HPLC

Apa Itu HPLC?

H igh

Performance
L iquid
C hromatography

H igh

Pressure
L iquid
C hromatography

H igh

Priced
L iquid
C hromatography

Kompetensi
Mahasiswa dapat :
Menyebutkan Definisi HPLC
Memahami Prinsip HPLC
Dapat menerangkan komponen utama
dari alat HPLC dan fungsinya masingmasing.
Dapat menerangkan cara analisa
dengan HPLC
Dapat menyebutkan kelebihan dan
kekurangan HPLC.

Definisi HPLC
HPLC adalah kromatografi dengan eluen
cair dan fasa diam padatan yang dapat
dilakukan dengan waktu yang singkat dan
pemisahan yang baik.
Sampel sedikit, (non volatil)
Tekanan tinggi (ribuan psi)
Isi kolom dengan ukuran partikel kecil ( 310 mikron) dan seragam.

Contoh senyawa yang dapat

dipisahkan
2,4,5-T

Benzidine

Fluorene

TNT (2,4,6-Trinitrotoluene)

H2C=CH-CN

Acrylonitrile

Carbaryl

Prinsip Pemisahan
Pemisahan berdasarkan pada kelarutan
relatif komponen sampel pada eluen (cair)
dan fasa diam (padat)
Mobile Phase

Stationary Phase

Solvent

Bonded Phase

HPLC - Modes
Normal Phase. (Fasa Normal)
- Fasa diam polar dan fasa gerak
(solven dan sampel) non polar.
Reverse Phase. (Fasa Terbalik)
- Fasa diam nonpolar dan pelarut dan sampel
polar.

Pelarut Normal Phase

Hexana ; dichloromethana;
isopropanol;

Pelarut yang umum dipakai

untuk Reverse Phase
Methanol

CH3OH

Acetonitrile

CH3CN

Tetrahydrofuran
Air

H2O

Fasa diam (Isi Kolom)

Ukuran partikel
Biasanya 10, 5 atau 3 dari silica atau polimernya.
Fasa diam - mempunyai gugus funsi tertentu yang terikat
kuat pada fasa diam.
Harus sangat stabil
Guard column Untuk mengamankan analytical column:
Berisi partikel semacam dengan kolom analitis tetapi
ukurannya lebih besar.
Menyaring bila ada kotoran pada fasa gerak.

Analytical - Performs the separation.

Gugus Fungsi fasa diam

C-2
C-8

Ethyl Silyl
Octyl Silyl

C-18

Octadecyl Silyl

CN
CN

Cyanopropyl Silyl

-Si-CH2-CH3
-Si-(CH2)7-CH3
-Si-(CH2)17-CH3
-Si-(CH2)3-

Instrumentasi
Gradient
Controller

Column

Pump
Mobile Phases

Injector

Detector

Tangki Pelarut
Fasa gerak
Elusi isocratic satu pelarut saja
Elusi gradien - 2 atau lebih pelarut,
komposisi dapat diatur atau
diprogram .
Harus bebas partikel padat. Sampel
dan pelarut harus disaring lebih
dahulu.

Pompa
Untuk menghasilkan tekanan supaya eluen
mendorong sampel melewati fasa diam.
Pompa harus dapat menghasilkan tekanan
sampai 4000 psi dan kecepatan alirnya
dapat diatur dai 0,0 sampai 10,0 ml/min

dengan ketepatan 0,1 ml.

Aliran pompa harus stabil, tidak
boleh berfluktuasi (bebas pulsa
tekanan).

Injeksi Sample
Sampel diinjeksi dengan Syringe :
manual
Autoinjector

Volume larutan sampel bervariasi 1

200 l (biasanya sekitar 20 l )
Injeksi harus melalui loop valve
karena tekanan operasi yang tinggi.

Kolom
Umumnya terbuat dari stainless steel
Panjangnya, 5 to 30 cm dan diameter
dalam 2 sampai 3 mm.
Isinya sesuai dengan mode yang
digunakan.
Suhu kolom tidak terlalu penting
Guard kolom dipasang sebelum kolom
analitis.

Detektor
UV-Vis
Single wavelength (filter)
Variable wavelength (monochromator)

Multiple wavelengths (PDA)

Fluorescence
Electrochemical
Mass Spectrometric
Tidak ada ditektor yang bisa mendeteksi semua
senyawa dengan respon yang baik seluruhnya.

Contoh Chromatogram

Restek ULTRA C-18 and CN Columns (250mm x 4.6mm, 5),

Mobile Phase: (1:1 Methanol:Water), 1.5 mL/min.

Chromatograms

Supelcosil LC-PAH Columns.

Conditions: A: 150mm x 4.6mm, 5.

Conditions: B: 50mm x 4.6mm, 3.

Flow Rate: 1.5 mL/min

Flow Rate: 3.0 mL/min

Cara analisa : Kualitatif

maupun Kuantitatif sama
dengan GC

Keungulan dan Kelemahan

HPLC Vs GC
Keunggulan
- Tidak merusak sampel
- Bisa untuk analisa zat yang mempunyai
titik didih tinggi atau rusak pada
pemanasan

Kelemahan
- Perlu operator yang lebih terampil.
- Biaya operasi lebih mahal karena
pelarutnya.