Spektrofotometri merupakan metode analisis yang didasarkan pada absorpsi radiasi

elektromagnet. Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu
sampel sebagai fungsi panjang gelombang, sedangkan pengukuran menggunakan
spektrofotometer, metoda yang digunakan sering disebut dengan spektrofotometri.

Dalam ilmu kefarmasiaan spektrofotometri digunakan untuk menganalisis kadar obat.

Spektrofotometri dapat mengindikasikan bahwa setiap obat harus dapat bekerja secara
maksimal dalam tubuh terutama dalam hal penyerapannya.
Spektrofotometri menyiratkan pengukuran jauhnya penyerapan energi cahaya oleh
suatu sistem kimia itu sebagai suatu fungsi dari panjang gelombang radiasi, demikian pula
pengukuran penyerapan yang menyendiri pada suatu panjang gelombang tertentu.
Keuntungan utama pemilihan metode spektrofotometri bahwa metode ini memberikan
metode yang cepat, sederhana, spesifik, sensitive, dan dapat dipakai untuk analisis zat uji
dalam jumlah/kadar yang kecil.
Spektrofotometri dapat dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan visual dengan
studi yang lebih mendalam dari absorbsi energi. Absorbsi radiasi oleh suatu sampel diukur
pada berbagai panjang gelombang dan dialirkan oleh suatu perkam untuk menghasilkan
spektrum tertentu yang khas untuk komponen yang berbeda.
Absorbsi sinar oleh larutan mengikuti hukum Lambert-Beer, yaitu :

A=

log ( Io / It )

= abc

Keterangan : Io = Intensitas sinar datang

It = Intensitas sinar yang diteruskan
a = Absorptivitas
b = Panjang sel/kuvet
c = konsentrasi (g/l)
A = Absorban
Spektofotometer memiliki spesifikasi yang bermacam-macam, dan yang sering
digunakan dalam metode analisis adalah spektrofotometri UV dan sinar tampak atau visible.
Sebagai mahasiswa diploma, kita dituntut untuk dapat mengaplikasikan alat ini dalam
pekerjaan kita sebagai farmasis.
Spektrofotometri UV-Vis
Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan Visible.
Menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan sumber cahaya
visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah menggunakan hanya satu sumber sinar
sebagai sumber UV dan Vis, yaitu photodiode yang dilengkapi dengan monokromator.
Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling populer
digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk sample berwarna juga
untuk sample tak berwarna.
Logika prinsip dari alat spektro-vis adalah intensitas warna dari suatu larutan
sebanding dengan jumlah cahaya yang serap. Semakin pekat warna, semakin banyak cahaya
yang di serap.

Sekarang kita bayangkan sebuah gelas. Gelas tersebut di isi dengan air mineral yang jernih.
Kemudian anda lewatkan seberkas sinar melalui gelas tersebut, misalnya dengan lampu
senter. Cahaya sinar lampu senter akan lewat dengan mudah bukan..? Menembus melalui
gelas.
Sekarang coba kita ganti isi air mineral dengan air sirup yang berwarna, katakanlah
merah. Sekarang coba anda lewatkan cahaya lampu senter melalui gelas tersebut. Apa yang
terjadi..? Sinar sulit melewati air sirup tersebut. Memang ada yang lewat, tapi tidak
semuanya. Sebagian sinar ada yang di serap oleh warna merah sirup.
Semakin pekat warna pada sirup, sinar lampu senter akan semakin sedikit yang
menembus gelas. Dengan kata lain semakin banyak cahaya yang diserap. Jumlah cahaya yang
di serap berbanding lurus dengan intensitas warna. Hal inilah yang mendasari pengukuran
spektro-vis.
Analisis Kualitatif
Panjang gelombang dimana suatu larutan zat uji memiliki serapan maksimum (disebut
panjang gelombang serapan maksimum) merupakan ciri khas dari zat uji tersebut dalam
metode spektrofotometri. Panjang gelombang serapan maksimum dapat ditentukan dengan
cara membuat spectrum penyerapan dari larutan zat uji. Dari spectrum yang penyerapan yang
diperoleh, panjang gelombang serapan maksimum larutan zat uji dibandingkan dengan
panjang gelombang serapan maksimum larutan baku pembanding (larutan standar yang
terkandung senyawa uji yang konsentrasinya sudah diketahui). Bila sama, maka zat uji sama
dengan baku pembanding. Tinggi rendahnya konsentrasi larutan, akan mempengaruhi
intensitas serapan, namun tidak mempengaruhi panjang gelombang. Oleh karena itu, jika
terdapat dua larutan terkandung senyawa yang sama akan menghasilkan panjang gelombang
maksimum yang sama.
Analisis Kuantitatif
Analisa kuantitatif umumnya didasarkan atas pengukuran serapan dari larutan zat uji
pada panjang gelombang serapan dengan konsentrasi larutan. Prosedur kerja pada analisa
kuantitatif meliputi:
1. Penyiapan Larutan Uji.
Dalam penyiapan larutan uji perlu diperhatikan kadar larutan. Kadar larutan diduat
sedemikian agar diperoleh serapan antara 0,2-0,8 sehingga memenuhi hokum Beer. Pada
rentang serapan tersebut persentase kesalahan analisis masih dalam batas yang dapat

