Anda di halaman 1dari 24

TRANSFORMASI PLASMID

I. TUJUAN
1.1 Praktikum ini bertujuan untuk melakukan transformasi pada sel
E.coli .

II. PRINSIP
2.1 Pembuatan sel kompeten yang dapat disisipi vektor DNA
rekombinan.E.Coli dibiakkan dalam suspensi media,pada saat mid-
log phase diambil dengan cara sentrifugasi dan inkubasi dalam es
dengan penambahan larutan CaCl
2
dingin.
2.2 Transformasi E.Coli dengan plasmid rekombinan ditambahkan ke
dalam sel kompeten disertai dengan kontrol.Campuran sel kompeten
dan DNA plasmid diinkubasi dalam es kemudian diberi kejut panas
(heat-shock) pada suhu 42C dam selanjutnya diinkubasi pada suhu
37C.
2.3 Seleksi koloni E.Coli yang telah disisipi DNA plasmid rekombinan
dengan menggunakan cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG.

III. TEORI
Dalam perkembangannya, istilah transformasi telah
didefinisikan secara lebih luas lagi yaitu pengambilan molekul DNA
oleh setiap jenis sel tanpa memandang apakah pengambilan molekul
DNA tersebut menyebabkan adanya perubahan dalam sel yangdapat
dideteksi atau tidak dan objek dari transformasi ini tidak terbatas pada
bakteri saja,tetapi termasuk juga fungi, hewan, dan tumbuhan.
Transformasi merupakan teknik transfer molekul DNA ke dalam sel
inang bakteri misalnya bakteri E.coli. Fenotif Strain E. coli hasil
transforman akan berubah karena mendapatkan gen-gen penyandi baru
yang dibawa oleh molekul DNA tersebut. Molekul DNA ini biasanya
dikemas dalam suatu vektor, misalnya plasmid. Pemasukkan molekul
DNA rekombinan ke dalam sel inang disebut transformasi apabila
vektor yang digunakan berupa plasmid. Peristiwa ini disebut
transformasi karena plasmid dapat mengubah sifat sel inang.
Keberhasilan plasmid masuk dan bertahan di dalam sel umumnya
dideteksi berdasarkan ekspresi gen marka yang dibawa oleh plasmid
tersebut(Brown, 1991).
Transformasi memiliki arti penting dan sangat berguna dalam
penelitian penelitian genetik bakteri di laboratorium terutama bagi
pemetaan kromosom bakteri. Hal ini terjadi karena frekuensi terjadinya
transformasi antara dua gen pada waktu yang samamerupakan petunjuk
jarak antara gen gen ini pada kromosom. Plasmid adalah molekul
DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang terdapat di
dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Gen-gen yang terdapat di dalam
plasmid pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan
kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi sering kali menyandi
sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik. Dalam rekayasa
genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-
gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut
selanjutnya akan mengekspresikan produk komersial tertentu seperti
insulin, interferon, dan berbagai enzim(Pelczar dan Chan, 1986).
Transformasi merupakan teknik transfer molekul DNA ke dalam
sel inang bakteri misalnya bakteri E.coli. Fenotif Strain E. coli hasil
transforman akan berubah karena mendapatkan gen-gen penyandi baru
yang dibawa oleh molekul DNA tersebut. Molekul DNA ini biasanya
dikemas dalam suatu vektor, misalnya plasmid. Proses transformasi
merupakan proses yang tidak efisien walaupun sel telah dibuat
kompeten. Bagian sel yang berhasil menyerap DNA plasmid sangat
rendah, sehingga diperlukan metode untuk membedakan antara sel
transforman dan sel nontransforman. Sel transforman adalah sel yang
berhasil menyerap DNA plasmid, sedangkan sel nontransforman adalah
sel yang tidak membawa DNA plasmid. Seleksi transforman umumnya
berdasarkan adanya marka seleksi 18 yang disisipkan pada plasmid.
Marka seleksi merupakan gen yang memberi karakterisrik baru pada sel
transforman yang tidak dimiliki oleh sel bukan transforman. Sel inang
yang telah mengandung DNA rekombinan dibiakkan dalam medium
padat, sehingga membentuk koloni. Koloni yang terbentuk merupakan
sekumpulan sel yang identik karena hasil pembiakan sebuah sel. Koloni
yang dapat tumbuh pada media seleksi ini adalah koloni yang berasal
dari bakteri transforman saja ( Wibowo, 2002).
Tahap berikutnya dalam eksperimen pengklonan gen setelah
molekul DNA rekombinan berhasil dikonstruksi adalah memasukkan
molekul DNA rekombinan tersebut ke dalam sel hidup yang disebut sel
inang. Sel inang yang paling umum digunakan adalah Escherichia coli.
Tidak semua sel secara alami memiliki kemampuan untuk menyerap
