TUGAS MUTU DAN KEAMANAN PANGAN

PENGEMBANGAN METODE DETEKSI UNTUK

PENGAWASAN DAN PENGENDALIAN YANG AKURAT
TERHADAP MIKROBIA BERBAHAYA PADA BAHAN
PANGAN (Salmonella, E. coli dan E. sakazakii)

Oleh:
Evi Kurniawati
051414153005

PROGRAM MAGISTER ILMU FARMASI

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS AIRLANGGA
SURABAYA
2015
DAFTAR ISI
Hal.
HALAMAN JUDUL ........................................................................................................
1
DAFTAR ISI ....................................................................................................................
2

BAB I

PENDAHULUAN..............................................................................................

3
BAB II APLIKASI..........................................................................................................
6
1. Next day Salmonella spp. detection method based on real-time PCR for
meat, dairy and vegetable food products (Lazaro et al., 2014)
6
2. Practical coliforms and Escherichia coli detection and enumeration for
industrial food samples using low-cost digital microscopy (Sangadkit et
al., 2012)
13
3. Prevalence, identication and molecular characterization of Cronobacter
sakazakii isolated from retail meat products (Mohammed et al., et al.,
2015)
18
BAB III PENUTUP..........................................................................................................
24
DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................................
25

BAB I
PENDAHULUAN
Produk makanan, seperti susu dan produk daging yang mencakup keju,
susu bubuk, susu fermentasi, sosis, dan sebagainya, peka terhadap pencemaran

bakteri patogen. Bakteri ini meliputi Listeria monocytogens, Staphylococcus

aureus, Enterobacter sakazakii, Escherichia coli O157:H7, Salmonella Spp.,
Vibrio parahaemolyticus, Streptococcus agalactiae dan Pseudomonas fluorescens,
dan lain lain (Chiang et al., 2012). Risiko keracunan makanan dari konsumsi
makanan yang terkontaminasi dengan penyebab penyakit bakteri dan resisten
antibiotik telah menjadi isu yang penting dan berakibat pada perdebatan berbagai
kebijakan. Meskipun efek yang paling umum akibat makanan
adalah diare dan demam, muntah dan gejala lain dari keracunan makanan dan
bahaya yang lebih serius, bahkan kematian, dapat terjadi pada pasien yang rentan.
Hal ini terutama mungkin jika infeksi bakteri bawaan makanan resisten terhadap
terapi antibiotik yang biasanya dianjurkan, seperti yang mungkin terjadi jika
infeksi yang disebabkan oleh bakteri dari peternakan di mana antibiotik digunakan
untuk keperluan peningkatan pertumbuhan atau pencegahan penyakit (Anthony,
2015).
Menurut data statistik dari Departemen Kesehatan, Eksekutif
Yuan (Taipei, Taiwan), lebih dari 4.098 kasus keracunan makanan terjadi
di Taiwan selama 1981-2008. Makanan yang terlibat dalam kasus keracunan
makanan ini termasuk makanan laut, unggas, telur segar, produk susu dan
makanan nabati dengan kandungan protein yang tinggi. Salmonella spp.,
Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus, dan
Escherichia coli adalah agen penyebab utama di antara kasus-kasus ini.
Salmonella spp., salah satu patogen serius, bisa menyebabkan penyakit
gastrointestinal serius termasuk salmonellosis manusia dan hewan (Groisman et al
dalam Chiang et al., 2012). Untuk sel E. coli, E. coli O157: H7 dapat
menyebabkan hemorrhagic colitis berat atau sindrom uremik hemolitik.
Keberadaan E. coli biasa digunakan sebagai organisme indikator feses,
kehadirannya dalam makanan umumnya menunjukkan kontaminasi feses
langsung atau tidak langsung. Sejumlah besar E. coli dalam makanan
menunjukkan kurangnya kebersihan pada penanganan dan penyimpanan yang
tidak tepat (Food and Environmental Hygiene Department, 2014). Adapun
Enerobacter sakazakii, telah dilaporkan dapat menyebabkan meningitis neonatal,
enterocolitis dan sepsis (Bar-Oz et al., dalam Chiang et al., 2012). Kontaminasi