diterima, yaitu 0,5-1%. Diluar rentang tersebut, dapat menyebabkan terjadinya kesalahan
fotometrik yang dapat mempengaruhi keakuratan metode fotometrik.
2. Pencarian Operating Time.
Cara ini biasanya dilakukan jika digunakan pengukuran hasil reaksi atau pembentukan
warna. Waktu operasional atau operating time merupakan waktu yang dibutuhkan suatu
senyawa untuk bereaksi dengan senyawa lain hingga terbentuk senyawa produk yang stabil.
Kestabilan senyawa produk diketahui dengan mengamati absorbansi mulai dari saat
direaksikan hingga tercapai serapan yang stabil. Pengukuran serapan ini dilakukan pada
panjang gelombang maksimal teoritis.
3. Pemilihan Panjang Gelombang Maksimum.
Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif adalah panjang gelombang
yang mempunyai absorbansi maksimal. Ada beberapa alasan mengapa harus dilakukan pada
panjang gelombang maksimal:

Pada panjang gelombang maksimal, kepekaannya juga maksimal karena pada panjang
gelombang maksimal tersebut, perubahan absorbansi untuk setiap satuan konsenytrasi larutan
adalah yang paling besar

Disekitar panjang gelombang maksimal, bentuk kurva absorbansi linier, sehingga memenuhi
hukum lambert-beer

Jika dilakukan pengukuran ulang, akan menghasilkan hasil yang cukup konstan

4. Pembuatan Kurva Baku.

Dibuat seri larutan baku dari zat yang akan dianalisis dengan berbagai konsentrasi.
Masing-masing absorbansi larutan dengan berbagai konsentrasi diukur, kemudian dibuat
kurva yang merupakan hubungan antara absorbansi dengan konsentrasi. Bila hukum lambertbeer terpenuhi, maka kurva baku berupa garis lurus. Dengan adanya kuva baku, maka dapat
digunakan untuk mencari absorbtifity atau persamaan regresi linier sehingga dapat digunakan
dalam pencarian suatu kadar yang absorbansinya sudah diukur.
5. Pengukuran Serapan Larutan.
Pada analisis zat tunggal, serapan larutan zat uji dan serapan larutan baku diukur pada
panjang gelombang maksimum. Pada analisis zat campuran, serapan zat uji diukur pada lebih
dari satu panjang gelombang, dimana setiap komponen campuran memiliki perbedaan
serapan maksimum. Pada setiap pengukuran serapan larutan zat uji atau baku pembanding,
harus selalu dibandingkan dengan larutan blangko, yaitu pelarut yang digunakan untuk
melarutkan zat uji.

