Combined sub-optimal doses of rosuvastatin and bexarotene impair

angiotensin II-induced arterial mononuclear cell adhesion through

inhibition of Nox5 signaling pathways and increased RXR/PPAR and
RXR/PPAR interactions.
Dikombinasikan dosis sub-optimal adhesi sel mononuklear arteri rosuvastatin dan
Bexaroterie Merusak angiotensin II-diinduksi melalui penghambatan Nox5 jalur
sinyal dan peningkatan RXR / PPAR dan interaksi RXR / PPAR

tUJUAN:
Mononuklear sel (MC) infiltrasi ke dalam subendothelium arteri adalah
peristiwa penting dalam aterogenesis. Rosuvastatin (Rosu) dan Bexaroterie
(Bex) mengerahkan aktivitas anti-inflamasi, tetapi efek samping yang serius
yang berhubungan dengan dosis telah muncul. Kebutuhan strategi yang
lebih aman dan efektif untuk mencegah dan mengobati aterosklerosis
menyebabkan kita untuk menguji pengaruh penggunaan kombinasi kedua
obat pada angiotensin II (Ang-II) imbas arteri MC perekrutan.
HASIL:
Kendaraan, Rosu (10-30 nM), Bex (0,3-1 M), atau kombinasi keduanya
diberikan untuk sel manusia pusar arteri endotel (HUAECs) 20 jam sebelum
stimulasi dengan 1 pM Ang-II (4 jam). Anehnya, kombinasi Rosu (10 nM) +
Bex (0,3 M), yang tidak mempengaruhi Ang-II-induced MC perekrutan ketika
salah stimulus dipelajari sendiri, secara signifikan mengurangi respon ini.
Efek ini didampingi oleh berkurang Ang-II-induced ICAM-1, VCAM-1, dan
CX3CL1 endotel berekspresi dan CXCL1, CXCL8, CCL2, dan CCL5 produksi.
Preincubation dari HUAECs dengan Rosu + Bex menghambat ekspresi Nox5
dan Nox5-diinduksi aktivasi RhoA dirangsang oleh Ang-II melalui peningkatan

ekspresi RXR, PPAR, dan PPAR selain RXR / PPAR dan interaksi RXR /
PPAR. In vivo, dikombinasikan tapi tidak tunggal administrasi Rosu (1,25 mg /
kg / hari) dan Bex (10 mg / kg / hari) secara signifikan berkurang Ang-IIinduced adhesi arteriol leukosit dalam sirkulasi mikro cremasteric dari C57BL
/ 6 tikus dan lesi aterosklerotik formasi dalam apoE (- / -) tikus dikenakan diet
aterogenik.

INOVASI DAN KESIMPULAN:

administrasi gabungan dari Bex + Rosu pada dosis suboptimal mungkin merupakan
alternatif baru dan terapi yang efektif dalam mengendalikan peradangan pembuluh
darah yang terkait dengan gangguan kardiometabolik, karena mereka bersinergi
dalam tindakan anti-inflamasi dan dapat melawan efek samping terkait.

Pengantar saya ncreasedlevelsof beredar mediator, termasuk angiotensin II (Ang-II) dan sitokin,
telah terdeteksi pada penyakit kardiovaskular dan kardiometabolik seperti hidrokarbon
pertension, obesitas, dan diabetes, dan dapat mengerahkan merusak
Efek fungsi onendothelial (18,34). Ini agentsinitiatean inflamasi sinyal kaskade yang terkait
dengan oxy- reaktif spesies gen (ROS) generasi, peningkatan permukaan sel expression sion
molekul adhesi sel (CAMS), dan ditingkatkan leukosit kelengketan ke sel endotel (18, 31).
Ini tanggapan berhubungan dengan disfungsi endotel, dan negara pro-trombotik dan proinflamasi endothelium (28) contributestotheearlystagesofatherogenesis (14,28,31).
Inovasi
Temuan ini menyoroti menjanjikan baru dan lebih aman Pendekatan terapi dalam pengelolaan divascular flammation yang mendahului atau menyertai paling kardiomiopati gangguan vaskular
menggunakan dua obat yang tersedia secara klinis.
Efek anti-inflamasi sinergis adalah quences quence peningkatan RXR Sebuah, PPAR Sebuah ,
Dan PPARc expression sion serta dari RXR Sebuah / PPAR Sebuah dan RXR Sebuah / PPARc
interaksi, yang mengarah ke penghambatan Nox5-dimediasi jalur sinyal. Selain itu, re- baru