dengan Enterobcter sakazakii pada susu bubuk formula bayi telah diduga menjadi
penyebab beberapa wabah penyakit pada bayi (Chen et al., dalam Chiang et al.,
2012).
Metode diagnostik molekuler berdasarkan analisis DNA, misalnya
polymerase chain reaction (PCR), multipleks PCR, DNA probe, dan biochip,
telah digunakan untuk mendeteksi patogen makanan (de Boer dan
Beumer, dalam Chiang et al., 2012). Biochips memungkinkan deteksi simultan
dan identifikasi dari beberapa mikroorganisme patogen dalam waktu yang relatif
singkat. Warsen et al. (2004) secara bersamaan mendiskriminasi 18
mikroba termasuk 15 patogen pada ikan dalam satu array berdasarkan kaca
slide. Laporan juga menunjukkan bahwa macroarray berbasis DNA bisa
digunakan sebagai alat yang ampuh untuk mendeteksi patogen yang ada pada
makanan.
Wang et al (2015) telah mengembangkan metode fluoroimmunoassay
dengan menggunakan multicolor qantum dots (Qds) sebagai probe fluorescent
untuk deteksi simultan, sensitif, dan cepat tiga spesies bakteri patogen utama,
yaitu, Salmonella enteritidis, Staphylococcus aureus dan Escherichia coli.
Multicolor Qds, dengan panjang gelombang emisi yang berbeda pada 504 nm,
557 nm dan 604 nm, yang masing-masing terkonjugasi dengan antibodi anti-S.
enteritidis, anti-S. aureus dan anti-E. coli. Melalui pengenalan imunologi, bakteri
sasaran ditangkap oleh QD-antibodi konjugat secara selektif dan cepat. Intensitas
fluorescence kompleks final (diukur pada 504 nm, 557 nm dan 604 nm) telah
meningkat secara teratur sesuai dengan peningkatan jumlah sel bakteri target.
Perubahan Intensitas fluorescence (F) sebagai fungsi dari jumlah sel (N) telah
ditemukan untuk masing-masing tiga bakteri sasaran. Metode fluoroimmunoassay
multipleks ini telah diterapkan untuk sembilan jenis sampel makanan, yaitu air
soda, air mineral, jus apel, susu, saus tomat, saus ayam, puding, keju dan daging
yang dijual super market lokal di Cina, untuk membuktikan kemampuan antiinterferensi yang kuat dan berbagai aplikasi.
Tujuan dari tulisan ini akan membahas secara singkat beberapa metode
yang dapat digunakan dalam mendeteksi mikrobia berbahaya pada bahan pangan,

yang meliputi Salmonella, E. Colli dan E. sakazaki untuk tujuan pengawasan dan
pengendalian mutu yang akurat.

BAB II
APLIKASI
Pada penjelasan berikut, akan dipaparkan contoh aplikasi metode untuk
pengembangan metode deteksi dalam rangka pengawasan dan pengendalian yang
akurat terhadap mikrobia berbahaya pada bahan pangan (salmonella, e. coli dan e.
sakazaki):
1. Next day Salmonella spp. detection method based on real-time PCR for meat,
dairy and vegetable food products (Lazaro et al., 2014).
Metode mikrobiologi standar untuk mendeteksi Salmonella bergantung
pada beberapa langkah kultural dan membutuhkan waktu lebih dari 5 hari untuk
konfirmasi akhir, dan sebagai akibatnya ada kebutuhan untuk metodologi yang
cepat sebagai alternatif untuk deteksi. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk

membandingkan strategi deteksi yang berbeda berdasarkan real-time PCR untuk

deteksi cepat dan sensitif dalam produk makanan yaitu daging babi dan daging
unggas mentah, ready to eat (RTE) salad dan keju dari susu domba mentah.
Tiga parameter yang berbeda dievaluasi untuk mendeteksi
Salmonella spp.: ukuran awal sampel makanan (25 dan 50 g), waktu inkubasi (6,
10 dan 18 jam) dan ekstraksi DNA bakteri (pendidihan sederhana broth setelah
pencucian pelet bakteri, penggunaan resin Chelex, dan kolom silika komersial).
Skema evaluasi studi ditunjukkan pada Gambar 1.
Gambar 1. Diagram alir parameter yang dievaluasi untuk mengurangi waktu dan biaya
deteksi Salmonella spp.

Setelah inokulasi bakteri ke sampel (25

atau
50
g), dilakukan pengenceran 1:10 setiap
sampel dalam buffered
pepton water (BPW),
dihomogenkan selama 90 detik, dan diinkubasi pada 37 C 1C selama waktu
yang diusulkan (6, 10 atau 18 jam). 2 ml sampel diambil dan dipindahkan ke
dalam tabung microcentrifuge yang bersih, dan disentrifugasi selama 5 menit pada
10.000 g pada 4C. Supernatan dibuang dengan hati-hati dan pelet dicuci satu
kali dengan 1 ml PBS, dan disentrifugasi selama 5 menit pada 10.000 g pada
4C. Setelah itu, tiga metode ekstraksi DNA bakteri yang berbeda diuji. Untuk
metode boiling sampel, pelet di resuspensikan dalam 200 l phosphate buffer
saline (PBS) dan dipanaskan pada 95C selama 30 menit. Tabung dimasukkan ke
dalam es, dan kemudian disentrifugasi selama 5 menit pada 10.000 g pada 4C.
100 l supernatan dihilangkan dengan hati-hati dan dipindahkan ke dalam tabung
microcentrifuge yang bersih baru. Sedangkan ekstraksi DNA menggunakan resin
Chelex dilakukan dengan meresuspensikan pelet dalam 200 l 6% Chelex 100
(BioRad, Richmond, CA, USA). Dan ekstraksi DNA menggunakan kolom kit
berbasis silika dilakukan dengan meresuspensikan pelet dalam 180 l buffer lisis
enzimatik yang mengandung 20 mg/ml lysozyme; 20 mM Tris HCl, pH 8,0; 2 mM