DNA asing. Setiap sel memiliki efisiensi yang berbeda dalam menyerap
molekul DNA. Beberapa spesies yang dapat menyerap DNA secara
efisien adalah Bacillus dan Streptococcus. Sel yang tergolong tidak
efisien dalam menyerap DNA adalah Escherichia coli. Sel ini memiliki
kemampuan alami menyerap DNA asing yang rendah. Sel E. coli secara
alami memiliki kemampuan transformasi yang rendah. Peningkatan
kemampuan transformasi secara alami dilakukan dengan memanen sel
pada fase stasioner dan penumbuhan kembali pada media. Sel yang
kompeten diperoleh pada fase lag dan menghilang pada fase log
(eksponensial). Laju transformasi meningkat seiring dengan jumlah
plasmid hingga mencapai fase plateau. Sel E.coli yang kompeten diberi
perlakuan kejut panas untuk membuka pori pada dinding sel bakteri.
Inkubasi dengan plasmid akan menyebabkan masuknya plasmid ke
dalam sel. Penambahan media LB setelah perlakuan kejut panas
berfungsi untuk memenuhi kebutuhan nutrisi dari bakteri setelah
mengalami perlakuan yang ekstrem(Tsen,2002).
Salah satu cara untuk menyeleksi klon yang benar adalah dengan
menggunakan media tumbuh yang mengandung antibiotik.Cairan
suspensi dalam pekerjaan transformasi (campuran antara
bakteri,plasmid,dan DNA asing yang telah di perlukan dalam rangka
trasformasi) di sedarkan pada media yang mengandung tetasiklin.
Koloni bakteri yang tumbuh adalah koloni sel 1 dan koloni sel 2 (koloni
adalah kumpulan sel yang sama yang semula berasal dari satu sel). Sel
bakteri yang tidak mengandung plasmid tidak mampu tumbuh. Masing-
masing koloni yang tumbuh pada media + tetrasklin kemudian di
pindahkan pada media + ampisilin. Koloni yang tidak tumbuh pada
media + ampisilin adalah koloni yang di inginkan (sel-sel bakterinya
mengandung plasmid rekombinasi). Bakteri ditumbuhkan pada medium
yang mengandung ampisilin. Dengan adanya ampisilin, maka sel E. coli
yang dapat tumbuh hanya sel transforman atau sel yang telah
memasukkan plasmid(Wibowo, 2002).
DNA rekombinan (rDNA) adalah bentuk DNA buatan yang
dibuat dengan menggabungkan dua atau lebih sekuens yang tidak akan
biasanya terjadi bersama-sama.Dalam hal modifikasi genetik, itu adalah
diciptakan melalui pengenalan DNA yang relevan ke dalam DNA
organisme yang ada, seperti plasmid bakteri, untuk kode untuk atau
mengubah sifat berbeda untuk tujuan tertentu, seperti resistensi
antibiotik.Ini berbeda dari rekombinasi genetika dalam hal itu tidak
terjadi melalui proses alam dalam sel, tetapi direkayasa.Sebuah protein
rekombinan adalah protein yang berasal dari DNA rekombina(Pelcza,
1986).
Teknologi DNA Rekombinan telah memberikan banyak manfaat
bagi perkembangan ilmu pengetahuan maupun bagi kehidupam manusia
sehari-hari. Beberapa jenis obat-obatan, vaksin, bahan pangan, bahan
pakaian dan lainnya telah diproduksi dengan memanfaatkan teknologi
DNA Rekombinan.Dalam kehidupan kita sehari-hari, secara langsung
maupun tidak langsung, sebagian dari kita pernah berhubungan dengan
hasil penggunaan teknologi DNA Rekombinan. Contoh: insulin telah
digunakan untuk mengobati penyakit diabetes. Penyakit diabetes pada
manusia diobati dengan insulin manusia.Saat ini insulin manusia telah
berhasil diproduksi secara masal dengan menggunakan bakteri.
Kemampuan bakteri untuk memproduksi insulin manusia ini adalah
karena manusia telah berhasil memasukkan dan mengintegrasikan gen
yang menyandikan insulin manusia kedalam genom bakteri(Wibowo,
2002).
pCAMBIA vektor backbone berasal dari vektor pPZP (dibangun
oleh Hajdukiewicz, Svab& Maliga, lihat References21). Sementara
keterbatasan teknis dan IP tidak sempurna dan memiliki (lihat BioForge
GUSPlus Project 22, di mana kita meningkatkan gen reporter dan
metode seleksi untuk lebih lengkap kebebasan untuk beroperasi), vektor
pCAMBIA menawarkan:
jumlah salinan tinggi dalam E.coli untuk hasil DNA tinggi
pVS1 replicon untuk stabilitas tinggi dalam Agrobacterium
ukuran kecil, 7-12kb tergantung pada plasmid
situs restriksi dirancang untuk modifikasi plasmid modular dan
kecil tapi memadai poli-linker untuk memperkenalkan DNA
Anda minati
Pilihan bakteri dengan kloramfenikol atau kanamisin
Pilihan tanaman dengan higromisin B atau kanamisin (seleksi
fosfinotrisin dihentikan di permintaan pemilik IP, Bayer, setelah
distribusi awal tahun 1997)
cara sederhana untuk membangun fusi translasi gen reporter
gusA.

