleh alel valin. Fragmen-fragmen tersebut dipisahkan pada jel agarose
metaphor 4% (FMC BioProducts) dan divisualisasikan dengan ethidium bromid.
Hasil
Karakteristik klinis 48 subjek dengan CAS dan 26 subjek tanpas stenosis karotis signifikan
disajikan pada Tabel 1. Frekuensi hipertensi, hiperlipidemia, dan penyakit arteri perifer (PAD)
serupa pada kedua kelompok. Rerata usia, prevalensi merokok, dan prevalensi CAS lebih tinggi
pada kelompok studi daripada kelompok kontrol, walaupun efek merokok signifikan secara
statistik (p<0,005, uji x2).

Distribusi alel A dan V kodon 677 MTHFR pada kedua kelompok disajikan pada Tabel 2. Seperti
yang terlihat, frekuensi alel V lebih tinggi secara signifikan pada kelompok CAS (0,47)
dibandingkan dengan kontrol (0,27, p<0,02, OR=2,4 [95% CI 1,1-5,3]). Pemeriksaan distribusi
genotip AA, AV, dan VV pada kelompok CAS dan kontrol (Tabel 2) menunjukkan bahwa
frekuensi karier alel V heterozigot dan homozigot lebih tinggi secara signifikan pada pasien
CAS.
Untuk mengeksklusi faktor risiko yang dikaitkan dengan CAS dapat mempengaruhi efek
MTHFR, kami menggunakan tabel 2x2 dan menganalisa lebih jauh mengenai interaksi mutasi

MTHFR dengan usia, jenis kelamin, PAD, CAD, merokok, hipertensi, dan hiperlipidemia. Kami
tidak menemukan hubungan yang signifikan secara statistik antara genotip MTHFR dan faktor
risiko vaskuler apapun. Kaena faktor-faktor yang paling dipengaruhi oleh genotip MTHFR adalah
CAD dan PAD, kami memeriksa efek alel V pada pasien dengan CAS dengan CAD maupun
PAD. Hasil analisis ini ditampilkan pada Tabel 3. Seperti yang dapat dilihat, alel MTHFR A677V
secara signifikan berasosiasi dengan CAS pada pasien dengan atau tanpa CAD atau PAD,
walaupun asosiasi ini cukup mirip, namun gagal mencapai signifikansi statistik, mungkin
dikarenakan jumlah asus yang kecil pada beberapa kategori.

Diskusi
Studi kami didesain untuk menilai frekuensi alel MTHFR A677V pada subjek dengan
aterosklerosis karotis. Kami menemukan bahwa alel ini berasosiasi secara signifikan dengan CAS
berat. Beberapa studi terkini menunjukkan bahwa level H(e) yang tinggi berasosiasi dengan
keparahan dan progresi penyakit aterosklerosis. Asosiasi alel MTHFR A667V dengan level serum
H(e) cukup berarti dan lebih banyak pada karier homozigot. Walaupun begitu, asosiasi antara alel
dan CAD sulit didemonstrasikan. Menariknya, terdapat trem asosiasi alel dengan PAD dan CAD
independen pada pasien dengan CAS pada studi ini. Faktor risiko perancu untuk stroke mungkin
menjelaskan mengapa pada studi sebelumnya yang memeriksa asosiasi pada penyakit
serebrovaskuler dan alel A677V gagal untuk mendeteksi interaksi yang signifikan. Yang lebih
relevan pada studi ini dibanding studi sebelumnya adalah bahwa pada studi ini tidak ditemukan
hubungan antara polimorfisme gen MTHFR dan CAS. Studi ini membedakan dengan studi pada
seluruh studi dengan pasien simtomatik penyakit kardiovaskuler (tidak semuanya disebabkan
oleh CAS), pasien dengan CAS moderat (>50%) dimasukkan (sebaliknya pada studi ini, yang
diinklusi hanya CAS berat), dan bahwa kelompok kontrol tidak dipelajari dengan sonografi

dupleks sehingga tidak mengeksklusi pasien dengan CAS asimtomatik. Faktor-faktor ini,
terutama yang homogen pada pasien studi ini, tidak dimasukkan pada kedua studi.
Penemuan kami saat ini menyatakan alel MTHFR A677V merupakan faktor risiko genetik
stenosis arteri karotis. Efek ini lebih jelas pada karier homozigot (Tabel 2). Apakah ini
berhubungan dengan level H(e) tidak jelas, karena lebel ini tidak dapat dipelajari dan sedikit gen
yang memberikan efek berlawanan dengan alel A677V pada CAS secara langsung melalui level
H(e). Secara signifikan, asosiasi alel V dengan CAS independen terhadap CAD dan PAD (Tabel
3). Menariknya, frekuensi alel pada populasi Yahudi Israel kira-kira 0,40 lebih rendah daripada
kelompok CAS tetapi lebih tinggi daripada kelompok kontrol pada studi ini. Kontrol pada studi
ini dipilih dengan tidak adanya CAS, secara signifikan 20%-30% di populasi umum dari usia ini.
Hasil yang cocok dengan alel MTHFR A677V merupakan faktor risiko CAS karena frekuensi
kontrol bebas CAS lebih rendah daripada kontrol yang tidak dipilih dan tertinggi pada pasien
dengan CAS signifikan.
H(e) mungkin berkontribusi pada proses atrerosklerosis dan trombotik dengan memodulasi
proliferasi sel vaskuler dan mendukung aktivitas protrombotik dalam dinding vaskuler. Efek H(e)
ini mungkin mendasari korelasi antara alel A677V dan aterosklerosis dalam arteri karotid dana
tempat lain. Selain hubungan antara alel A677V dan CAS, selain meroko, kami tidak menemukan
faktor resiko lain yang berhubungan dengan CAS. Faktor resiko tidak berpengaruh secara berarti
dengan genotip MTHR dan hingga nampaknya tidak mempengaruhi kesimpulan penelitian.
Berkebalikan dengan lapran yang lain, tidak terdapat perbedaan signifikan antara CAS dan grup
kontrol dalam istilah tekanan darah tinggi dan hiperlipidemia dalam penelitian kami. Konsentrasi
kolesterol tidak berhubungan dengan aterosklerosis arteri karotid yang ditentukan bersamaan.
Dari penelitian saat ini, tidak jelas diketahui pakah A677V adalah faktor resiko independen untuk
CAS. Namun, tidak terdapat hubungan yang berarti antara genotip MTHFR dan faktor resiko
vaskuler lainnya. Pada pasien tanpa CAD atau PAD, A677V adalah faktor resiko yang relevan
untuk CAS, yang mana, telah dihubungkan dengan polimorfism MTHFR. Meskipun besar sample
penelitian ini cukup untuk menkonfirmasi hipotesis sebelum penelitian yang menyatakan bahwa
genotip MTHFR mungkin mempengaruhi CAS, tetap dibutuhkan penelitian yang lebih besar
untuk menilai pengaruh antara faktor genetik dan lingkungan.
Kesimpulannya, hasil kemi mengindikasikan bahwa alel MTHFR A677V berasosiasi dengan
signifikan terhadap CAS. Genotip MTHFR A677V mungkin penting secara klinis dalam penanda
terapetik dan prognostik walaupu studi lebih jauh dibutuhkan untuk memperkuat hipotesis.