EDTA, pH 8,0; dan 1,2% Triton X-100, dan DNA bakteri diekstrak menggunakan
QIAamp DNA Mini kit (QIAGEN, Hilden, Jerman) sesuai instruksi pabrik.
Deteksi Salmonella spp. dengan RTi-PCR dilakukan dengan menggunakan
3 l direct DNA extract sebagai template. Reaksi dijalankan pada Applied
BioSystems 7500-Applied BioSystems, Foster City, USA. Amplifikasi dilakukan
dengan menggunakan tahap pemanasan awal pada 95C selama 10 menit, diikuti
40 tahap siklus denaturasi pada 95C selama 30 detik dan tahap annealing pada
55C selama 60 detik. Fluorescence tercatat hanya pada tahap akhir annealing.
Tiga replikasi PCR digunakan untuk masing-masing sampel. Jika assay
menunjukkan nilai quantification cycle (Cq) 40 dan tidak tergantung pada nilai
IAC Cq, hasilnya diinterpretasikan sebagai positif. Jika assay menunjukkan nilai
Cq 40 dengan nilai IAC Cq 40 diinterpretasikan sebagai negatif. Jika assay
menunjukkan baik target dan berhubungan dengan nilai IAC Cq 40 reaksi
dianggap gagal. Ketika setidaknya satu dari tiga replikasi PCR positif, sampel
diidentifikasi terkontaminasi Salmonella spp.
Kemudian nilai-nilai Cq yang teramati dari replikasi per kondisi yang diuji
dianlisis dengan uji t dan analisis ANOVA pada derajat kepercayaan 95% untuk
mempelajari apakah ada perbedaan signifikan dalam nilai-nilai Ct yang diperoleh
diantara matriks makanan yang berbeda, metode PCR, ukuran sampel, jumlah
bakteri dan waktu inkubasi, dan dilanjutkan dengan Post-hoc Duncan test.
Hasil RTi-PCR kualitatif diperoleh untuk produk makanan yang dianalisis
dan dari semua kombinasi ditunjukkan pada Tabel 1-4. Dalam semua
matriks makanan, deteksi semua sampel mengandung kontaminasi artifisial
Salmonella spp. rendah. (2-4 CFU per sampel) tidak teramati setelah 6 jam
inkubasi dengan mengabaikan protokol ekstraksi DNA yang digunakan (Tabel 14). Deteksi baru mungkin pada saat inkubasi, setidaknya, selama 10 jam, kecuali
untuk metode rapid DNA extraction perebusan pada daging babi dan unggas
(Tabel 1-4). Namun, nilai-nilai Cq diperoleh berbeda untuk matriks dan variabel
uji yang berbeda: nilai-nilai Cq lebih variabel untuk keju dan RTE salad (Gbr. 2).

Gambar
rata
variasi
dari 3
ekstraksi
berbeda
berbagai
makanan

2. Ratakoefisien
(CV%)
metode
yang
dalam
matriks

Tabel 1. Mean SD untuk nilai Ct pada Salmonella spp. dalam sampel daging babi. Huruf besar
menunjukkan perbedaan yang bermakna antar metode dalam analisis ANOVA, sementara huruf
kecil menunjukkan perbedaan yang bermakna dalam grup (p < 0,05). Blank sample (tanpa
Salmonella) kesemuanya negatif

Untuk daging babi, unggas, dan RTE salad, tiga variabel yang diuji
menunjukkan dampak yang berbeda pada hasil Cq (Tabel 1-3). Sementara
hasil Cq yang diperoleh dengan menggunakan metode ekstraksi DNA dan ukuran
sampel yang berbeda tidak berbeda secara statistik (p > 0,05) (Tabel 1-3), hasil Cq
yang diperoleh setelah waktu inkubasi yang berbeda secara statistik berbeda (p <
0,05), dan hasil Cq diperoleh untuk tingkat kontaminasi artifisial yang berbeda
adalah berbeda secara statistik (p < 0,05).

Tabel 2. Mean SD untuk nilai Ct pada Salmonella spp. dalam sampel daging unggas. Huruf
besar menunjukkan perbedaan yang bermakna antar metode dalam analisis ANOVA, sementara
huruf kecil menunjukkan perbedaan yang bermakna dalam grup (p < 0,05). Blank sample (tanpa
Salmonella) kesemuanya negatif

Tabel 3. Mean SD untuk nilai Ct pada Salmonella spp. dalam sampel RTE salad. Huruf besar
menunjukkan perbedaan yang bermakna antar metode dalam analisis ANOVA, sementara huruf
kecil menunjukkan perbedaan yang bermakna dalam grup (p < 0,05). Blank sample (tanpa
Salmonella) kesemuanya negatif

10

Hasil yang berbeda diperoleh untuk keju dari susu domba mentah.
Meskipun hasil Cq diperoleh dengan menggunakan ukuran sampel yang berbeda,
tetapi secara statistik tidak berbeda (p > 0,05), untuk metode ekstraksi DNA,
tingkat kontaminasi artifisial dan waktu enrichment yang berbeda, berbeda secara
statistik (p < 0,05) (Tabel 4). Hasil Cq secara statistik lebih tinggi (p < 0,05)
ketika digunakan resin Chelex, dan tidak ada perbedaan yang signifikan teramati
untuk dua prosedur ekstraksi DNA lainnya (P > 0,05).