terapi ini Rezim menghasilkan efek samping obat-terkait minimal sejak dosis rendah kedua obat
yang digunakan, dan rosuvastatin ad- pertolongan dapat menguntungkan menangkal dislipidemik
yang negara terkait dengan pengobatan kronis dengan Bexarotene Ang-II terlibat dalam
atherogenesis (9), dan kami mendemonstrasikan strated bahwa 4 jam paparan Ang-II in vivo
disebabkan arteriol leukosit adhesi dalam mikrosirkulasi mesenterika tikus
(2). Khususnya, mononuklear leukosit perekrutan oleh Ang-II ditemukan dimediasi terutama
oleh tumor necrosis factor-a (TNFa) dan selanjutnya peningkatan ekspresi endotel fractalkine
(CX3 CL1) (37, 54). Akibatnya, farmakologi modulasi infiltrasi sel inflamasi dari ruang thelial
subendo- dapat menghambat proses aterogenik yang terkait dengan faktor risiko kardiovaskular
yang berbeda terkait dengan sistem angiotensin rennin-. Statin adalah kelompok 3-hydroxy-3methylglutaryl coen-zyme A reduktase yang terutama digunakan karena sifat penurun lipid
mereka karena kapasitas mereka untuk memblokir biosintesis kolesterol (1). Setelah itu,
kemampuan mereka untuk mengurangi mortalitas kardiovaskular dan stroke ditemukan untuk
melampaui atribut penurun lipid mereka. Memang, ketika rosuvastatin (Rosu) diberikan kepada
subyek sehat tanpa hiperlipidemia namun dengan sensitivitas tinggi C-reaktif tingkat protein
yang tinggi, kejadian kejadian kardiovaskular utama adalah kembali yang diinduksi (52). Ini
disebut efek pleiotropic statin di- modulasi clude reaksi inflamasi dan anti-oksidan, yang
tambahan mungkin memainkan peran penting dalam perlindungan kardiovaskular statindimediasi (38). Dengan demikian, ada bukti yang menunjukkan bahwa statin menguntungkan
mempengaruhi fungsi sel endotel (38) dan merusak perdagangan leukosit pada lokasi inflamasi
(59). Selain itu, semakin banyak data eksperimen menunjukkan interaksi potensial antara kaleng
station dan proliferator-diaktifkan reseptor Peroksisom (PPARs) (3, 6), dan aktivasi PPARs dapat
downregulate yang ekspresinya dari CAMS, gen proinflamasi, dan leukocyte- interaksi sel
endotel (40). Meskipun statin pada umumnya ditoleransi dengan baik, miopati dan akut peristiwa
ginjal telah
keprihatinan yang signifikan dengan penggunaan obat statin-potensi tinggi, di simvastatin
tertentu dan Rosu (8, 15, 23). Karena ini efek samping yang sering dosis terkait (8, 15, 23),
masih ada kebutuhan yang jelas untuk mengidentifikasi agen itu, bila dikombinasikan
dengan statin, dapat memberikan manfaat terbesar pada penyakit kardiovaskular dengan risiko
minimal menambahkan. Bexaroterie (Bex) adalah retinoid X reseptor (RXR) agonis -selective
saat ini digunakan dalam pengobatan limfoma sel T kulit. Kami sebelumnya telah menunjukkan

bahwa Bex dapat menghambat perlekatan leukosit mononuklear ke arteri dirangsang en-dothelial
sel melalui downregulation dari jalur redoks-sensitif dan melalui RXR / PPAR c interaksi (12,
55). Memang,
Ang-II terlibat dalam atherogenesis (9), dan kami mendemonstrasikan
strated bahwa 4 jam paparan Ang-II in vivo disebabkan arteriol leukosit adhesi dalam
mikrosirkulasi mesenterika tikus (2). Khususnya, mononuklear leukosit perekrutan oleh Ang-II
ditemukan dimediasi terutama oleh tumor necrosis factor Sebuah (TNFa) Dan selanjutnya
peningkatan ekspresi endotel fractalkine (CX3CL1) (37, 54).
Akibatnya, farmakologi modulasi infiltrasi sel inflamasi dari subendo- yang ruang thelial dapat
menghambat proses aterogenik terkait dengan faktor risiko kardiovaskular yang berbeda terkait
dengan rennin- yang sistem angiotensin. Statin adalah kelompok 3-hydroxy-3-methylglutaryl
coen-zyme A reduktase yang terutama digunakan karena sifat penurun lipid mereka karena
kapasitas mereka untuk memblokir biosintesis kolesterol (1). Setelah itu, kemampuan mereka
untuk mengurangi mortalitas kardiovaskular dan stroke ditemukan untuk melampaui mereka
penurun lipid atribut. Memang, ketika rosuvastatin (Rosu) diberikan kepada subyek sehat tanpa
hiper lipidemia tetapi dengan sensitivitas tinggi protein C-reactive tingkat, kejadian kejadian
kardiovaskular utama adalah kembali yang diinduksi (52). Ini disebut efek pleiotropic statin di
clude modulasi reaksi inflamasi dan anti-oksidan properti, yang tambahan mungkin memainkan
peran penting dalam perlindungan kardiovaskular statin-dimediasi (38). Demikian,
ada bukti yang menunjukkan bahwa statin menguntungkan mempengaruhi fungsi endotel sel
(38) dan merusak perdagangan leukosit pada lokasi inflamasi (59). Selain itu, semakin banyak.
Data eksperimental menunjukkan interaksi potensial antara station kaleng dan proliferator
diaktifkan reseptor Peroksisom (PPARs) (3, 6), dan aktivasi PPARs dapat downregulate mantan
yang pression dari CAMS, gen proinflamasi, dan leukocyte- interaksi sel endotel (40). Meskipun
statin pada umumnya ditoleransi dengan baik, miopati dan akut peristiwa ginjal telah
keprihatinan yang signifikan dengan penggunaan obat statin-potensi tinggi, efek samping sering
dosis terkait (8, 15, 23), ada dengan statin, dapat memberikan manfaat terbesar pada
kardiovaskular penyakit dengan resiko minimal menambahkan.n Bexaroterie (Bex) adalah
reseptor retinoid X (RXR) selective agonis saat ini digunakan dalam pengobatan sel T kulit
limfoma. Kami sebelumnya telah menunjukkan bahwa Bex dapat menghambat mononuklear