SPEKTROFOTOMETRI
PENDAHULUAN

Spektrofotometer sangat berhubungan dengan pengukuran jauhnya pengabsorbansian energi

cahaya oleh suatu sistem kimia sebagai fungsi panjang gelombang dengan absorban maksimum dari suatu
unsur atau senyawa. Konsentrasi unsur atau senyawa dapat dihitung dengan menggunakan kurva standar
yang diukur pada panjang gelombang absorban tersebut, yaitu panjang gelombang yang diperoleh dari
hasil nilai absorbansi yang tertinggi.spektrum absorban selain bergantung pada sifat dasar kimia, juga
bergantung pada faktor- faktor lain. Perubahan pelarut sering menghasilkan pergesaran dari pta absorbansi.
Larutan pembanding dalam spektrofotometri pada umumnya adalah pelarut murni atau suatu larutan
blanko yang mengandung sedikit zat yang akan ditetapkan atau tidak sama sekali (Day & Underwood
1998).
Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu sampel sebagai
fungsi panjang gelombang. Sedangkan pengukuran menggunakan spektrofotometer ini, metoda yang
digunakan sering disebut dengan spektrofotometri.
Spektrofotometri dikenal menjadi dua kelompok utama, yaitu spektofotometri atom dan
spektrofotometri molekular. Dasar dari spektrofotometri atom adalah tingkat energi elektron valensi suatu
atom atau unsur. Dasar spektrofotometri molekul adalah tingkat molekul yang melibatkan energi
elektronik, energi vibrasi, dan energi rotasi. Spektra absorbansi dari spektrofotometri atom lebih sederhana
daripada spektra molekulnya karena keadaan energi elektronik tidak mempunyai sub tingkatan vibrasirotasi. Jadi,
spektra absorbansi atom terdiri dari garis-garis yang jauh lebih tajam daripada
pita-pita yang diamati dalam spektroskopi molekuler (Harjadi 1993).
Gambar 1 Spektrofotometri
TUJUAN PERCOBAAN

Percobaan ini bertujuan untuk mencari spektrum serapan suatu zat dan menentukan kandungan
asam amino bebas pada kentang atau ubi jalar dengan metode spektrofotometri.

Pendahuluan
Spektrofotometri merupakan suatu metoda analisa yang didasarkan pada pengukuran serapan
sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombamg spesifik
dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detektor fototube.
Benda bercahaya seperti matahari atau bohlam listrik memancarkan spektrum yang lebar
terdiri atas panjang gelombang. Panjang gelombang yang dikaitkan dengan cahaya tampak itu
mampu mempengaruhi selaput pelangi mata manusia dan karenanya menimbulkan kesan
subyektif akan ketampakan (vision). Dalam analisis secara spektrofotometri terdapat tiga
daerah panjang gelombang elektromagnetik yang digunakan, yaitu daerah UV (200 380
nm), daerah visible (380 700 nm), daerah inframerah (700 3000 nm) (Khopkar 1990).
Menurut Cairns (2009), spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau
absorban suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Tiap media akan menyerap cahaya
pada panjang gelombang tertentu tergantung pada senyawaan atau warna terbentuk. Secara
garis besar spektrofotometer terdiri dari 4 bagian penting yaitu :
a. Sumber Cahaya
Sebagai sumber cahaya pada spektrofotometer, haruslah memiliki pancaran radiasi yang
stabil dan intensitasnya tinggi. Sumber energi cahaya yang biasa untuk daerah tampak,
ultraviolet dekat, dan inframerah dekat adalah sebuah lampu pijar dengan kawat rambut
terbuat dari wolfram (tungsten). Lampu ini mirip dengan bola lampu pijar biasa, daerah
panjang gelombang (l ) adalah 350 2200 nanometer (nm).
b. Monokromator
Monokromator adalah alat yang berfungsi untuk menguraikan cahaya polikromatis menjadi
beberapa komponen panjang gelombang tertentu
(monokromatis) yang bebeda (terdispersi).
c. Cuvet
Cuvet spektrofotometer adalah suatu alat yang digunakan sebagai tempat
contoh atau cuplikan yang akan dianalisis. Cuvet biasanya terbuat dari kwars, plexigalass,
kaca, plastic dengan bentuk tabung empat persegi panjang 1 x 1 cm dan tinggi 5 cm. Pada
pengukuran di daerah UV dipakai cuvet kwarsa atau plexiglass, sedangkan cuvet dari kaca
tidak dapat dipakai sebab kaca mengabsorbsi sinar UV. Semua macam cuvet dapat dipakai
untuk pengukuran di daerah sinar tampak (visible).
d. Detektor
Peranan detektor penerima adalah memberikan respon terhadap cahaya pada berbagai
panjang gelombang. Detektor akan mengubah cahaya menjadi sinyal listrik yang selanjutnya
akan ditampilkan oleh penampil data dalam bentuk jarum penunjuk atau angka digital.
Dengan mengukur transmitans larutan sampel, dimungkinkan untuk menentukan
konsentrasinya dengan menggunakan hukum Lambert-Beer. Spektrofotometer akan