Gambar 1: pCAMBIA
Nomenklatur vektor pCAMBIA:
Digit pertama - mengindikasikan pemilihan tanaman: 0 untuk
ketidakhadiran, 1 untuk resistensi higromisin, 2 untuk kanamisin, dan 3
untuk fosfinotrisin (vektor yang mengandung gen resistensi fosfinotrisin
tidak lagi tersedia dari Cambia atas permintaan Bayer, yang memiliki
paten membatasi penggunaannya dalam beberapa negara).
Digit kedua - menunjukkan seleksi bakteri: 1 untuk spektinomisin /
streptomisin resistensi, 2 untuk kloramfenikol, 3 untuk kanamisin, 4
untuk spek / radang dan kanamisin.
Ketiga digit - menunjukkan polylinker digunakan: 0 untuk pUC18
polylinker, 8 untuk pUC8 polylinker, 9 untuk pUC9 polylinker.
Keempat digit - menunjukkan gen pelapor (s) hadir: 0 untuk tidak ada
gen pelapor, 1 untuk E.coli gusA, 2 untuk mgfp5; 3 untuk gusA: mgfp5
fusi, 4 untuk mgfp5: gusA fusi, 5 untuk Staphylococcus sp. gusA
(GUSPlus).
Kelima digit - mencatat beberapa fitur khusus lainnya. Sejauh ini telah
digunakan hanya dengan: pCAMBIA1305.1 dan plasmid berasal
darinya, di mana 0,1 menunjukkan tidak adanya peptida sinyal dari
GUSPlus tersebut protein, dan pCAMBIA1305.2 mana 0,2
menunjukkan adanya sinyal peptida GRP dalam planta sekresi protein
GUSPlus.
Lagging surat - X menunjukkan bahwa gen pelapor kekurangan nya
kodon start sendiri dan vektor adalah untuk menciptakan fusi kepada
reporter, Z menunjukkan adanya lacZa fungsional untuk skrining biru-
putih, a / b / c menunjukkan bingkai membaca untuk fusi dengan Fuse
dan Penggunaan vektor. (Tsen et al. 2002).
Gus vektor Seleksi Intron (pCAMBIA1201; pCAMBIA1301,
pCAMBIA2201; pCAMBIA2301)
Peneliti ingin versi terbaru harus melihat pCAMBIA 1.305,1,
pCAMBIA1105.1 atau Pcambia 1305.2103, yang dapat diminta melalui
BioForge GUSPlus Project104. Informasi tentang tua vektor pCAMBIA
di sini untuk kenyamanan.Vektor ini mengandung berfungsi penuh
gusA reporter membangun untuk analisis sederhana dan sensitif gen
fungsi atau kehadiran di tanaman diregenerasi dengan GUS assay.
Konstruk menggunakan E.coli gusA (N358Q untuk menghindari
glikosilasi N-linked) dengan intron (dari biji jarak gen katalase) dalam
pengkodean urutan untuk memastikan bahwa ekspresi aktivitas
glukuronidase berasal dari sel-sel eukariotik, bukan dari ekspresi oleh
sel A. tumefaciens sisa. Gen reporter gusA adalah kloning dalam format
modular baru. Ini plasmid cocok untuk penyisipan gen lain yang
menarik yang mengandung promotor mereka sendiri dan terminator.
Peneliti dapat cukai gen gusA dan masukkan gen mereka sendiri bunga
di tempatnya atau menggunakan vektor ini untuk membuat fusi dari
gusA dengan gen minat mereka (jika Anda telah membuat sebuah
pCAMBIA derivatif vektor bahwa peneliti lain akan menemukan
berguna dan ingin berbagi, silahkan beritahu kami tahu). Vektor ini
berisi pUC18 polylinker-lacZa dan seleksi bakteri dan tanaman yang
sama gen sebagai sesuai Minimal Vektor Pemilihan mereka(Tsen,2002).