Tabel 4. Mean SD untuk nilai Ct pada Salmonella spp. dalam sampel keju. Huruf besar
menunjukkan perbedaan yang bermakna antar metode dalam analisis ANOVA, sementara huruf
kecil menunjukkan perbedaan yang bermakna dalam grup (p < 0,05). Blank sample (tanpa
Salmonella) kesemuanya negatif

11

Berdasarkan data tersebut, didapatkan kondisi pre-PCR terbaik yaitu

dengan menggunakan 25 g sampel, waktu inkubasi 18 jam dan metode ekstraksi
DNA dengan perebusan. Sehingga kondisi tersebut yang digunakan untuk menguji
keberadaan Salmonella spp. pada 200 sampel makanan yang dikumpulkan dari
penjual lokal, yang digabungkan dengan assay RTi-PCR, dan dibandingkan
dengan metode standar ISO 6579. Hasilnya ditunjukkan pada Tabel 5. Secara
total, akurasi relatif dari metode alternatif, yaitu tingkat korespondensi antara
respon yang diperoleh dengan metode referensi dan respon yang diperoleh dengan
metode alternatif pada sampel adalah 104,17%. Ini berarti bahwa dengan metode
alternatif yang diusulkan, sampel yang terdeteksi positif lebih banyak
dibandingkan dengan metode standar ISO (100 vs 96). Dari perspektif praktis, itu
berarti kemungkinan hasil negatif palsu dengan konsekuensi serius pada kesehatan
masyarakat karena akan banyak non-compliant food tidak akan ditarik dari pasar.
Tabel 5. Perbandingan hasil sampel yang terkontaminasi secara natural berdasarkan metode ISO
dan real-time PCR

12

Berdasarkan hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa metode yang

diusulkan dapat digunakan untuk mendeteksi Salmonella spp secara cepat, sensitif
dan hemat untuk mengurangi waktu dan biaya analisis.
2. Practical coliforms and Escherichia coli detection and enumeration for
industrial food samples using low-cost digital microscopy (Sangadkit et al.,
2012)
Dalam industri makanan, ada kebutuhan yang muncul untuk metode
deteksi lebih cepat dalam memberikan informasi yang cepat dan kritis pada
kemungkinan kontaminasi patogen dalam bahan baku dan produk makanan jadi
serta pemantauan pembersihan dan kebersihan. Tujuan penelitian ini adalah untuk
menemukan solusi alternatif yang dapat menggantikan metode komersial dengan
akurasi yang sama tetapi biaya yang lebih rendah untuk tujuan industri. Beberapa
protokol yang umum untuk mengestimasi coliform dan E. coli dievaluasi. Dua
rutinitas yang paling umum (yaitu, PetrifilmTM by 3M dan regular pour plate CCA)
dibandingkan dengan lima alternatif berbiaya rendah. Pada dasarnya, pour and
spread CCA technique yang dilakukan pada dua format Petri dish (yaitu, Petri
dish standar 15x100 mm dan mini 15x60 mm). Alternatif yang diusulkan juga
bereksperimen dengan memperkecil volume kultivasi menggunakan CCA
konvensional. Dengan biaya rendah, mikroskop digital komersial digunakan untuk
membantu deteksi koloni E. coli/coliform.
Sampel industri yang digunakan dalam penelitian ini adalah green papaya
salad dan swab sampel dari lini produksi pabrik makanan lokal, yang secara rutin
dikumpulkan untuk mengevaluasi kontaminasi coliform dan E. coli sesuai dengan
instruksi kerja pabrik. Beberapa teknik diterapkan pada sampel tersebut, termasuk
PetrifilmTM E. coli/Coliform Count (EC) plate, CCA menggunakan full-size and

13

mini Petri dish pour plate technique, CCA menggunakan full-size and mini Petri
dish spread plate technique, dan CCA dalam format microtiter (yaitu, 24-wells
and 96 wells microtiter plate). Analisis bakteriologis dimulai dalam waktu 3 jam
setelah sampling. 25 g unit analisis setiap makanan dihomogenisasi dengan 225
ml sterile water-pepton (0,1% b/v) selama 2 menit dan kemudian dilakukan
pengenceran serial 10 kali lipat dengan steril water-pepton.
Deteksi dengan mengggunakan Petrifilm TM E. coli/coliform Count (EC)
Plate dilakukan dengan mengambil 1 ml suspensi sampel pada pengenceran yang
tepat dipipet ke permukaan Petrifilm E.coli/Coliform count (EC) plate. Secara
perlahan cover film diaplikasikan pada plate dan plate diinkubasi pada 35C
selama 24 jam. Menurut petunjuk produsen, koloni merah yang dikelilingi dengan
gas terperangkap adalah coliform dan koloni biru dengan gas terperangkap adalah
E. coli. Kontrol positif menggunakan E. coli digunakan dalam percobaan.
Untuk deteksi dengan Reguler and Mini standar Petri dish Chromocult
pour plate cultivation dilakukan dengan mengambil 1 ml sampel dicampur dengan
baik dengan 14 dan 4 ml CCA masing-masing untuk membentuk full-size dan
mini Petri dish pour plate. Suhu lebur CCA dikontrol pada 45oC. Pour plate
cultivation diinkubasi pada 35 2C selama 24 jam. Setiap pengenceran diuji
dengan pengulangan duplikat CCA. Sebuah plate dengan koloni terdistribusi baik
dengan 15-150 koloni didigitalisasi menggunakan low cost digital microscope
(Dino BW-908). Chromocult Coliform Agar (CCA) disediakan oleh Merck,
Jerman.
Reguler and Mini standar Petri dish Chromocult spread plate cultivation
dilakukan serupa dengan eksperimen pour plate, CCA dimanfaatkan untuk
membentuk solid agar plate menggunakan full-size dan mini Petri dish format.
0,1 dan 0,02 ml suspensi sampel dipipet ke plate dan digunakan spreader steril
untuk mendispersikan sampel sampai permukaan agar kering. Koloni yang
tumbuh dimonitor selama 24 jam pada 35 2C. Sisa protokol mirip dengan pour
plate technique.
Untuk Chromocult Micro Inoculation Culture (yaitu, 24-well dan 96-well
microtiter plates, volume kultivasi ditetapkan pada 5 dan 10 l di atas 24, 96wells microtiter plate CCA agar surface dan diinkubasi pada 35 2C. Kemudian
biasanya dalam waktu 12-15 jam akan terdeteksi dan tertangkap dengan low cost
digital microscopy.