mengukur intensitas cahaya melewati sampel (I), dan membandingkan ke intensitas cahaya
sebelum melewati sampel (Io). Rasio disebut transmittance, dan biasanya dinyatakan dalam
persentase (% T) sehingga bisa dihitung besar absorban (A) dengan rumus A = -log %T
(Underwood 2002).
Tujuan
Praktikum ini bertujuan praktikan dapat memahami dan mengoperasikan spektrofotometri
UV-Vis untuk pengukuran sampel suatu larutan dengan konsentrasi yang berbeda-beda.
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam praktikum yaitu labu takar, tabung reaksi, dan pipet volumtrik.
Spektrofotometer UV-Vis yang digunakan yaitu spectronic J20 dan kuvet.
Larutan metilen biru dengan konsentrasi dari 210-6 M sampai 110-5 M merupakan bahan
utama yang digunakan untuk percobaan mengggunakan spektrofotometer UV-Vis. Selain itu,
akuades juga digunakan untuk melakukan pengenceran larutan metilen biru menjadi
konsentrasi yang berbeda-beda.
Prosedur Percobaan
Sebelum mengukur larutan metilen biru dengan Spectronic 20, hal yang harus dilakukan
pertama kali adalah mengencerkan larutan metilen biru 10 mmol dengan konsentrasi 210-6
M, 410-6 M, 610-6 M, 810-6 M, dan 110-5 M. Larutan metilen biru dengan konsentrasi
610-6 M digunakan untuk menentukan panjang gelombang maksimum ( max). Transmitan
diukur menggunakan alat spectronic J20 menggunakan panjang gelombang 600-680 nm
dengan interval 10 nm.
Untuk membuat kurva standar, transmitan dari tiap konsentrasi larutan metilen biru dibaca
menggunakan panjang gelombang maksimum yang kita peroleh, yaitu 660 nm. Hasil
pengukuran yang diperoleh dicatat, kemudian dikonversikan menjadi absorban dengan rumus
A = -log %T. Setelah itu, dapat dibuat kurva hubungan antara konsentrasi metilen biru dengan
absorban. Persamaan garis bisa dicari setelah menggambar kurva.
Hasil Percobaan
Tabel 1 Penentuan panjang gelombang maksimum metilen biru
(nm)
600
610
620
630
640
650
660
670

% Transmitan
0.541
0.948
0.483
0.457
0.432
0.396
0.390
0.433

Absorban
0.267
0.023
0.316
0.340
0.365
0.402
0.409
0.364

680

0.619

0.208

Contoh perhitungan:
= 600 nm
%T = 54,1%
A = -log %T
= -log 0.541
= 0.267
Tabel 2 Penentuan kurva standar dari metilen biru
[metilen biru] (M)
210-6
410-6
610-6
810-6
110-5

% Transmitan
0.794
0.577
0.390
0.277
0.244

Absorban
0.100
0.239
0.409
0.558
0.613

Contoh perhitungan:
[metilen biru] = 110-5
%T = 24.4%
A = -log %T
= -log 0.244
= 0.613
y = a + bx ; y = A, x = [metilen biru]
y = -0.0197 + 67250x
r = 98,88%
Pembahasan
Prinsip kerja spektrofotometri berdasarkan hukum Lambert Beer, bila cahaya monokromatik
(Io) melalui suatu media (larutan), maka sebagian cahaya tersebut diserap (Ia), sebagian
dipantulkan (Ir), dan sebagian lagi dipancarkan (It). Transmitans adalah perbandingan
intensitas cahaya yang ditransmisikan ketika melewati sampel (It) dengan intensitas cahaya
mula-mula sebelum melewati sampel (Io). Persyaratan hukum Lambert Beer, antara lain:

radiasi yang digunakan harus monokromatik, energi radiasi yang diabsorpsi oleh sampel tidak
menimbulkan reaksi kimia, sampel (larutan) yang mengabsorpsi harus homogen, tidak terjadi
fluoresensi atau phosporesensi, dan indeks refraksi tidak berpengaruh terhadap konsentrasi,
jadi larutan tidak pekat (harus encer). Spektrofotometer UV-Vis membandingkan cuplikan
standar yaitu substrat gelas preparat. Hasil pengukuran dari spektrofotometer UV-Vis
menunjukkan kurva hubungan transmitan dan panjang gelombang ( ) (Basset 1994).
Spektrofotometer terdiri dari beberapa jenis berdasar sumber cahaya yang digunakan, yaitu:
spektrofotometer Vis (Visible), spektrofotometer UV (Ultra Violet), spektrofotometer UVVis, dan Spektrofotometri IR (Infa Red). Pada spektrofotometri Vis, yang digunakan sebagai
sumber sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum
elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang sinar tampak
adalah 380 750 nm. Berbeda dengan spektrofotometri visible, pada spektrofotometri UV
berdasarkan interaksi sample dengan sinar UV. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190380 nm. Senyawa yang dapat menyerap sinar UV terkadang merupakan senyawa yang tidak
memiliki warna (bening dan transparan). Spektrofotometri UV-Vis menggunakan dua buah
sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan sumber cahaya visible yaitu photodiode yang
dilengkapi dengan monokromator dan dapat digunakan baik untuk sample berwarna juga
untuk sample tak berwarna. Sedangkan, spektrofotmetri IR berdasar pada penyerapan
panjang gelombang infra merah yang mempunyai panjang gelombang 2.5-1000 m. Pada
spektrofotometri IR digunakan untuk analisa kualitatif, misalnya untuk mengidentifikasi
gugus fungsi pada suatu senyawa.
Pada umumnya sampel yang digunakan dalam bentuk larutan yang sudah diencerkan dengan
jumlah konsentrasi tertentu. Larutan dengan konsentrasi yang rendah akan lebih mudah
diketahui transmitannya karena kerapatan pada molekulnya kecil sehingga kemampuan
menyerap radiasi elektromagnetnya kecil dan banyak radiasi yang terbaca oleh detektor pada
alat spektrofotometer. Larutan metilen biru yang digunakan pada percobaan diencerkan
sebanyak 5 kali yaitu 210-6 M, 410-6 M, 610-6 M, 810-6 M, dan 110-5 M.
Setiap senyawa punya serapan maksimal pada panjang gelombang tertentu. Panjang
gelombang ini dinamakan panjang gelombang maksimum. Pada panjang gelombang
maksimum, hubungan antara absorbansi dan
konsentrasi senyawa bisa disetarakan. Panjang gelombang maksimum dicari lebih dahulu
supaya lebih mudah mengatur range panjang gelombang analisanya. Apabila max tidak dicari
terlebih dahulu maka akan sulit menganalisa senyawa tersebut. Menurut literatur, panjang
gelombang maksimum ( max) larutan metilen biru adalah 664 nm (Sumerta, dkk 2002).
Panjang gelombang maksimum dari hasil percobaan yaitu pada 660 nm dengan konsentrasi
metilen biru sebesar 610-6 M. Jadi, hasil yang didapat pada percobaan tidak berbeda jauh
dengan literatur.
Nilai absorban dapat dihitung dari setiap nilai %T yang didapatkan. Setelah nilai absorban
diketahui, maka dapat dibuat kurva standar, dengan mengalurkan nilai absorban pada sumbu
y terhadap konsentrasi metilen biru pada sumbu x. Pembuatan kurva standar bertujuan untuk
mendapatkan hubungan antara konsentrasi dengan absorban, sehingga konsentrasi larutan
sampel dapat diketahui.
Grafik 1 yang menggambarkan kurva hubungan antara panjang gelombang dan absorban
menunjukkan bahwa nilai panjang gelombang maksimum larutan metilen biru terletak pada
660 nm dengan nilai absorban sebesar 0.409. Dari grafik tersebut didapat persmaan garis y =

