PENUNTUN

PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI LINGKUNGAN

PROGRAM PASCASARJANA
UNIVERSITAS SRIWIJAYA
PALEMBANG
2015

ACARA I
MIKROBA YANG TERDAPAT DI UDARA

Tujuan :
Untuk mengetahui ciri-ciri koloni-koloni mikroba yang berasal dari udara.
Dasar Teori :
Cara untuk menghitung jumlah bakteri dalam udara mula-mula dipelajari oleh
Koch dengan menggunakan media padat dalam cawan petri yang terbuka dalam berbagai
waktu yang berbeda lamanya. Cawan-cawan itu dibiarkan supaya tumbuh koloninya,
kemudian jumlah koloninya dihitung. Ini adalah suatu cara yang sederhana untuk
menyelidiki udara tetapi secara kwantitatif tidak bisa, sebab cara ini tak menunjukan
jumlah organisme yang terdapat dalam suatu volum tertentu dari gas (udara). Tetapi
metode ini memberi hasil yang relatif dan umum digunakan untuk maksud ini.
Petri menyaring udara melalui suatu pipa yang berisi pasir yang telah diayak
melalui tapisan dengan mesh number 100. Suatu volum tertentu udara diisap melalui pasir
itu dan organisme yang terkumpul di pasir itu disuspensikan dalam larutan garam dengan
jalan mengocok pasir tersebut dengan larutan garamnya. Setelah itu suspensi dipipet dan
dicampur dengan agar-agar yang masih cair baru dituang ke petridish. Tahun 1909
American Public Health Association dengan resmi menggunakan modifikasi dari pada
sand methodnya Petri sebagai standar prosedur bagi analisa bakteri di udara. Kemudian
berturut-turut : Ruchl juga menggunakan modifikasi dari metode Petri. Wells prinsipnya
menggunakan sentrifuge untuk pemisahannya. Hollsender dan Dalla Valle menggunakan
Funnel devine untuk sampling udara dan beberapa orang lainnya misalnya Luckicsh,
Taylor dan Holladay, Lemon dan sebagainya.
Demikian Kock selain bisa menghitung secara relatif jumlah organisme dalam
udara juga menemukan adanya bakteri dan spora lapuk dalam udara. Hal ini ternyata dari

koloni-koloni pada agar dalam cawan petri yang disimpannya. Koloni lapuk akan berbulu
sedang koloni bakteri bulat dan mengkilat.
Bahan dan Alat:
Medium NA, medium PDA, bahan untuk pewarnaan Gram (Kristal violet, iodine, alkohol,
safranin), cawan petri, gelas benda dan gelas penutup.
Cara Kerja :
-

Letakkan masing-masing 2 cawan petri yang telah berisi medium NA (untuk bakteri)
dan 2 cawan petri yang berisi medium PDA (untuk jamur), buka tutupnya berturut-turut
selama 1 menit dan 5 menit pada 2 (dua) tempat yang berbeda

Inkubasi pada inkubator suhu 37oC atau pada suhu kamar selama 2x24 jam

Amati sifat morfologi koloni bakteri pada medium NA lempeng yang meliputi : bentuk,
warna, tepian, permukaan, garis tengah koloni dan jumlah koloni. Gambar apa yang
dilihat ! Permukaan (rata, mengkilap, kasar, suram dan tidak beraturan). Bentuk (titik,
bulat, teratur, bentuk benang, tipis, tebal, cembung, rata).

Ambil dari masing-masing koloni bakteri yang berbeda untuk dilakukan pewarnaan
Gram dan laporkan sifat Gram dari masing-masing isolat bakteri yang diperoleh.

Amati koloni jamur pada medium PDA yang meliputi : warna koloni, warna sebalik
koloni, dan ukuran diameter koloni.

Amati morfologi jamur dengan membuat preparat basah pada gelas benda yang ditetesi
dengan asam laktat dan diamati menggunakan mikroskop.