14

Dengan metode penelitian seperti disebutkan di atas, penggunaan CCA

bisa berkurang sebagai berikut: 15 ml per regular Petri dish, 4 ml per mini Petri
dish, 1,45 ml per well dalam 24-wells microtiter plate dan 0,36 ml per well dalam
96-wells microtiter plate, sehingga biaya yang dibutuhkan untuk pelaksanaan
metode menjadi lebih rendah.
. Sistem deteksi prototipe ini juga bekerja dengan baik dengan format
PetrifilmTM EC plate. Gambar-gambar sampel dari koloni E. coli yang tumbuh di
CCA pada format berbeda yang diamati dengan digital microscopy ditunjukkan
pada Gambar. 3. Penggunaan mini Petri dish atau 24 dan 96-well microtiter plate
membutuhkan sistem deteksi dengan pembesaran yang lebih tinggi untuk
membantu proses enumerasi. Berbeda dengan traditional regular Petri dish
format yang biasanya menggunakan deteksi visual manusia, low-cost digital
microscopy memberikan hasil yang jauh lebih baik dan jelas. Sistem citra koloni
digital memungkinkan penyimpanan data yang efisien untuk referensi di masa
mendatang dan memfasilitasi enumerasi koloni secara otomatis dan deteksi
morfologi di agar kromogenik lainnya.

Gambar 3. Gambar kultur murni koloni E. coli setelah 12 jam inkubasi pada 352C. (a).
Regular pour plate. (b). Mini Petri dish por plate. (c). Mini Petri dish spread plate. (d).
PetrifilmTM EC plate. (e). Regular spread plate. (f). Spread plate in 24-well microtiter plate
format.

Gambar-gambar dari E. coli koloni pada Gambar. 3. diambil pada

waktu inkubasi yang sama (sekitar 12 jam), namun, ukuran koloni dan warna
morfologi bervariasi secara signifikan tergantung pada perbesaran mikroskop dan
pertumbuhan intrinsik E. coli dari format kultivasi yang berbeda. Regular Petri
dish memiliki permukaan agar besar untuk menutupi dan memungkinkan hanya
akuisisi gambar dengan perbesaran rendah untuk menutupi seluruh piring,
(Gambar 3a) Mini Petri dish yang lebih kecil memfasilitasi kekuatan pembesaran
yang lebih tinggi dari mikroskop dan ukuran koloni diperbesar secara signifikan
(Gambar 3b), ukuran koloni dan warna yang tidak seragam adalah hasil dari
perkembangbiakan koloni yang terendam di dalam lapisan agar dimana suplai

15

oksigen terbatas dan mempengaruhi tingkat ekspansi koloni dan pengembangan

warna. Hanya dengan perbesaran yang lebih tinggi perbedaan karakteristik koloni
teramati, dan penemuan ini akan tidak relevan dengan inspeksi visual manusia.
Perluasan area koloni E. coli menggunakan protokol deteksi yang
berbeda pada Gambar. 4. menunjukkan kinetika pertumbuhan koloni lambat
secara signifikan untuk kedua pour plate treatment (yaitu, standard Petri dish dan
mini Petri dish). Koloni E. coli pada semua teknik spread plate tidak hanya
berkembang pada tingkat yang jauh lebih cepat tetapi
juga tumbuh koloni yang jauh lebih besar. Volume dan format kultivasi dari teknik
spread plate tidak mempengaruhi kinetika ekspansi koloni meskipun variasi
ketebalan medium layer dalam setiap format. Mereka secara langsung
mempengaruhi volume CCA yang digunakan dan penggunaan medium yang lebih
sedikit menghasilkan protokol untuk praktek industri yang cost efficient.

Gambar 4. Profil
ekspansi koloni E. coli
dengan protokol deteksi
yang bervariasi

Untuk melakukan
penghitungan koloni
pada produk makanan, mini Petri dish format dan spread plate technique
dibandingkan dengan PetrifilmTM EC plate dan conventional pour plate routine.
Seperti disimpulkan dalam protokol validasi eksperimen, implementasi pour plate
dan spread plate technique atau Petri dish format tidak mengubah jumlah koloni
akhir dari sampel produk makanan seperti yang terlihat pada Tabel 1. Semua
protokol mengakibatkan pembacaan koloni akhir yang sama secara statistik.
Hanya ada kontaminasi coliform dan tidak ada koloni E. coli.
Tabel 6. Perhitungan coliforms dalam sampel makanan dengan berbagai variasi teknik

16

Untuk tujuan good hygienic practice (GHP), dilakukan evaluasi

kebersihan pada fasilitas produksi dengan menggunakan volume kultivasi E.
coli/coliform yang diminimalkan. Penggunaan regular pour plate adalah untuk
mengkonfirmasi pelaksanaan tiga protokol konvensional yang dimodifikasi (yaitu,
mini standar pour plate, 24- dan 96-well microtiter plate technique). Tabel 2
menunjukkan bahwa hasil coliform dari mini standar pour plate, 24- dan 96-well
format yang diusulkan, sesuai dengan regular pour plate technique. Sekali lagi,
disana tidak ada koloni E. coli. Dalam semua perlakuan, spread plate technique
menghasilkan jumlah koloni yang lebih tinggi dari pour plate technique.
Tabel 7. Perhitungan coliforms dalam production line swab dengan berbagai variasi teknik