-0.8047 + 1.72510-3x. Grafik 2 menggambarkan kurva hubungan antara konsentrasi metilen

biru dengan absorban. Persamaan garis yang didapat dari garis tersebut yaitu y = -0.0197 +
67250x.
Simpulan
Panjang gelombang dari larutan biru metilen yang didapat bernilai 660 nm, mendekati nilai
yang terdapat di literatur, yaitu 664 nm. Hasil ini menunjukkan bahwa spektrofotometer yang
digunakan berjenis visible atau bekerja dengan kisaran panjang gelombang 340 nm 1000
nm.

Pendahuluan
Spektrofotometri merupakan suatu metoda analisa yang didasarkan pada pengukuran serapan
sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombamg spesifik
dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detektor fototube.
Benda bercahaya seperti matahari atau bohlam listrik memancarkan spektrum yang lebar
terdiri atas panjang gelombang. Panjang gelombang yang dikaitkan dengan cahaya tampak itu
mampu mempengaruhi selaput pelangi mata manusia dan karenanya menimbulkan kesan
subyektif akan ketampakan (vision). Dalam analisis secara spektrofotometri terdapat tiga
daerah panjang gelombang elektromagnetik yang digunakan, yaitu daerah UV (200 380
nm), daerah visible (380 700 nm), daerah inframerah (700 3000 nm) (Khopkar 1990).
Menurut Cairns (2009), spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau
absorban suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Tiap media akan menyerap cahaya
pada panjang gelombang tertentu tergantung pada senyawaan atau warna terbentuk. Secara
garis besar spektrofotometer terdiri dari 4 bagian penting yaitu :
a. Sumber Cahaya
Sebagai sumber cahaya pada spektrofotometer, haruslah memiliki pancaran radiasi yang
stabil dan intensitasnya tinggi. Sumber energi cahaya yang biasa untuk daerah tampak,
ultraviolet dekat, dan inframerah dekat adalah sebuah lampu pijar dengan kawat rambut
terbuat dari wolfram (tungsten). Lampu ini mirip dengan bola lampu pijar biasa, daerah
panjang gelombang (l ) adalah 350 2200 nanometer (nm).
b. Monokromator
Monokromator adalah alat yang berfungsi untuk menguraikan cahaya polikromatis menjadi
beberapa komponen panjang gelombang tertentu
(monokromatis) yang bebeda (terdispersi).
c. Cuvet
Cuvet spektrofotometer adalah suatu alat yang digunakan sebagai tempat