leukosit lampiran dirangsang en- arteri sel dothelial melalui downregulation dari redoks-sensitif
jalur da melalui RXR / PPARc interaksi (12, 55). Memang, mapan bahwa PPARs membentuk
permisif RXR heterodimer yang sinergis menanggapi agonis dari RXR dan reseptor mitra (49).
Sayangnya, pengobatan Bex adalah diasosiasikan- diciptakan dengan efek samping yang tidak
dapat dihindari dan dosis yang membatasi, di par-hipertrigliseridemia TERTENTU,
hiperkolesterolemia, dan, dengan tingkat lebih rendah, hipotiroidisme (7, 61). Namun, Rosu
admin-Administration dapat menurunkan kadar trigliserida (13) dan Inggris. Pernyataan
konsensus tentang resep klinis aman dari Bex mendasi ommend penggunaan statin ini untuk
mencegah dislipidemia yang efek yang berkaitan dengan administrasi agonis RXR (57).
Dalam upaya untuk mengidentifikasi strategi yang lebih efektif untuk mengobati dan mencegah
aterosklerosis, penyakit jantung koroner, dan co- gangguan metabolisme morbid ditandai dengan
disfungsi endotel fungsi, kami telah mengevaluasi efek pengobatan gabungan dengan Rosu dan
Bex. Dalam studi ini, kami menyediakan baikn in vitro dan bukti vivo bahwa kombinasi Rosu +
Bex di sub konsentrasi optimal / dosis memprovokasi gangguan yang jelas dalam Ang-II-induced
sel mononuklear adhesi (MC) pada endotel rial arte-. Mekanisme yang mendasari yang terlibat
dalam sinergisme menguntungkan ini juga dieksplorasi. Kami menemukan bahwa Nox5
downregulation dan selanjutnya RhoA inaktivasi yang di-terlibat pada tanggapan ini.
Selanjutnya, peningkatan RXR / PPARa dan RXR / PPARc interaksi yang, sebagian, jawab ble
untuk mengamati aktivitas anti-inflamasi. Hasil Kombinasi Rosu dan Bex di suboptimal
konsentrasi mengurangi Ang-II-induced manusia umbilikalis sel endotel arteri adhesi MC
Awalnya, kami mengevaluasi efek dari tantangan Ang-II di mononuklear leukosit-endotel
interaksi sel in vitro menggunakan dynamic assay ruang aliran. Dengan demikian, baru diisolasi
MC manusia perfusi di sel endotel arteri umbilikalis manusia (HUAEC) monolayers dirangsang
atau tidak dengan Ang-II (1 lm) selama 4 jam. Ang-II menyebabkan peningkatan yang signifikan
dalam adhesi leukosit mononuklear arteri sel endotel (Gbr. 1). Untuk menilai efek Rosu pada
Ang-II-induced perekrutan MC, HUAECs diobati sebelumnya dengan statin di dua
konsentrasi yang berbeda (10 dan 30 nM), 20 jam sebelum stimulasi Ang-II. Sementara 10 n M
Rosu tidak berdampak terhadap Ang-II- diinduksi perekrutan MC, preincubation dengan 30 n
MRosu secara signifikan mengurangi Ang-II-induced adhesi mononuklear leukosit (Gbr. 1A).
Pendekatan serupa diikuti untuk menguji pengaruh Bex preincubation tanggapan Ang-IIdiinduksi, berdasarkan pengamatan sebelumnya (55). Sebagai antisipasi, 1