IV. PROSEDUR
Dalam percobaan ini strain E.coli Top 10 yang dikulturkan semalaman
ke media LB cair 25 ml dengan cara memindahkan satu koloni strain
E.coli Top 10 ke media LB cair. Kemudian diinkubasi di dalam shaker-
incubator dengan kecepatan rotasi 125rpm pada suhu 37C selama 16
jam(semalaman).Setelah itu Hasil inkubasi semalaman dipindahkan ke
media LB cair 25ml, dilakukan dengan cara mengambil 250l kultur
E.coli Top 10 ke dalam media LB cair 25 ml, atau dikatakan
perbandingan anatara volume media dan volume kultur 10:1.Kemudian
kultur tersebut diinkubasi dalam shaker incubator dengan kecepatan
rotasi 125 rpm selama 120 menit yaitu selama 2 jam pada suhu 37C.
Setelah sebanyak 1,5 ml kultur diinkubasi selama 2 jam, kultur tersebut
diambil dan dimasukkan ke dalam tadung sentrifuga dan dengan
kecepatan 5.700 x g dilakukan sentrigfigasi selama 5 menit. Setelah
disentrifugasi supernatan yang terhasil dibuang dan ditambahkan 500l
CaCl
2
yang dingin,diresuspensi kemudian disentrifugasi pada kecepatan
5.700 x g selama 5 menit. Supernatan dibuang kembali dan
ditambahkan kembali 200 l CaCl
2
dingin ke dalam tabung, diresuspensi
dan diinkubasi dalam es. Dalam perlakuan ini terdapat lima tabung
mikrosentrifuga, dua diantaranya diinkubasi 2 jam dan 3 lainnya untuk
diinkubasi 16 jam. Tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 2 jam yang
masing-masing berisi 200 l selkompeten, salah satunya atau tabung
nomor 1 ditambah dengan 10 l palsmid pUC19sirkuler, sedangkan
tabung nomor 2 tidak ditambah dengan plasmid. Kedua tabung
diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit, kemudian diberi kejut
panas (heat-shock) selama 90 detik dengan suhu 42C dan segera
dipindahkan ke dalam es dan diinkubasi kembali selama 10 menit.
Tabung mikrosentrifuga ditambahkan media LB hingga 1 ml setelah
diinkubasi 10menit, dilanjutkan dengan inkubasi dalam shaker-
incubator pada suhu 37C dengan kecepatan rotasi 150 rpm selama 1,5
jam. Sebanyak 100 l hasil inkubasi ditumbuhkan dengan cara plating
ke media cawan LB/Amp untuk kedua tabung. Selain itu, sebanyak 50
l hasil inkubasi pada tabung nomor 2 ditumbuhkan juga pada media
LB tanpa ampisilin. Diinkubasiksn selama 16 jam pada suhu 37C.
Sementara itu, ke dalam tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 16 jam
yang masing-masing berisi 200 l sel kompeten, ditambahkan 10 l
vektor pUC19 sirkuler untuk penentuan efisiensi transformasi (tabung
nomor 3), 2 l vektor pUC19 rekombinan(tabung nomor 4) dan tidak
ditambahkan apapun (tabung nomor 5). Ketiga tabung mikrosentrifuga
diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit dan diberi kejut panas
(heat-shock) selama 90 detik pada suhu 42C dan segera dipindahkan ke
es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit. Tabung mikrosentrifuga
selanjutnya ditambahkan dengan media LB hingga 1 ml,dilanjutkan
dengan inkubasi dalam shaker-incubator selama 1,5 jam pada suhu
37C. Disiapkan media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG dengan cara
menambahkan 50 l X-Gal dan 100 l IPTG ke media cawan LB/Amp,
lalu diinkubasi pada suhu 37Cselama lebih kurang 30 menit. Hasil
inkubasi tabung nomor 3 ditumbuhkan dengan cara plating ke media
cawanLB/Amp/X-Gal/IPTG sebanyak 100 l. Tabung nomor 4
disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit.Supernatan
dibuang hingga tersisa 100 l, dan kemudian ditumbuhkan dengan cara
plating ke media LB/Amp/X-Gal/IPTG.Hasil inkubasi pada tabung no.5
ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawanLB/Amp sebanyak
100 l dan ke media cawan LB sebanyak 50 l, dilanjutkan dengan
inkubasi selama 16 jam pada suhu 37C. Dilakukan penjumlahan untuk
cawan yang berisi E. coli dengan pUC19 sirkuler koloni untuk diketahui
efisiensi transformasinya.Efisiensi transformasi dihitung dengan cara
sebagai berikut, Dimana,koloni= jumlah koloni putih (dalam
cfu)[pUC19] = konsentrasi pUC19 (dalam ng).