ACARA II
MIKROBA YANG TERDAPAT DALAM TANAH
Tujuan :
Untuk mengetahui ciri-ciri koloni-koloni mikroba yang terdapat di tanah.
Dasar Teori :
Secara umum dapat dikatakan bahwa tanah adalah media yang baik sekali untuk
pertumbuhan bermacam-macam organisme. Hal ini terutama benar bagi tanah-tanah yang
telah ditanami atau dikerjakan. Organisme yang terdapat dalam tanah antara lain : bakteri,
ragi, lapuk, alga, diatom dan protozoa dimana termasuk didalamnya ialah amoeba,
flagellata, ciliata dan rotifera. Sebagai tambahan adalah nematoda, insekta dan sebagainya.
Karena kebanyakan dari organisme ini aerobik, maka organisme itu kebanyakan
terdapat pada lapisan permukaan tanah. Jumlahnya makin menurun bila makin dalam.
Tanah yang mendapat oksigen lebih banyak berisi lebih banyak organisme dari pada tanah
yang kurang mendapat oksigen. Jumlah dan macam organisme itu tergantung dari keadaan
tanah, dalamnya, musim dari tahun, reaksinya, jumlah zat-zat organik, temperatur,
kelembaban dan sebagainya.

Karena organisme-organisme itu bermacam-macam

kebutuhannya untuk pertumbuhan, maka bermacam-macam pula media pembenihan yang

harus digunakan. Organisme-organisme itu mungkin aerob, anaerob atau fakultataif.
Banyak jenis-jenis organisme yang ada dalam tanah tumbuh bersama-sama dengan yang
lain, peristiwa simbiosis, sinergisme, komensalisma dan antagonisma adalah biasa terjadi.
Pada umumnya media yang sama dan metode yang sama pula digunakan untuk
penanaman dan isolasi bakteri heterotrof digunakan pula untuk pembiakan dan pemisahan
dari sebagian besar organisme yang terdapat dalam tanah, tetapi tanah terdiri beberapa
jenis organisme yang spesifik dan tak bisa tumbuh pada medium pembenihan yang biasa.
Media dan metode tertentu yang harus digunakan untuk maksud ini, termasuk dalam
mikroorganisme ini ialah bakteri yang menambah secara non-simbiotik, bakteri penambat
nitrogen, bakteri yang mengoksidasi S, jenis-jenis yang mereduksi sulfat, yang
menguraikan urea, bakteri yang menguraikan sellulosa dan jenis yang mengoksidasi
amonia.
Fungsi dari organisme dalam tanah yang penting ialah menguraikan berbagai
macam zat-zat organik yang berasal dari tumbuh-tumbuhan, hewan dan manusia. Termasuk

didalamnya, misalnya pupuk kandang, pupuk hijau, akar tanaman, pupuk-pupuk organik
dan hasil-hasil lain.
Persenyawaan-persenyawaan organik yang diberikan pada tanah sebagai hasil dari
kerja biologis termasuk berbagai gula, asam-asam amino, pentosan, sellulosa, lingnin,
protein, lemak, lilin, tannin dan pigmen. Hasil-hasil ini diuraikan lagi oleh organisme
dalam tanah yang mengakibatkan pembebasan konstituen organik dan anorganik yang larut
dalam air. Salah satu dari hasil anorganiknya misalnya NH3 yang digunakan dalam
kehidupan tumbuh-tumbuhan sebagai sumber nitrogen.
Bahan dan Alat :
6 cawan petri yang berisi medium NA (untuk bakteri) , 6 cawan petri yang berisi
medium PDA (untuk jamur), sampel tanah dari 2 tempat yang berbeda, pipet ukuran 1 ml,
6 tabung reaksi berisi akuades steril 9 ml, bahan untuk pewarnaan Gram (kristal violet,
iodine, alkohol, safranin), lampu bunsen, gelas benda, dan gelas penutup.
Cara Kerja:
-

Tumbuk tanah hingga halus, timbang 1 gram dan masukan dalam tabung reaksi yang
berisi aquades steril sebanyak 9 ml.

Lakukan pengenceran hingga 10-3, dengan cara dipipet 1 ml dari suspensi sampel di
atas masukan ke dalam aquades 9 ml (10-1), demikian seterusnya hingga pengenceran
10-3.

Pipetlah 1 ml dari masing-masing sampel dan masukan ke dalam cawan petri steril dan
ditambahkan 15 ml medium NA dan medium PDA yang sudah dicairkan, ratakan
dengan menggerakan cawan petri membentuk angka delapan hingga homogen.