contoh atau cuplikan yang akan dianalisis. Cuvet biasanya terbuat dari kwars, plexigalass,
kaca, plastic dengan bentuk tabung empat persegi panjang 1 x 1 cm dan tinggi 5 cm. Pada
pengukuran di daerah UV dipakai cuvet kwarsa atau plexiglass, sedangkan cuvet dari kaca
tidak dapat dipakai sebab kaca mengabsorbsi sinar UV. Semua macam cuvet dapat dipakai
untuk pengukuran di daerah sinar tampak (visible).
d. Detektor
Peranan detektor penerima adalah memberikan respon terhadap cahaya pada berbagai
panjang gelombang. Detektor akan mengubah cahaya menjadi sinyal listrik yang selanjutnya
akan ditampilkan oleh penampil data dalam bentuk jarum penunjuk atau angka digital.
Dengan mengukur transmitans larutan sampel, dimungkinkan untuk menentukan
konsentrasinya dengan menggunakan hukum Lambert-Beer. Spektrofotometer akan
mengukur intensitas cahaya melewati sampel (I), dan membandingkan ke intensitas cahaya
sebelum melewati sampel (Io). Rasio disebut transmittance, dan biasanya dinyatakan dalam
persentase (% T) sehingga bisa dihitung besar absorban (A) dengan rumus A = -log %T
(Underwood 2002).
Tujuan
Praktikum ini bertujuan praktikan dapat memahami dan mengoperasikan spektrofotometri
UV-Vis untuk pengukuran sampel suatu larutan dengan konsentrasi yang berbeda-beda.
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam praktikum yaitu labu takar, tabung reaksi, dan pipet volumtrik.
Spektrofotometer UV-Vis yang digunakan yaitu spectronic J20 dan kuvet.
Larutan metilen biru dengan konsentrasi dari 210-6 M sampai 110-5 M merupakan bahan
utama yang digunakan untuk percobaan mengggunakan spektrofotometer UV-Vis. Selain itu,
akuades juga digunakan untuk melakukan pengenceran larutan metilen biru menjadi
konsentrasi yang berbeda-beda.
Prosedur Percobaan
Sebelum mengukur larutan metilen biru dengan Spectronic 20, hal yang harus dilakukan
pertama kali adalah mengencerkan larutan metilen biru 10 mmol dengan konsentrasi 210-6
M, 410-6 M, 610-6 M, 810-6 M, dan 110-5 M. Larutan metilen biru dengan konsentrasi
610-6 M digunakan untuk menentukan panjang gelombang maksimum ( max). Transmitan
diukur menggunakan alat spectronic J20 menggunakan panjang gelombang 600-680 nm
dengan interval 10 nm.
Untuk membuat kurva standar, transmitan dari tiap konsentrasi larutan metilen biru dibaca
menggunakan panjang gelombang maksimum yang kita peroleh, yaitu 660 nm. Hasil
pengukuran yang diperoleh dicatat, kemudian dikonversikan menjadi absorban dengan rumus
A = -log %T. Setelah itu, dapat dibuat kurva hubungan antara konsentrasi metilen biru dengan
absorban. Persamaan garis bisa dicari setelah menggambar kurva.
Hasil Percobaan

Tabel 1 Penentuan panjang gelombang maksimum metilen biru

(nm)
600
610
620
630
640
650
660
670
680

% Transmitan
0.541
0.948
0.483
0.457
0.432
0.396
0.390
0.433
0.619

Absorban
0.267
0.023
0.316
0.340
0.365
0.402
0.409
0.364
0.208

Contoh perhitungan:
= 600 nm
%T = 54,1%
A = -log %T
= -log 0.541
= 0.267
Tabel 2 Penentuan kurva standar dari metilen biru
[metilen biru] (M)
210-6
410-6
610-6
810-6
110-5
Contoh perhitungan:
[metilen biru] = 110-5
%T = 24.4%
A = -log %T
= -log 0.244
= 0.613