V. ALAT DAN BAHAN
Alat:

5.1 Beaker glass 20mL

5.2 Bunsen



5.3 Inkubator




5.4 Lemari es





5.5 Mikro pipet



5.6 Mikrosentrifuga







5.7 Pengocok orbital


5.8 Sarung tangan



5.9 Tabung Eppendrof



Bahan
5.1 Aquabides
5.2 Etanol 95%
5.3 GeneJET plasmid minprep kit (fermentas life sciences):
Resuspension solution, Lysis solution, Neutralization solutiom,
Wash solution, RNase A, Elution Buffer (10mM Tris-HCL, pH
8.5), GeneJET Spin Colums dan tabung kolektor 2mL
5.4 Kloramfenikol/ kanamisin 100 g/mL dalam medium LB cair
5.5 Medium lurea bertani (LB) cair (Biogen)
5.6 Plat biakan bakteri E.coli Top 10 berumur 18-24jam
5.7 pCambia 1201
VI. DATA PENGAMATAN
No.
Cawan
Petri
Hasil Pertumbuhan
Hasil Pengamatan
Ada Pertumbuhan Tiada pertumbuhan
1.
Kontrol
(+)


2.
Kontrol (-
)

3.
A
(Ada
pChambia
1201)


4.
B
(Tanpa
pChambia
1201)



VII. PEMBAHASAN
Praktikum bioteknologi ada beberapa tahap yang harus dikerjakan
sebelum kitamendapatkan hasil murni dari isolasi DNA dan isolasi Kromosom.
Pada awal praktikum kita melakukan Transformasi, transformasi disini
bertujuan untuk melakukan transformasi pada sel E. Coli. Transformasi disini
memiliki prinsip diantaranya pembuatan sel kompenten yang dapat disisipi
vektor DNA rekombinan, transformasi E. Coli dengan plasmid rekombinan dan
menyeleksi koloni E.coli yang telah disisipi DNA plasmid rekombinan dengan
menggunakan cawan LB/kloramfenikol/X-Gal/IPTG. Pada praktikum
transformasi genetic ini dilakukan pembuatan sel kompeten E.coli Top 10 dan
transformasi plasmid DNA. Transformasi genetic adalah proses introduksigen
dari satu organism ke organisme lain yang memungkinkan untuk memunculkan
sifat harapan tanpa mengubah sifat lain. Transformasi genetic merupakan salah
satu metode yang dapat dimanfaatkan untuk mempelajari regulasi gen,
identifikasi fungsi gen, pengujian metabolisme, mempelajari fisiologi serta
perkembangan tanaman.
Sebelumnya telah dilakukan pembuatan sel kompeten oleh asisten
sehingga pada praktikum kali ini praktikan tinggal melakukan transformasi
DNA plasmid. Sel Kompeten(Competent Cells, CC, C-Cells) adalah sel
(bakteri atau yeast) yang telah mengalami perubahan dalam hal tingkat
permeabilitasnya. Artinya membrane sel dari bakteri atau yeast tersebut mampu
dilewati oleh plasmid DNA, sehingga DNA yang telah masuk tersebut akan
bertambah dan bertambah seiring pembelahan sel mikroba tersebut. Pembuatan
sel kompeten dimulai dengan mengkultur semalaman strain E.coli Top 10 ke
media LB cair 10 ml dengan cara memindahkan satu koloni stran E.coli Top 10