Inkubasi pada suhu 37 0C selama 48 jam.

Amati sifat morfologi koloni pada medium NA lempeng yang meliputi : bentuk, warna,
tepian, permukaan, garis tengah koloni dan jumlah koloni. Gambar apa yang dilihat !
Permukaan (rata, mengkilap, kasar, suram dan tidak beraturan). Bentuk (titik, bulat,
teratur, bentuk benang, tipis, tebal, cembung, rata).

Ambil dari masing-masing koloni bakteri yang berbeda untuk dilakukan pewarnaan
Gram dan laporkan sifat Gram dari masing-masing isolat bakteri yang diperoleh.

Amati koloni jamur pada medium PDA yang meliputi : warna koloni, warna sebalik
koloni, dan ukuran diameter koloni.

Amati morfologi jamur dengan membuat preparat basah pada gelas benda yang ditetesi
dengan asam laktat dan diamati menggunakan mikroskop.

ACARA III
ANALISIS MIKROBIOLOGI AIR
Teori :
Air merupakan salah satu bahan yang digunakan dalam pengolahan pangan,
misalnya untuk pencucian bahan mentah dan alat-alat, perebusan dan sebagai medium
dalam pengolahan. Mutu makanan yang diolah sangat dipengaruhi oleh mutu air yang
digunakan dalam pengolahan. Air yang digunakan untuk pengolahan harus bebas dari
mikroba patogen maupun mikroba penyebab kebusukan makanan. Salah satu uji yang bisa
dilakukan untuk menganalisa kebersihan air adalah uji koliform. Koliform merupakan
suatu grup bakteri yang digunakan sebagai indikator adanya polusi kotoran dalam air,
karena salah satu jenis bakteri koliform yaitu Escherichia coli merupakan bakteri yang
berasal dari kotoran hewan maupun manusia. Adanya bakteri koliform di dalam air
menunjukan kemungkinan adanya mikroba patogen yang berbahaya bagi kesehatan.
Untuk mengetahui jumlah koliform di dalam air biasanya digunakan metode MPN
(Most Probable Number) dengan cara fermentasi tabung ganda. Metode ini lebih baik bila
dibandingkan dengan metode cawan karena lebih sensitif dan dapat mendeteksi koliform
dalam jumlah yang sangat rendah di dalam contoh. Uji kualitatif secara lengkap terdiri dari
tiga tahap yaitu :
1. Uji Penduga
2. Uji Penguat
3. Uji Lengkap
Uji ini tidak selalu dilakukan secara lengkap, tergantung dari berbagai faktor misalnya
waktu, mutu air yang dibutuhkan, biaya, tujuan analisa air dan sebagainya.
Bahan :
- Contoh air dari 2 sampel air yang berbeda (air kali/air sumur)
- 6 tabung Lactose Broth (double strength) a 10 ml + tabung Durham
- 12 tabung Lactose Broth (single strength) + tabung Durham a 10 ml atau
- 12 tabung Lactose Broth (single strength) a 10 ml + tabung Durham
- 12 agar cawan EMB (Eosin Methylene Blue) Agar
- 1 tabung Litmus Milk
- 2 tabung Tryptone Broth
- 2 tabung Proteose Broth (Medium MR-VP)
- 2 tabung Koser Citrate Medium
7

- 2 tabung larutan pengencer a 5 ml

- 1 tabung larutan pengencer a 9 ml
- Pereaksi Kovac
- Pewarnaan metil merah
- Larutan 5 % alfa neftol
- Larutan 40 % KOH
- Pewarna Gram (kristal violet, iodin, alkohol, safranin)
Alat :
- Tabung reaksi, tabung Durham, jarum ose, gelas objek, pipet 1 ml dan 10 ml, mikroskop,
inkubator 30-32 0C dan 350C.
Cara Kerja :
1. Uji Penduga Koliform
Setiap kelompok melakukan uji MPN menggunakan 9 tabung (@ 3 seri) Lactose
Broth dengan contoh seperti pada Tabel 4.1.
Tabel 4.1. Volume sampel air dan medium pada uji MPN 9 tabung
Contoh
Air sumur