Keuntungan dari memperkecil kultivasi untuk mendeteksi E. coli/coliform

tidak hanya mengurangi mahalnya harga CCA tetapi juga penggunaan mikroskop
digital memungkinkan perbesaran yang lebih tinggi untuk mengamati koloni
suspect ketika mereka sangat kecil dan hampir tidak terlihat oleh mata telanjang.
Deteksi dini koloni memungkinkan pengurangan waktu analisis yang signifikan
seperti yang ditunjukkan pada Tabel 8. Routine pour plate technique dan
PetrifilmTM plate membutuhkan waktu 24-48 jam dimana sebagian besar protokol
yang diusulkan hanya membutuhkan waktu 10 jam karena terbantu oleh sistem
deteksi mikroskop. Waktu inkubasi yang singkat seharusnya memberikan deteksi
E. coli/coliform rutin yang cepat dan akurat pada industri (yaitu, high throughput
capability, respon yang cepat, dan biaya yang rendah)
Tabel 8. Waktu deteksi perhitungan coliforms dengan berbagai variasi teknik

Sehingga dengan sensitivitas deteksi yang tepat tergantung pada volume

kultivasi yang digunakan, industri makanan bisa mendapatkan keuntungan dari
biaya rendah per sampel dan waktu analisis yang lebih cepat.

17

3. Prevalence, identication and molecular characterization of Cronobacter

sakazakii isolated from retail meat products (Mohammed et al., 2015)
Enterobacter sakazakii merupakan opportunistic foodborne pathogen
terutama pada neonatus dan insiden dilaporkan pada orang dewasa terutama
dengan imunitas lemah dan orang tua. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk
mengevaluasi prevalensi C. Sakazakii pada produk daging yang dijual di kota
Mansoura, Mesir yang mungkin menimbulkan bahaya yang cukup parah untuk
kelompok populasi tertentu.
Sebanyak 93 isolat bakteri yang berbeda dalam penelitian ini menjadi
subyek karakterisasi fenotipik dan genotipik untuk mendeteksi spesies
C.sakazakii. Strain yang diisolasi diambil dari sampel yang dipilih secara acak
dan diuji secara mikrobiologis dari 90 produk daging (50 ground beef dan 40 beef
burger), yang dibeli dari supermarket yang berbeda di kota Mansoura, Mesir.
Semua koloni yang dikumpulkan dimurnikan secara individual dan
dikulturkan semalam di tryptone soya agar (TSA) (Oxoid, CM0131) plate
kemudian di identifikasi. Semua isolat diuji sifat biokimianya menggunakan
sistem kit API 20E (BioM Perancis). Selain uji biokimia, termasuk produksi indol,
produksi oksidase, Voges-Proskauer, metil red, pemanfaatan malonat, reduksi
nitrat menjadi nitrit, produksi asam dari dulcitol, dan produksi gas dari D-glukosa,
dilakukan untuk melengkapi identifikasi isolat. Dugaan isolat C. sakazakii, yang
teridentifikasi secara biokimia, diuji secara uji morfologis untuk menghasilkan
non-water solluble yellow pigment. Isolat murni secara individual digesekkan ke
plate TSA dan diinkubasi pada 25C selama 48-72 jam (FDA, 2002). Strain
referensi (C. sakazakii RIMD0377001) digunakan sebagai kontrol positif.
Species-specific PCRs dilakukan untuk mengkonfimasi isolat yang
diidentifikasi secara fenotip menggunakan empat set primer spesifik yang berbeda
untuk C. sakazakii (Tabel 9).
Tabel 9. Primer yang digunakan dalam penelitian

18

Dari isolat yang dimurnikan secara individual di plate TSA, koloni tunggal
dipindahkan ke 5 ml nutrienth broth (Oxoid CM0001), dan diinkubasi semalam
pada 35C. DNA diisolasi dengan memanen sel dari 1 ml kultur dengan
sentrifugasi pada 13000 rpm selama 2 menit kemudian dicuci dua kali dengan air
suling dan diresuspensi dalam 200 l air suling kemudian dipanaskan dalam
water bath selama 10 menit untuk melisiskan sel, setelah itu, cell debris
disentrifugasi pada 13000 rpm selama 2 menit dan kemudian, supernatan
dipindahkan ke dalam tabung microcentrifuge baru dan disimpan pada 20C untuk
digunakan sebagai DNA template PCR untuk mengkarakterisasi isolat.
Selanjutnya dilakukan identifikasi isolat dengan amplifikasi Gen glucosidase, yang dilakukan untuk mengamplifikasi 1.680 bp amplikon
menggunakan EsAG primer (Tabel 4) dalam PCR reaction mixture (50 l), yang
terdiri dari 4 l dan 0,5 l DNA template (masing-masing forward dan reverse
primer), 0,4 l Taq DNA polymerase, 5 L 10x PCR buffer, 2 l (0,4 mM)
dNTPs, dengan kondisi cycling: denaturasi awal pada 94C selama 2 menit, 29
siklus denaturasi pada 94C selama 30 detik, annealing pada 58C selama 60
detik, elongasi pada 72C selama 90 detik dan elongasi final pada 72C selama 5
menit. Sedangkan identifikasi isolat dengan amplifikasi PCR 16S rRNA gene
sequencing dilakukan dengan menggunakan dua set spesies primer spesifik.
Primer set yang pertama, digunakan untuk amplifikasi 1533 amplikon bp dalam
PCR reaction mixture (25 l), yang terdiri dari 2 l dan 1 l DNA template
(masing-masing forward dan reverse primer), 0,5 l Taq DNA polymerase, 2.5 l
10x PCR buffer, 1,25 l DMSO dan 1 l (0,2 mM) dNTP, menggunakan kondisi
cycling: denaturasi awal pada 95C selama 3 menit, 30 siklus denaturasi pada