LM tapi tidak 0,3 LM Bex secara signifikan menghambat MC adhesi HUAECs Ang- IIdirangsang (Gambar. 1B). Untuk mengevaluasi sinergisme potensi kedua obat, kombinasi yang
berbeda dari Rosu dan Bex dinilai. Semua kombinasi diuji secara signifikan terganggu Ang-IIinduced lampiran MC ke arteri en-dothelium (Gambar. 1C). Tanpa diduga, kombinasi Rosu di 10
nM dan Bex sebesar 0,3 lm, yang ditampilkan tidak berpengaruh signifikan ketika salah
perlakuan diuji saja, dikurangi hesion ad- oleh 51% (Gambar. 1C). Akibatnya, dalam semua in
vitro percobaan berikutnya, kombinasi Rosu dan Bex (ditunjuk Rosu + Bex) dipekerjakan untuk
mengeksplorasi theun- mekanisme derlying terlibat dalam respon ini. Selain itu, karena ada bukti
yang mendukung bahwa Ang-II dapat menurunkan ekspresi reseptor AT1, meskipun dalam selsel otot polos pembuluh darah (44), kami mengevaluasi kemungkinan ini. Seperti diilustrasikan
dalam Tambahan Gambar S1 (Data Tambahan ARA. 1. Kombinasi Rosuvastatin
(Rosu) dan Bexarotene (Bex) pada konsentrasi subopti-mal mengurangi angiotensinII (Ang-II)
-diinduksi manusia sel arteryendothelial pusar (HUAEC) adhesi sel mononuklear di bawah
flow.HUAECs fisiologis dirangsang dengan Ang-II (1 lm) selama 4 jam . Dalam beberapa
percobaan, cellswere pra-perawatan dengan Rosu (10-30 nM) (A), Bex (0.3-1lM) (B), atau
kombinasi dari kedua (C), 20 jam sebelum stimulasi Ang-II. Freshlyisolated sel mononuklear
manusia (106cells / ml) perfusi seluruh lapisan tunggal endotel selama 5 menit pada 0.5dyn / cm
2, adhesi andleukocyte dikuantifikasi. Resultsare mean-SEM dari = percobaan independen; ** P
<0,01 relatif terhadap ve-hicle kelompok, ++ p <0,01 relatif terhadap sel Ang-II-dirangsang.
kami menemukan bahwa baik stimulasi Ang-II selama 4 jam atau
pretreatment
sel endotel dengan obat, dalam kombinasi atau sendirian, terpengaruh AT
1 ekspresi reseptor. Penurunan ekspresi ICAM-1 dan VCAM-1 terlibat dalam
mengurangi Ang-II-induced HUAEC-MC yang adhesi yang disebabkan oleh
konsentrasi suboptimal
dari Rosu + Bex Untuk menyelidiki apakah efek penghambatan yang diberikan oleh
Rosu + Bex pada ng II-induced mononuklear leukosit ad- hesion yang dimediasi
melalui modulasi endotel ekspresi CAM, adhesi antar molekul-1 (ICAM- 1) dan
adhesi sel vaskular molekul-1 (VCAM-1) protein Ekspresi ditentukan dengan
sitometri dan immu- nocytochemistry. Stimulasi dengan Ang-II mengakibatkan sigsebuah upregulation nifikan ekspresi ICAM-1 dan VCAM-1 bila dibandingkan dengan
HUAECs kontrol tidak distimulasi, sebagai diukur oleh kedua cytometry aliran dan