ke media LB cair. Setelah itu diinkubasi dalam shaker-inductor dengan
kecepatan rotasi 125 rpm dengan suhu 37C selama 16 jam hingga 18
jam.Kultur sel sendiri merupakan metode dimana suatu sel dari suatu jaringan
diambil danditumbuhkan pada kondisi yang terkontrol dan aseptik. Sel yang
digunakan untuk dikultur biasanya diambil dari jaringan eukariot. Sel tersebut
akan tumbuh dan bertambah banyak dalam kondisi in vitro.Setelah dikultur dan
diinkubasi selama 16 jam, kultur dipindahkan ke media LB cair 10 mL dengan
cara mengambil 250 mikro liter E.coli Top 10 ke dalam media LB cair steril 5
mL,lalu diinkubasi kembali dengan shaker incubator dengan kecepatan 125
rpm selama 2 jam pada suhu yang sama. Tahap ini dilakukan agar sel semakin
memperbanyak diri sehingga jumlahnya dibanyak sehingga untuk
mendapatkan sel transforman cukup mudah melalui media tersebut. Kemudian
1,5 ml kultur hasil inkubasi 2 jam dimasukkan dalam tabung eppendorf, Kultur
hasil inkubasi 2 jam ini diperkirakan telah mengalami fase log. Fase log
diperlukan agar jumlah bakteri yang terisolasi untuk pembuatan sel kompeten
optimal. Setelah itu kultur diambil kembali dan untuk selanjutnya dimasukkan
tabung mikrosentrifuga dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5700 x g
selama 5 menit hal ini dilakukan untuk memisahkan bakteri dengan medium
pertumbuhannya.Supernatan yang dihasilkan dibuang dan kedalam tabung
ditambahkan 100 mikro liter CaCl
2
dingin. DNA plasmid merupakan wadah
yang digunakan untuk mengcloning gen.
Proses transformasi bakteri diawali denga pembuatan sel kompeten.
Pencampuran sel kompeten dan DNA insert diinkubasi bersama dengan larutan
kalsium klorida (CaCl2) yang terdapat pada TFB, fungsi larutan ini adalah
megganggu keseimbangan kalsium dalam membran sehingga membran berhasil
terbuka dan DNA insert dapat masuk. Cara kerja larutan ini adalah membantu
terbukanya protein integral sebagai kanal ion. Proses selanjutnya yaitu
dikejutpanaskan (heat shock) pada suhu 42C selama 45 detik dengan maksud
membran sel akan tertutup kembali karena terjadi perubahan suhu yang
mendadak dari suhu rendah ke suhu tinggi. Proses pengerjaan transformasi
dapat dilakukan di dalam laminar ataupun di luar laminar. Perbedaannya hanya
pada kesterilan kerja dan resiko kontaminasi pada pekerjaan di luar laminar.
Supernatan tersebut mengandung DNA plasmid sehingga harus
dipisahkan dari DNA kromosom. DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh
lebih kecil daripada DNA kromosom sedangkan fungsi penambahan CaCl
2