Air kali

Jmlh Cth per tab

10 ml
1,0 ml
0,1 ml

Jmlh tab + tab Durham

3
3
3

1,0 ml
0,1 ml
0,01 ml

3
3
3

Jmlh Medium per tab

10 ml (Double strength)
10 ml (Single strength)
10 ml (Single strength)
10 ml (Single strength)
10 ml (Single strength)
10 ml (Single strength)

(0,1 ml dari
pengenceran10-1)

Semua tabung diinkubasikan pada suhu 350 C selama 24-48 jam. Amati
pembentukan gas di dalam tabung Durham, dan tabung dinyatakan positif jika
pembentukan gas sebanyak 19 % atau lebih di dalam tabung Durham. Hitung MPN
penduga sesuai dengan tabel MPN 3 seri. (Lampiran 1).
2. Uji Penguat Koliform
Terbentuknya gas di dalam Lactose broth tidak selalu menunjukan jumlah bakteri
koliform karena mikroba lainnya juga ada yang dapat memfermentasi laktosa,
misalnya bakteri asam laktat dan beberapa khamir tertentu. Oleh karena itu perlu
dilakukan uji penguat pada agar EMB.
8

Dengan menggunakan jarum ose. Inokulasi contoh dari tabung MPN yang
menunjukan uji penduga positif (terbentuk gas) masing-masing pada agar cawan EMB
dengan goresan kuadran. Inkubasikan semua tabung pada suhu 35 0C selama 24 jam.
Pada agar EMB dapat dibedakan antara koloni koliform fekal (E. coli) dan koliform
non-fekal. Koloni fekal mempunyai diameter yang lebih besar (1.0-3.0 mm) berwarna
merah muda dan bagian tengahnya berwarna gelap seperti mata ikan. Hitung semua
cawan EMB pada masing-masing pengenceran yang menunjukan adanya pertumbuhan
koliform (fekal maupun non-fekal), dan hitung MPN penguat sesuai dengan tabel
MPN 3 seri (Lampiran 1).
3. Uji Lengkap Koliform
Pilihlah masing-masing satu koloni yang mewakili koliform fekal dan satu koloni
yang mewakili koloni koliform non-fekal. Buatlah pewarnaan gram dari masingmasing koloni tersebut, dan sisanya masing-masing dilarutkan ke dalam 3 ml larutan
pengencer.

Dari

suspensi

bakteri

tersebut

masing-masing

diinokulasikan

menggunakan jarum ose ke dalam tabung berisi lactose Broth + tabung Durham.
Inkubasikan tabung pada suhu 35

C selama 24-48 jam, dan amati adanya

pertumbuhan dan pembentukan gas. Koloni yang menunjukan reaksi gram negatif
berbentuk batang dan membentuk gas di dalam Lactosa Broth merupakan uji lengkap
adanya koloni koliform.
4. Uji Kualitatif Koliform
Uji yang dilakukan untuk mengetahui jenis koliform yang terdapat di dalam contoh
adalah uji IMViC. Dari suspensi bakteri yang dibuat pada percobaan no.4 masingmasing diinokulasi menggunakan jarum ose ke dalam 3 tabung yang masing-masing
berisi medium yang berbeda yaitu Tryptone Broth, MR-VP Broth (Proteose Broth) dan
Koser Citrate Medium. Semua tabung diinkubasikan pada suhu 350C selama 2 hari,
kecuali sisa medium MR-VP untuk uji merah metil dimana inkubasi diperpanjang
sampai 5-7 hari. Reaksi-reaksi yang terjadi pada uji IMViC dapat dilihat pada Tabel
4.2 sedangkan reaksi spesifik koliform dapat dilihat pada Tabel 4.3.
Tabel 4.2. Medium yang digunakan pada uji IMViC dan reaksi yang terjadi.
Uji
Indol

Media
Tryptone Broth

Merah
metil

MR-VP
Broth)

Voges

MR-VP

Produk akhir
Indol

Reaksi Positif
Warna
merah
pada
penambahan pereaksi Kovac
(Proteose Asam organik
Warna
merah
pada
penambahan indikator merah
metil
Asetil
Metil Warna
merah
tua
pada
9

Proskauer
Sitrat

karbinol
Koser
Medium

Citrate Alkali (NH4OH)

penambahan 5 % alfa-neftol
dan 40 % KOH
Timbulnya warna keruh karena
adanya pertumbuhan