immunofluorscence (Gambar. 2A, B). Pretreatment sel dengan Rosu atau Bex tidak
memodifikasi peningkatan ekspresi endotel CAM induksi oleh peptida (Gambar. 2A,
B). Sebaliknya, preincubation dari HUAEC dengan Rosu + Bex mengakibatkan
penurunan yang signifikan dalam Ang-II-induced ICAM-1 dan VCAM-1, dengan 42%
dan 66%, masing masing (Gambar. 2A, B). Penghambatan Ang-II-induced HUAEC
kemokin sintesis oleh kombinasi Rosu + Bex di suboptimal konsentrasi Sejak
stimulasi Ang-II sel endotel dapat menginduksi produksi dan pelepasan CXC
berbeda dan CC che- mokines, selain ekspresi pada membran yang terikat kemokin
fractalkine (36, 42, 54), kita selanjutnya dievaluasi efek Rosu + Bex pada Ang-IIinduced kemokin sindrom tesis dalam sel endotel arteri manusia. di- signifikan
lipatan di tingkat pertumbuhan-diatur oncogene- Sebuah (GRO Sebuah atau CXCL1),
interleukin-8 (IL-8 atau CXCL8), monosit che- motactic protein-1 (MCP-1 atau CCL2),
dan diatur pada ac- tivation, sel T yang normal diekspresikan dan disekresikan
(RANTES atau CCL5) terdeteksi di supernatan dari HUAEC dikenakan stimulasi Ang-II
selama 4 jam, yang diukur dengan enzyme-linked immunoassay (ELISA) (Gambar.
3A-D). Peningkatan ini tidak terhambat ketika HUAECs yang dipreinkubasi dengan
salah satu dari obat saja, tapi nyata berkurang leh pretreatment sel dengan
kombinasi Rosu + Bex (Gambar. 3A-D). Si- milarly, ketika HUAECs dirangsang
dengan 1 l M Ang-II selama 24 jam, peningkatan yang signifikan dalam ekspresi
fractalkine diamati, oleh aliran cytometry dan imunofluoresens cence (Gambar. 3E,
F). Sekali lagi, preincubation sel dengan Rosu + Bex menyebabkan downregulation
signifikan dari sel- yang kemokin membran ekspresi (Gambar. 3E, F). Kombinasi
Rosu + Bex di suboptimal konsentrasi menghambat Ang-II-induced HUAEC RhoA
aktivasi dan perekrutan MC berikutnya Hal ini juga diakui bahwa protein GTPbinding kecil (G- protein), seperti Ras, Rho, dan Rac, diaktifkan oleh Ang-II melalui
interaksi dengan AT nya 1 reseptor (22). untuk-sifat terize mekanisme sinyal dimana
Rosu + Bex mod- ulate arteri MC adhesi dirangsang oleh Ang-II, pertama kita
didirikan efeknya pada Ang-II-induced aktivasi RhoA. Seperti diilustrasikan dalam
Gambar 4A, stimulasi Ang-II dari HUAEC untuk ARA. 1. Kombinasi Rosuvastatin
(Rosu) dan Bexarotene (Bex) di subopti- konsentrasi mal mengurangi angiotensin II
(Ang-II) -diinduksi arteri umbilikalis manusia sel endotel (HUAEC) mononuclear
adhesi sel di bawah aliran fisiologis. HUAECs dirangsang dengan Ang-II (1 l M )
Selama 4 jam. Dalam beberapa percobaan, sel diobati sebelumnya dengan Rosu
(10-30 n M ) (SEBUAH) . Bex (0,3-1 l M ) (B), atau kombinasi dari kedua (C) , 20 jam

sebelum stimulasi Ang-II. Baru saja terisolasi sel mononuklear manusia (10 6sel /
ml) perfusi di endotel yang monolayers selama 5 menit pada 0,5 dyn / cm 2 , dan
adhesi leukosit dikuantifikasi. Hasil adalah mean - SEM dari n = 5 independen
eksperimen; ** p < 0.01 relatif ve- yang Kelompok hicle, ++ p < 0.01 relatif
terhadap Ang- II-dirangsang sel.ROSU 1 BEX mengganggu ANG-II-induced leukosit
ADHESI 90
1 jam menyebabkan peningkatan yang signifikan dalam aktivasi RhoA. Sedangkan
pretreatment sel dengan Rosu atau Bex 20 jam sebelum Ang-II stimulasi gagal
memodifikasi aktivasi RhoA, preincubation dengan kombinasi Rosu + Bex
menyebabkan inhi- signifikan bition respon ini (Gambar. 4A). Untuk mengevaluasi
dampak dari aktivasi RhoA pada Ang-II-induced perekrutan MC, kami Si- lenced
RhoA kspresi dalam sel endotel dengan di- kecil terfering RNA (siRNA). Empat puluh
delapan jam setelah transfeksi dengan RhoA-spesifik siRNA, HUAEC dipamerkan >
69% pengurangan protein RhoA dibandingkan dengan kontrol siRNA- sel
diperlakukan (Gambar. 4B). stimulasi Ang-II (1 l M, 4 h) pro- diproduksi peningkatan
yang signifikan dalam MC penangkapan di kontrol siRNA sel, yang dibatalkan di
RhoA-dibungkam HUAECs (Gbr. 4C). Selanjutnya, penghambatan target hilir RhoA,
Rho-terkait protein kinase (ROCK), mengakibatkan signif- sebuah penurunan icant di
Ang-II-induced mononuklear arteri leukosit adhesi (Tambahan Gambar. S2).
Kombinasi Rosu + Bex di suboptimal konsentrasi menghambat Nox5 Ang-II-induced
ekspresi di HUAECs Produksi ROS dan aktivasi berikutnya redox- jalur sinyal
sensitive menengahi banyak inflamasi yang tanggapan matory disebabkan oleh Ang
II (29, 30). Demikian, stimulasi endotel Ang-II diaktifkan NADPH oksidase di HUAECs
(Gambar. 5A). Khususnya, aktivasi ini berkurang oleh pretreatment sel dengan Rosu
+ Bex, tetapi tidak ketika menggunakan obat digunakan secara terpisah (Gambar.
5A). Ang-II menyebabkan peningkatan en- ekspresi dothelial dari Nox2, NOX4, dan
Nox5 (54) dan Gambar 5B-D. Menariknya, sementara ekspresi Nox ini iso- bentuk
diinduksi oleh Ang-II tidak terpengaruh oleh Rosu atau Bex pretreatment sel, Nox2
dan Nox5 tapi tidak NOX4 mantan
pression adalah nyata berkurang preincubation dengan Rosu + Bex (Gambar. 5B-D).
Sejak MC penangkapan ditemukan sebagian besar dimediasi melalui endotel Nox5
ekspresi (54) dan ROS dapat mengaktifkan RhoA (43), kita selanjutnya
mempertanyakan apakah tidak adanya endotel Nox5 atau antioksidan pra
pengobatan mengakibatkan kegagalan untuk mengaktifkan GTP-binding ini