sendiri akan mempengaruhi dinding sel dan mungkin berperan dalam
pengikatan DNA pada permukaan sel. Literatur yang sama menyebutkan bahwa
penyerapan DNA secara nyata sebenarnya dipengaruhi oleh perlakuan kejut
panas(Utomo,2005).Setelah dilakukan penambahan CaCl
2
dingin, kemudian
diresuspensi dandisentrifugasi lagi dengan kecepatan yang sama dan waktu
yang sama seperti sebelumnyaSupernatan dibuang kembali ditambahkan lagi
CaCl
2
dingin di resuspensi lagi danselanjutnya diinkubasi dalam es.
Sentrifugasi dilakukan berulang ulang bermaksud agar DNA plasmid benar
benar sudah tidak bercampur lagi dengan DNA kromosom. Sedangkan
penginkubasian dalam es bertujuan untuk membuat suhu di dalam media
menjadi ekstrem halini akan berpengaruh dengan tahap selanjutnya yaitu heat
shock. Sel E.coli yang kompeten diberi perlakuan kejut panas untuk
membuka pori pada dinding sel bakteri.Inkubasi dengan plasmid akan
menyebabkan masuknya plasmid kedalam sel. Penambahan media LB setelah
perlakuan kejut panas berfungsi untuk memenuhi kebutuhan nutrisi dari bakteri
setelah mengalami perlakuan yang ekstrem.Untuk mengetahui sel yang telah
mengalami transformasi maka dilakukan seleksi transforman dengan
memanfaatkan sifat yang dibawa sebagai markaseleksi. Bakteri ditumbuhkan
pada medium yang mengandung kloramfenikol.
Dengan adanya kloramfenikol,maka sel E. coli yang dapat tumbuh
hanya sel transforman atau sel yang telah memasukkan plasmid. Inkubasi
selama 18 jam akan menumbuhkan koloni bakteri yang berasal dari sel tunggal.
Semua bakteri yang tumbuh dalam koloni tersebut akan memiliki sifat yang
sama sebagai bakteri transforman.Tabung mikro sentrifuga hasil inkubasi 2jam
yang masing-masing berisi 50l sel kompeten, salah satunya atau tabung nomor
A ditambah dengan 5l plasmid p CAMBIA 1201, sedangkan tabung nomor B
tidak ditambah dengan p CAMBIA. Kedua tabung diinkubasi lebih lanjut dalam
es selama 20 menit, kemudian diberi kejut panas (heat-shock)selama 90 detik
dengan suhu 42 c dan segera dipindah kan kedalam es untuk diinkubasi kembali
selama 20 menit. Tabung mikro sentrifuga ditambahkan media LB hingga 1 ml
setelah inkubasi 10menit, dilanjutkan dengan inkubasi 10 menit, dilanjutkan
dengan inkubasi dalam shaker-incubator pada suhu 37
o
c dengan kecepatan
rotasi 150 rpm selama 1,5 jam. Sebanyak 100 l hasil diinkubasi ditumbuhkan
dengan cara plating ke media cawan LB/Kloramfenikol untuk kedua tabung.
Selain itu, sebanyak 50 l hasil inkubasi pada tabung nomor B ditumbuhkan
juga pada media LB kloramfenikol . Selain itu dilakukan kontrol positif dan
kontrol negative. Kontrol positif digores dengan E.Coli manakala kontrol
negative hanya mengandungi LB agar Inkubasi dilakukan selama 18jam /over
night pada 37
o
C.

pCAMBIA adalah sesuatu vektor yang digunakan dalam bidang
bioteknologi. pCAMBIA yang digunakan adalah pCAMBIA 1201. Ciri ciri
pCAMBIA adalah :
asal copy rendah-replikasi menghasilkan rendah preps DNA hasil;
replikan tidak stabil, menyebabkan hilangnya variabel plasmid selama
propagasi;
saiz gedik
kurangnya situs restriksi nyaman untuk manipulasi
terbatas pilihan untuk kedua bakteri dan tanaman
kurangnya cara sederhana untuk membangun fusi gen pelapor

pCAMBIA digunakan dalam praktikum ini karena pCAMBIA mempunyai
kemampuan memproduksi nomor tinggi dalam E.coli untuk hasil DNA tinggi.
Ciri lain vektor ini adalah
pVS1 replicon untuk stabilitas tinggi dalam Agrobacterium
size kecil, 7-12kb plasmid yang sesuai
situs restriksi dirancang untuk modifikasi plasmid modular dan kecil
tapi memadai poli-linker untuk memperkenalkan DNA Anda minati
pemilihan bakteri untuk chloramphenicol or kanamycin
seleksi tanaman dengan higromisin B atau kanamisin (seleksi
fosfinotrisin dihentikan atas permintaan pemilik IP, Bayer, setelah
distribusi awal tahun 1997)
cara sederhana untuk membangun fusi translasi gen reporter gusA
Perbedaan pCAMBIA 1201 dan pCAMBIA 2201 adalah:
pCAMBIA R-
gene
plants
R-gene
bacteria
Polylinker Reporter
gene
T-DNA
size(BP)
Lac-
Z
Vector
family
2201 nptII cmr pUC18 gusA 5391 - GIS
1201 hptII cmr pUC18 gusA 5606 - GIS