19

95C selama 30 detik, annealing pada 55C selama 30 detik, elongasi 72C
selama 90 detik, dan elongasi final pada 72C selama 5 menit (Tabel 4). Primer
set yang kedua (Hassan et al., 2007) digunakan untuk amplifikasi 952 bp
amplikon dalam PCR reaction mixture (30 l), yang terdiri dari 2,5 l dan 1 l
DNA template (masing-masing forward dan reverse primer), 0,2 l Taq DNA
poyimerase, 3 L 10x PCR buffer, 1,8 l (1,5 mM) MgCl2 dan 0,6 l (0,2 mM)
dNTP; menggunakan kondisi cycling: denaturasi awal pada 95 C selama 4 menit,
30 siklus denaturasi pada 95C selama 60 detik, annealing pada 50C selama 60
detik, elongasi pada 72C selama 90 detik dan elongasi final pada 72C selama 4
menit (Tabel 4).
Identifikasi isolat dengan amplifikasi PCR ITS sequence dilakukan untuk
amplifikasi 232 bp amplikon menggunakan SG primer (Tabel 4) dalam PCR
reaction mixture (50 l), yang terdiri dari 5 l dan 1,25 l DNA template (masingmasing forward dan reverse primer), 0,4 l Taq DNA polymerase, 6 l (3 mM)
MgCl2 dan 4 l (0,8 mM) dNTP, 2,5 l (50 mM) KCl, 0,5 l (10 mM) Tris-HCl,
menggunakan kondisi cycling: denaturasi awal pada 94C selama 10 menit; 30
siklus denaturasi pada 94C selama 30 detik, annealing pada 57C selama 60
detik, elongasi 72C selama 60 detik dan elongasi final pada 72C selama 5 menit.
Selanjutnya produk PCR dimurnikan menggunakan QIAquick Gel
Extraction Kit (Qiagen, Jerman) sesuai dengan petunjuk dari produsen.
Sequencing dari produk PCR dilakukan pada DNA Sequencer menggunakan ABI
3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, USA). Urutan yang
dihasilkan dibandingkan dengan urutan di database National Centre for
Biotechnology Information (NCBI) menggunakan BLAST.
Semua produk amplified PCR yang diperoleh dengan primer yang berbeda
dipisahkan pada 1,5% gel agarosa kemudian divisualisasikan di bawah ultraviolet
Transilluminator (BioDoc-It Sistem).
Dari 90 produk daging yang diuji, secara fenotipik, total 33,3% (30/90)
dari sampel, dikategorikan sebanyak 28% (14/50) ground beef dan 40% (16/40)
beef burger, dianggap terkontaminasi spesies C. sakazakii (satu strain dari setiap
sampel). Di sisi lain, hanya 15,6% (14/90), 16% (8/50), dan 15% (6/40) dari
keseluruhan, sampel ground beef dan beef burger, masing-masing dikonfirmasi
secara genotipik terkontaminasi strain C. sakazakii (Tabel 10). 30 strain yang

20

diidentifikasi secara fenotip, dianalisis dengan API 20E, dan hasilnya kebanyakan
strain yang diuji adalah 230537357,dengan doubtful profile with identity % =
95,5% (Tabel 10).
Tabel 10. Cronobacter sakazakii yang teridentifikasi pada sampel daging yang diuji

Dari 14 isolat C. sakazakii yang dikonfirmasi secara molekuler, isolat bisa

ditentukan menjadi 7 biogroups yang berbeda dari 16 biogroups yang dijelaskan

oleh Farmer et al. Mayoritas isolat adalah biogroup 16 (positif dulcitol), 12 isolat
dikonfirmasi menghasilkan yellow-pigmented colonies ketika ditumbuhkan pada
plate TSA pada 25C selama 48-72 jam, sedangkan 2 isolat menghasilkan whitecolored colonies (Tabel 11). Namun, C. sakazakii yang sebelumnya dikenal
sebagai "yellow-pigmented Enterobacter cloacae", karena organisme ini tumbuh
pada tryptone soya agar pada 25C dan menghasilkan non-diffusible yellow
pigment, tidak semua strain menghasilkan pigmen ini dan white C. sakazakii
strain telah diakui

Tabel 11. Key biochemical test yang digunakan untuk membedakan Cronobacter sakazakii
yang terdentifikasi dari sampel daging yang diuji