protein.To doThis, weused baik siRNA menargetkan Nox5and yang apocynin

antioksidan. ekspresi protein Nox5 adalah signifikan cantly berkurang (62%) setelah
48 jam inkubasi dengan spesifik siRNA (Tambahan Gambar. S3 dan S4). Selanjutnya,
knockdown dari Nox5 atau apocynin pretreatment mengakibatkan blokade
Ang-II-induced aktivasi RhoA (Gambar. 5E, F). Sebaliknya, di RhoA-dibungkam
HUAECs, atau di HUAECs pra-perawatan dengan RhoA inhibitor (sel-permeable C3
transferase), peningkatan ekspresi protein Nox5 dipicu oleh Ang-II tetap unberubah (Gambar. 5G, H).
Selain itu, endo sementara Ang-II-induced thelial ROS generasi dinetralkan oleh
preincubation dengan apocynin, itwasunaffectedbypretreatmentofthecellswiththe
RhoA inhibitor (Tambahan Gambar. S5). Konsentrasi suboptimal Rosu + Bex
memprovokasi peningkatan ekspresi RXR endotel Sebuah , PPAR Sebuah . dan PPAR
g Mengingat bahwa statin dan Bex dapat mengaktifkan PPARs dan RXR Sebuah
reseptor nuklir, masing-masing (3, 6, 55), kami meneliti apakah kombinasi Rosu +
Bex diberikan penghambatan Kegiatan melalui perubahan ekspresi endotel RXR
Sebuah , PPAR Sebuah , PPAR b / d , Atau PPAR c . analisis imunoblot menunjukkan
bahwa Ang-II-dirangsang HUAECs, preincubated atau tidak dengan Ros atau Bex
saja, menyatakan tingkat sebanding RXR Sebuah dan PPAR reseptor nuklir untuk
kontrol kendaraan (Gambar. 6A-D). Yang penting, ketika sel-sel diperlakukan dengan
Rosu + Bex untuk ARA. 2. Pengaruh Rosu 1 Bex pada adhesi sel endotel ekspresi
molekul. Sel diperlakukan dengan Rosu (10 n M ), Bex (0,3 l M ), Atau Kombinasi
Rosu (10 n M ) ditambah Bex (0,3 l M ) Selama 20 jam dan kemudian dirangsang
dengan Ang-II (1 l M , 4h) .ICAM-1 (SEBUAH) dan VCAM-1 (B) expression protein sion
ditentukan oleh aliran cytometry dan immunofluo- rescence. panel kanan
menunjukkan gambar wakil dari endo sel thelial. Inti yang-negara terstained dengan
DAPI ( biru ), dan hijau menunjukkan fluoresensi ICAM-1 ( puncak ) OrVCAM-1
( bawah ). Hasil disajikan sebagai rata-rata intensitas fluoresensi (LKM) dan
disajikan sebagai berarti - SEM dari n = 5-9 yang bebas yang percobaan
independen; ** p < 0.01 relatif terhadap kendaraan kelompok, + p< 0,05 relatif
terhadap Ang-II dirangsang sel. 904 ESCUDERO ET AL