Perbedaan antara kedua vector tersebut adalah size. Gus A merupakan reporter
gene untuk kedua-dua vektor tersebut. Fungsi kedua vektor adalah untuk
meningkatkan produksi E.coli . Basa pasang kedua vektor berbeda. pCAMBIA
2201 dan pCAMBIA 1201 terdiri dari Gus intro selection vectors pCAMBIA.

Gambar 2: Struktur pCAMBIA


Dari hasil pengamatan menunjukkan bahwa cawan petri yang dibuat
kontrol positif yang telah digores dengan E.Coli terdapat pertumbuhan
manakala kontrol negatif yang hanya mengandungi LB agar tidak terdapat
pertumbuhan mikroorganisme. Manakala cawan petri A yang mengandungi
pCAMBIA dan diletakkan antibiotik kloramfenikol didapati tidak ada
pertumbuhan.Cawan petri B yang tanpa pCambia tapi tapi mengandungi
kloramfenikol juga tidak mengandungi pertumbuhan mikroorganisme.
Dari hasil yang didapati , sepatutnya cawan petri A akan terdapat
pertumbuhan koloni ini kerana hal ini dikarenakan bahwa E.coli tersebut
mengandung gen resisten kloramfenikol yang di transformasi dari pCAMBIA
yang mengandung gen resisten kloramfenikol. Kesalahan yang mungkin
dilakukan oleh kami yang memungkinkan mempengaruhi result adalah,
dimungkinkan kloramfenikol telah rusak karena kepanasan, atau mungkin
disebabkan karena dalam berkerja kurang aseptis atau kurang steril.
Bakteri ditumbuhkan pada medium yang mengandung kloramfenikol.
Dengan adanya kloramfenikol, maka sel E. coli yang dapat tumbuh hanya sel
transforman atau sel yang telah memasukkan plasmid. Inkubasi selama 18 jam
akan menumbuhkan koloni bakteri yang berasal dari sel tunggal. Semua bakteri
yang tumbuh dalam koloni tersebut akan memiliki sifat yang sama sebagai
bakteri transforman.
VIII. KESIMPULAN
Dari hasil percobaan kali ini cawan petri yang dibuat kontrol positif
yang telah digores dengan E.Coli terdapat pertumbuhan manakala kontrol
negatif yang hanya mengandungi LB agar tidak terdapat pertumbuhan
mikroorganisme. Manakala cawan petri A yang mengandungi pCAMBIA dan
diletakkan antibiotik kloramfenikol didapati tidak ada pertumbuhan. Cawan
petri B yang tanpa pCambia tapi tapi mengandungi kloramfenikol juga tidak
mengandungi pertumbuhan mikroorganisme. Daripada percobaan ini
sepatutnya cawan petri A akan terdapat pertumbuhan koloni ini kerana hal ini
dikarenakan bahwa E.coli tersebut mengandung gen resisten kloramfenikol
yang di transformasi dari pCAMBIA yang mengandung gen resisten
kloramfenikol. Kesalahan yang mungkin dilakukan oleh kami yang
memungkinkan mempengaruhi result dimungkinkan kloramfenikol telah rusak
karena kepanasan, atau mungkin disebabkan karena dalam berkerja kurang
aseptis atau kurang steril.
IX. LAMPIRAN

DAFTAR PUSTAKA
Brown, T.A. 1991. Pengantar cloning Gena. Yayasan Essentia Medica.
Yogyakarta.
Pelczar, M.J. dan E.C.S. Chan, 1986. Dasar _ Dasar Mikrobiologi Jilid I.
Universitas Indonesia. Jakarta.
Tsen et al. 2002. Natural plasmid transformation in Escherichia coli. Journal of
Biomedical Science 9:246-252.
Wibowo.2002. Tranformasi Fragmen Dna Kromosom Xanthomonas
Campestris Ke Dalam Escherichia Coli. MAKARA, SAINS, VOL. 6,
NO. 1

Anda mungkin juga menyukai