Tabel 4.3. Reaksi IMViC pada Escherichia coli dan Enterobacter

Reaksi IMViC
Escherichia coli
Indol
+
Merah Metil
+
Voges Proskauer
_
Sitrat
_

Enterobacter
_
_
+

Laporan Pengamatan :
Tabel 4.4. Hasil Pengamatan analisa koliform terhadap air
Uji
Pertumbuhan pada Litmus Milk
Uji Penduga :
Tabung (+) pada Lactose Broth
MPN Penduga
Uji Penguat :
Cawan (+) pada EMB
MPN penguat
Uji Lengkap :
Pewarnaan Gram
Gas pada Lactosa Broth
Uji IMViC
Indol
Merah metil
Voges-Proskauer
Sitrat
Kesimpulan (Jenis Koliform)

Air kali
.................

Air sumur
................

.................
. . . . . . . . . MPN/ml

................
. . . . . . . . MPN/ml

.................
. . . . . . . . . MPN/ml
I
II
....... .......
....... .......

................
. . . . . . . . MPN/ml
I
II
...... ......
...... ......

.......
.......
.......
.......

.......
.......
.......
.......

......
......
......
......

......
......
......
......

.......

.......

......

......

Berikan pembahasan mengenai hasil pengamatan tersebut.

10

DAFTAR PUSTAKA
Barton, L.L. 2005. Structural and functional relationships in prokaryotes.
Science. New York

Springer

Benson. 2001. Microbiological Applications Lab Manual, 8th Edition. The McGrawHill
Companies. New York.
Fardiaz, S. 1987. Penuntun Paraktek Mikrobiologi Pangan. Lmbaga Sumber Daya
Informasi. IPB, Bogor.
Hadioetomo, Ratnasiri. 1985. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Gramedia, Jakarta.
Holt, J.G., Krieg, N.R., Sneath, P.H.A., Staley, J.T., dan Williams, S.T. (2000) : Bergeys
Manual of Determinative Bacteriology. 9th. ed. A Wolters Kluwer Company,
Tokyo.
Koch, A. L. 2006. The Bacteria: Their Origin, Structure, Function and Antibiosis. Springer.
Dordrecht.
Oxoid, 1982. The Oxoid Manual of Culture Media, Ingredients and Other Laboratory
Services. 5-th. Ed. England by. Turnergraphic Ltd. Basingstoke.
Salle, A.J. 1943. Fundamental Principles of Bacteriology. McGraw-Hill Book Company,
Inc. New York.
Salle, A.J. 1961. Fundamental Principles of Bacteriology. 5-th. Ed. McGraw-Hill Book
Co., Inc. Ltd. Tokyo.
Seeley Jr, H.W. and P.J.V. Demark. 1972. W.H. Freeman and Company, San Francisco.
Soeroso, L. 1989. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Dasar. Fakultas Biologi Universitas
Jenderal Soedirman, Purwokerto.

11

Lampiran 1.
Tabel Nilai MPN untuk tiga seri tabung
Jumlah tabung positif
Seri A
Seri B
Seri C
0
0
0
0
0
1
0
0
2
0
0
3

MPN*

Jumlah tabung positif

Seri A
Seri B
Seri C
2
0
0
2
0
1
2
0
2
2
0
3

< 0.03
0.03
0.06
0.09

MPN*
0.091
0.14
0.20
0.26

0
0
0
0

1
1
1
1

0
1
2
3

0.03
0.061
0.092
0.12

2
2
2
2

1
1
1
1

0
1
2
3

0.15
0.20
0.27
0.34

0
0
0
0

2
2
2
2

0
1
2
3

0.062
0.093
0.12
0.16

2
2
2
2

2
2
2
2

0
1
2
3

0.21
0.28
0.35
0.42

0
0
0
0

3
3
3
3

0
1
2
3

0.094
0.13
0.16
0.19

2
2
2
2

3
3
3
3

0
1
2
3

0.29
0.36
0.44
0.53

1
1
1
1

0
0
0
0

0
1
2
3

0.036
0.072
0.11
0.15

3
3
3
3

0
0
0
0

0
1
2
3

0.23
0.39
0.64
0.95

1
1
1
1

1
1
1
1

0
1
2
3

0.073
0.11
0.15
0.19

3
3
3
3

1
1
1
1

0
1
2
3

0.43
0.75
1.20
1.60

1
1
1
1

2
2
2
2

0
1
2
3

0.11
0.15
0.20
0.24

3
3
3
3

2
2
2
2

0
1
2
3

0.93
1.50
2.10
2.90

1
1
1
1

3
3
3
3

0
1
2
3

0.16
0.20
0.24
0.29

3
3
3
3

3
3
3
3

0
1
2
3

2.40
4.60
11.00
> 24.00

Nilai MPN bakteri dari pengenceran yang di tengah (seri B)