ARA. 4. efek hambat Rosu 1Bex pada konsentrasi suboptimal pada Ang-IIdiinduksi aktivasi HUAEC RhoA. HUAEC dirangsang dengan Ang-II (1 lm)
selama 1 jam. Dalam beberapa percobaan, sel diperlakukan dengan Rosu (10 n M),
Bex (0,3 l M), atau kombinasi dari Rosu (10 nM) ditambah Bex (0,3 l M) selama 20
jam sebelum stimulasi Ang-II. Kuantifikasi aktivitas RhoA-GTP ditentukan
menggunakan kolorimetri G-Lisa kit aktivasi RhoA assay (A). Hasil yang rata-rata SEM dari n =
6-9 independen experi-KASIH dan disajikan sebagai persentase control; ** P <0,01 relatif terhadap kelompok kendaraan, + p <0,05 relatif terhadap
Ang-II-dirangsang
sel. Kelompok kedua sel itu trans- fected menggunakan siRNA RhoA-spesifik atau
kontrol siRNA, dan pada 48 jam pasca-transfeksi protein, ekspresi ditentukan
dengan munoblot im(B)
. Kontrol atau RhoA khusus

sel siRNA-transfected dirangsang

dengan Ang-II (1
l
M
) Selama 4 jam. Kemudian, baru
sel mononuklear manusia terisolasi yang
perfusi selama monolayers endotel untuk
5 menit pada 0,5 dyn / cm
2
dan adhesi leukosit
dikuantifikasi
(C)
. Hasil yang mean
SEM dari
n
=
5-6 percobaan independen;
**
p
<
0.01 relatif terhadap kelompok kendaraan,
++
p
<
0.01 relatif terhadap nilai-nilai di Ang-II
kelompok kontrol sel siRNA-transfected

HUAEC transfected dengan Sirnas terhadap RXR

Sebuah
.

PPAR
Sebuah
, Atau PPAR
c
. Menariknya, efek penghambatan
Rosu
+
Bex pada aktivasi RhoA atau Nox5 downregulation di
sel dirangsang dengan Ang-II dihapuskan dalam sel dibungkam
untuk reseptor nuklir tersebut (Gbr. 7).
Kombinasi Rosu
+
Bex di suboptimal
konsentrasi dipulihkan penghambatan oksida nitrat
bioavailabilitas diinduksi oleh Ang-II di HUAECs
Hal ini juga diketahui bahwa Ang-II mengganggu fungsi endotel oleh
penurunan oksida nitrat (NO) bioavailabilitas (32, 43). Ini
efek dapat dimediasi melalui generasi anion superoksida
dan reaksi dengan NO, sehingga pendinginan untuk membentuk
peroxynitrite, dan endotel NO synthase (eNOS) penghambatan
dan uncoupling (32, 43). Oleh karena itu, kami mengevaluasi efek dari
Rosu
+
Bex pada penurunan Ang-II-induced di NO bioavailkemampuan dalam HUAEC. stimulasi Ang-II dari sel berkurang NO
tingkat di HUAECs (Gambar. 8A). Terutama, penurunan ini adalah ulang
berpengalaman dengan pretreatment sel dengan Rosu
+
Bex, tetapi tidak ketika
baik obat digunakan secara terpisah (Gambar. 8A). Pretreatment dari
sel dengan apocynin antioksidan atau inhibitor RhoA (sel
permeabel C3 transferase) terbalik pengurangan NO
ketersediaan diinduksi oleh Ang-II (Gambar. 8B). Demikian pula, membungkam
dari Nox5 mencegah penurunan bioavailabilitas NO pro

voked oleh Ang-II (Gambar. 8C). Lebih penting lagi, dengan tidak adanya
RXR
Sebuah
, PPAR
Sebuah
, orPPAR
c
, Rosu
+
Bex tidak dapat sepenuhnya
mengembalikan endotel NO tingkat (Gambar. 8D-G).
dosis suboptimal Rosu
+
mengganggu Bex
Ang-II-induced adhesi leukosit-arteriol
in vivo
Untuk menghubungkan kami
in vitro
pengamatan dengan apa yang terjadi
in vivo
, Kami menggunakan model kronis infus Ang-II.
Hewan ditanamkan dengan osmotik mini-pompa constantly merilis baik Ang-II (500 ng / kg / min) (56) atau vehicle, selama 14 hari. Konsisten dengan
in vitro
analisis,
hewan kronis diresapi dengan Ang-II menunjukkan signifikan
peningkatan dalam arteriol adhesi leukosit dibandingkan dengan
kendaraan-infused tikus (Gambar. 9A). Co-infus Rosu di
1,25 mg / kg / hari, atau oral Bex pada 10 mg / kg /
hari, tidak mengubah adhesi leukosit arteriol disebabkan oleh
Ang-II infus sistemik (Gambar. 9A). Namun, ketika an- yang
imals yang co-diresapi dengan Ang-II ditambah statin, dan Bex
adalah co-diberikan setiap hari, adhesi leukosit adalah signifikan