21

Untuk menguji isolat bakteri digunakan tiga discriminating unique genes

(gluA, 16S rRNA dan sequences ITS antara 16S dan 23S rRNA) yang ditujukan
untuk mendeteksi secara spesifik spesies Cronobacter, meningkatkan akurasi dan
menghindari hasil palsu. Dalam penelitian ini, semua species-specific PCR system
yang digunakan menunjukkan spesifisitas yang lebih tinggi untuk mendeteksi
semua 14 isolat C. Sakazakii (Gambar. 5).
Dengan menggunakan metode yang direkomendasikan oleh Lehner et al.
(2006) untuk mendeteksi fragmen 1680 bp gen gluA, semua C. sakazakii
yang diuji teridentifikasi secara spesifik (Gambar. 5A). Selain itu, dua spesifik
primer set digunakan untuk 16S rRNA gene sequencing, primer
set yang pertama (Es) bisa mengidentifikasi hampir seluruh panjang (1533 bp)
gen ini (Penelitian ini) (Gambar. 5B), kemudian hasilnya dikonfirmasi dengan
penggunaan primer set secara luas (Saka) dilakukan untuk amplifikasi 952 bp gen
ini (Hassan et al., 2007) (Gambar. 5C). Selain itu, SG primer sebelumnya
dilakukan (Liu et al., 2006) dengan amplifikasi 282 bp ITS sequence bisa
mengidentifikasi semua isolat C. sakazakii yang diuji (Gambar 5D).

22

Gambar 3. Agarose gel electrophoresis untuk produk PCR menggunakan Cronobacter sakazakii-specific
oligonucleotide primer sets untuk individually-amplified 1680 bp -glucosidase gene (A), 1533 bp 16S rRNA gene
(B), 952 bp 16S rRNA gene (C), dan 282 bp internal transciber spacer (ITS) sequencer (D), dilakukan untuk semua
strain C. Sakazakii yang teridentifikasi secara fenotipik yang diisolasi dari sampel produk daging yang diuji (ground
beef dan beef burger). Lane M: 100 bp DNA ladder marker, lane C-: E. coli K12 DH5 sebagai kontrol negatif strain,
Lane C+: C. Sakazakii (RIMD0377001) sebagai kontrol positif strain, lane dengan key number dari 2 sampai 54
mewakili 14 strain positif untuk gen target.

Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh disimpulkan bahwa metode

yang diusulkan dapat digunakan untuk mendeteksi kontaminasi C. Sakazakii,
terutama pada produk daging yang mungkin menjadi titik penting dalam
menyelesaikan epidemiologi patogen ini.

BAB III
PENUTUP

23

Gejala keracunan yang disebabkan oleh kontaminasi bakteri patogen yang

meliputi Enterobacter sakazakii, Escherichia coli dan Salmonella Spp., pada
makanan dapat mengakibatkan demam, mual, muntah, diare, dan sakit perut.
Bahkan dalam kasus yang parah, kematian dapat terjadi. Identifikasi bakteri
secara cepat, sensitif dan cost effective pada patogen makanan penting untuk
dilakukan karena beberapa bakteri ini bisa menyebabkan infeksi epidemi.
Beberapa metode yang disebutkan dalam makalah ini diharapkan dapat menjadi
metode alternatif yang bisa digunakan oleh industri makanan ataupun lembaga
yang berwenang dalam pengawasan dan pengendalian mutu pangan untuk dapat
melakukan penjaminan terhadap mutu pangan yang dikonsumsi oleh masyarakat
luas.

DAFTAR PUSTAKA
Anthony, Louis. 2015. Food Microbial safety and animal antibiotics.
Antimicrobial and Food Safety, Methods and Technique. Next Health
Technologies, Cox Associates and University of Colorado, Denver, Co, USA. pp
303 323
Chiang, Y. C., Tsen, Hau., Chen, Hsin., Chang, Y., Lin, C. K, Chen, C. Y, and Pai,
W. Y. 2012. Multiplex PCR and a chromogenic DNA macroarray for the detection
of Listeria monocytogens, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae,
Enterobacter sakazakii, Escherichia coli O157:H7, Vibrio parahaemolyticus,
Salmonella spp. and Pseudomonas uorescens in milk and meat samples. Journal
of Microbiological Methods 88. pp 110 116

24

Food and Enviromental Hygiene Department. 2014. Microbiological Guidelones

for Food, for Ready to Eat Food in General and Specific Food Items.
Hongkong. pp 3-10
Lazaro, D.R., Garcia, P.G., Delibato, E., Medici, D., Gimeno, R. M G., Valero, A,
and Hernandez, M. 2014. Next day Salmonella spp. detection method based on
real-time PCR for meat, dairy and vegetable food products. International Journal
of Food Microbiology 184. pp 113 120
Mohammed, M.A., Sallam, K.I, and Tamura, T. 2015. Prevalence, identication
and molecular characterization of Cronobacter sakazakii isolated from retail meat
products. Food Control 53. pp 206 - 211
Sangadkit, W., Rattanabumrung, O., Supanivatin, P, and Thipayarat, A. 2012.
Practical coliforms and Escherichia coli detection and enumeration for industrial
food samples using low-cost digital microscopy. Procedia Engineering 32. pp
126 - 133

Wang, Beibei., Wang, Qi., Cai, Zhaoxia and Ma, Meihu. 2015.
Simultaneous, rapid and sensitive detection of three food-borne pathogenic
bacteria using multicolor quantum dot probes based on multiplex
uoroimmunoassay in food samples. Food Science and Technology 61. pp
368 - 376

25