12

Lampiran 2.
DAFTAR KOMPOSISI MEDIA DAN REAGEN
KOMPOSISI MEDIA
1. Brilliant Green Lactose Bile Broth (BGLBB) pH 7,4
Pepton
Lactose
Bubuk Oxgall
Hijau brilliant (Brilliant Green)
Aquades

: 10
: 10
: 10
: 0,0133
:1

gr
gr
gr
gr
lt

: 10
:5
:5
:2
: 0,4
: 0,065
: 13,5
:1

gr
gr
gr
gr
gr
gr
gr
lt

:1
: 0,2
: 1,5
:3
:1

gr
gr
gr
gr
lt

:3
:5
:5
:1

gr
gr
gr
lt

2. Eosin Methylene Blue Agar (EMBA) pH 6,8

Pepton
Laktosa
Sukrosa
K2HPO4
Eosin-Y
Biru Metilin (Methylene Blue)
Agar
Aquades
3. Koser Citrate Medium pH 6,8
KH2PO4 (kalium dihidrogen pospat)
MgSO4 (magnesium sulfat)
NaH4HPO4.4H2O (Na-amonium pospat)
Na3C6H5O7.2H2O (Na-sitrat)
Aquades
4. Lactose Broth (LB) pH 6,9
Beef extract
Pentone
Lactose
Aquades
Jika membuat double strength lactose-nya 10 gr.
5. Nutrient Broth (NB) pH 7,4
Beef extract
:3
Peptone
:5
Aquades
:1
Jika membuat Nutrient Agar (NA) tambahkan Agar 15 gr.

gr
gr
lt

6. Plate Count Agar (PCA) pH 7,0

Tryptone
Yeast Extract
Glucose
Agar
Aquades

:5
: 2,5
:1
: 15
:1

13

gr
gr
gr
gr
lt

7. Potato Dextrose Agar (PDA) pH 5,6

Potato
Dextrose / Glucose
Agar
Aquades

: 200
: 20
: 15
:1

gr
gr
gr
lt

:7
:5
:5
:1

gr
gr
gr
lt

:2
: 20

gr
ml

8. Proteose Broth (Medium MR-VP) pH 6,9

Polypentone
Glucose
K2HPO4 (kalium hidrogen pospat)
Aquades

KOMPOSISI REAGEN
1. Alfa-naftol
5 % alfa-naftol di dalam 95 % etil alkohol
2. Larutan Pewarna Gram

2.1. Gram A
a. Kristal violet (90 %)
etanol (95 %)

b. amonium aksalat
: 0,8
gr
aquades
: 80
ml
kemudian campurkan antara larutan a dan b, bila masing-masing sudah larut
dengan baik.
Gram A juga dapat dibuat dengan bahan :
Kristal violet
Anilin
Alkohol 95 %
Aquades

:5
:2
: 10
: 20

gr
gr
ml
ml

2.2. Gram B
I2 (Iodine) kristal
KI (kalium Iodida)
Aquades

:2
:2
: 300

gr
gr
ml

2.3. Gram C
Alkohol 95 %
Aseton

: 70
: 30

ml
ml

2.4. Gram D
Safranin O
Alkohol 95 %
Aquades

: 0,25
: 10
: 100

gr
ml
ml

14

3. Larutan Pewarna Endospora

3.1. Malachite Green
malachite green oxalate
aquades

:5
: 100

gr
ml

3.2. Safranin
safranin O
aquades

: 0,5
: 100

gr
ml

: 20
: 20
: 40
: 40

gr
ml
ml
ml

4. Larutan Pewarna Kapang (Lactofenol)

Phenol crystal
Asam laktat
Gliserin
Aquades

15