% Transmitan
0.794
0.577
0.390
0.277
0.244

Absorban
0.100
0.239
0.409
0.558
0.613

y = a + bx ; y = A, x = [metilen biru]
y = -0.0197 + 67250x
r = 98,88%
Pembahasan
Prinsip kerja spektrofotometri berdasarkan hukum Lambert Beer, bila cahaya monokromatik
(Io) melalui suatu media (larutan), maka sebagian cahaya tersebut diserap (Ia), sebagian
dipantulkan (Ir), dan sebagian lagi dipancarkan (It). Transmitans adalah perbandingan
intensitas cahaya yang ditransmisikan ketika melewati sampel (It) dengan intensitas cahaya
mula-mula sebelum melewati sampel (Io). Persyaratan hukum Lambert Beer, antara lain:
radiasi yang digunakan harus monokromatik, energi radiasi yang diabsorpsi oleh sampel tidak
menimbulkan reaksi kimia, sampel (larutan) yang mengabsorpsi harus homogen, tidak terjadi
fluoresensi atau phosporesensi, dan indeks refraksi tidak berpengaruh terhadap konsentrasi,
jadi larutan tidak pekat (harus encer). Spektrofotometer UV-Vis membandingkan cuplikan
standar yaitu substrat gelas preparat. Hasil pengukuran dari spektrofotometer UV-Vis
menunjukkan kurva hubungan transmitan dan panjang gelombang ( ) (Basset 1994).
Spektrofotometer terdiri dari beberapa jenis berdasar sumber cahaya yang digunakan, yaitu:
spektrofotometer Vis (Visible), spektrofotometer UV (Ultra Violet), spektrofotometer UVVis, dan Spektrofotometri IR (Infa Red). Pada spektrofotometri Vis, yang digunakan sebagai
sumber sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum
elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang sinar tampak
adalah 380 750 nm. Berbeda dengan spektrofotometri visible, pada spektrofotometri UV
berdasarkan interaksi sample dengan sinar UV. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190380 nm. Senyawa yang dapat menyerap sinar UV terkadang merupakan senyawa yang tidak
memiliki warna (bening dan transparan). Spektrofotometri UV-Vis menggunakan dua buah
sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan sumber cahaya visible yaitu photodiode yang
dilengkapi dengan monokromator dan dapat digunakan baik untuk sample berwarna juga
untuk sample tak berwarna. Sedangkan, spektrofotmetri IR berdasar pada penyerapan
panjang gelombang infra merah yang mempunyai panjang gelombang 2.5-1000 m. Pada
spektrofotometri IR digunakan untuk analisa kualitatif, misalnya untuk mengidentifikasi
gugus fungsi pada suatu senyawa.
Pada umumnya sampel yang digunakan dalam bentuk larutan yang sudah diencerkan dengan
jumlah konsentrasi tertentu. Larutan dengan konsentrasi yang rendah akan lebih mudah
diketahui transmitannya karena kerapatan pada molekulnya kecil sehingga kemampuan
menyerap radiasi elektromagnetnya kecil dan banyak radiasi yang terbaca oleh detektor pada
alat spektrofotometer. Larutan metilen biru yang digunakan pada percobaan diencerkan
sebanyak 5 kali yaitu 210-6 M, 410-6 M, 610-6 M, 810-6 M, dan 110-5 M.
Setiap senyawa punya serapan maksimal pada panjang gelombang tertentu. Panjang
gelombang ini dinamakan panjang gelombang maksimum. Pada panjang gelombang
maksimum, hubungan antara absorbansi dan
konsentrasi senyawa bisa disetarakan. Panjang gelombang maksimum dicari lebih dahulu
supaya lebih mudah mengatur range panjang gelombang analisanya. Apabila max tidak dicari
terlebih dahulu maka akan sulit menganalisa senyawa tersebut. Menurut literatur, panjang
gelombang maksimum ( max) larutan metilen biru adalah 664 nm (Sumerta, dkk 2002).

Panjang gelombang maksimum dari hasil percobaan yaitu pada 660 nm dengan konsentrasi
metilen biru sebesar 610-6 M. Jadi, hasil yang didapat pada percobaan tidak berbeda jauh
dengan literatur.
Nilai absorban dapat dihitung dari setiap nilai %T yang didapatkan. Setelah nilai absorban
diketahui, maka dapat dibuat kurva standar, dengan mengalurkan nilai absorban pada sumbu
y terhadap konsentrasi metilen biru pada sumbu x. Pembuatan kurva standar bertujuan untuk
mendapatkan hubungan antara konsentrasi dengan absorban, sehingga konsentrasi larutan
sampel dapat diketahui.
Grafik 1 yang menggambarkan kurva hubungan antara panjang gelombang dan absorban
menunjukkan bahwa nilai panjang gelombang maksimum larutan metilen biru terletak pada
660 nm dengan nilai absorban sebesar 0.409. Dari grafik tersebut didapat persmaan garis y =
-0.8047 + 1.72510-3x. Grafik 2 menggambarkan kurva hubungan antara konsentrasi metilen
biru dengan absorban. Persamaan garis yang didapat dari garis tersebut yaitu y = -0.0197 +
67250x.
Simpulan
Panjang gelombang dari larutan biru metilen yang didapat bernilai 660 nm, mendekati nilai
yang terdapat di literatur, yaitu 664 nm. Hasil ini menunjukkan bahwa spektrofotometer yang
digunakan berjenis visible atau bekerja dengan kisaran panjang gelombang 340 nm 1000
nm.