cantly dikurangi dengan 65% (Gambar. 9A). Selain itu, Ang-II-induced

ekspresi CD11b di monosit yang beredar juga kembali
diproduksi oleh Rosu
+
administrasi Bex, sedangkan neutrofil
ekspresi CD11b tidak terpengaruh oleh pengobatan (Gambar. 9B,
C). Selain itu, imunohistokimia analisis cremasteric
arteriol menunjukkan bahwa peningkatan ICAM-1 Ang-II-induced,
VCAM-1, dan ekspresi fractalkine itu tumpul oleh copengobatan dengan Rosu
+
Bex pada tikus (Gambar. 9D). Seperti yang diharapkan, sebuah
penurunan yang signifikan dalam tingkat sirkulasi kemokin, dicluding CXCL1 dan MCP-1, dan kecenderungan untuk pengurangan
RANTES, juga diamati pada hewan diperlakukan dengan Rosu
+
Bex dan kronis mengalami Ang-II (Gambar. 9E-G). Didalam

pengaturan eksperimental, kadar glukosa dan profil lipid yang

terpengaruh oleh perlakuan yang berbeda (Tabel Tambahan
S1). Berkenaan dengan tekanan darah, infus Ang-II pada dosis ini
menyebabkan peningkatan kecil tapi signifikan dalam parameter ini di hari
14, yang lebih ditandai ketika peptida diresapi di
1000 ng / kg / menit (Tabel Tambahan S2). Namun, tidak ada
yang diterapkan perawatan mempengaruhi peningkatan tekanan darah
diinduksi oleh Ang-II (Tambahan Tabel S2).
Dalam kelompok tambahan dari eksperimen menggunakan aorta murine
sel endotel, peningkatan Nox2 dan NOX4, tapi tidak ganda
oksidase 1 dan 2 (Duox1 dan Duox2), ekspresi mRNA adalah
terdeteksi dalam sel Ang-II-dirangsang (Tambahan Gambar. S7).
Menariknya, sedangkan ekspresi Nox2 telah rusak oleh sel
pretreatment dengan Rosu

+
Bex, ekspresi NOX4 adalah unaffected oleh perlakuan kombinasi (Tambahan Gambar.
S7). Sesuai dengan hasil dari sel manusia, baik
Obat yang terkena Ang-II-induced Nox2 atau NOX4 ekspresi saat
dievaluasi secara terpisah (Tambahan Gambar. S7).
dosis suboptimal Rosu
+
Bex mengurangi
pengembangan aterosklerosis dan komposisi sel
di apoE
/
tikus pada diet aterogenik
Untuk mengeksplorasi relevansi potensi temuan ini untuk
aterosklerosis, apoE 8-minggu-tua
/
tikus diberi makan tinggi lemak
diet aterogenik selama 8 minggu. Seperti yang diharapkan, hewan dikenakan
untuk diet aterogenik disajikan peningkatan pembentukan lesi dan
infiltrasi makrofag dan sel T dalam lesi (Gbr.
10). Co-infus Rosu di 1.25mg / kg / hari, atau administratif lisan
trasi dari Bex di 10mg / kg / hari, tidak berpengaruh pada-pasien ini
parameter-(Gambar. 10). Khususnya, pengobatan kronis dengan statin
ditambah Bex substansial menurun pembentukan lesi dan sebagai- yang
sociated MC infiltrasi (Gambar. 10). Baik tingkat glukosa maupun
profil lipid pada hewan aterogenik secara signifikan dipengaruhi
dengan perlakuan yang berbeda diterapkan (Tambahan Tabel S3).
Diskusi
terapi kombinasi yang secara bersamaan membahas mulmekanisme berganda yang terlibat dalam patogenesis athero-

sclerosis adalah sebuah konsep yang muncul menarik untuk mencegah

dan / atau memperlambat perkembangan penyakit ini. menggunakan kedua
in vitro
dan
in vivo
pendekatan, kami menyediakan setan-pertama
stration dari efek anti-inflamasi dari con- suboptimal
centrations / dosis dua obat yang tersedia secara komersial, Rosu
dan Bex, dalam kombinasi.
Mononuklear infiltrasi leukosit ke subendothelial yang
ruang adalah acara kunci dalam proses aterogenik (31) dan
pengobatan dengan Rosu atau Bex telah ditunjukkan untuk membatasi MC
angka dalam plak aterosklerotik, atau interaksi mereka dengan
arteri endothelium (27, 55). Dalam penelitian ini, stimulasi
sel endotel arteri dengan Ang-II, meniru yang terganggu a
nasional endotelium, dipromosikan adhesi mononuklear
leukosit, dan acara ini jelas berkurang berbeda
perawatan gabungan Rosu dan Bex. Hebatnya, ini
pengurangan dicapai dengan kombinasi optimal dari
Rosu (10 n
M
) Dan Bex (0,3
l
M
) Karena pada konsentrasi tersebut
tions, baik statin maupun ligan RXR ditampilkan setiap
ARA. 7. Peredam dari endotel RXR
Sebuah
, PPAR
Sebuah
, Atau PPAR
c
tumpul penghambatan Ang-II-induced HUAEC RhoA
aktivasi dan ekspresi Nox5 oleh kombinasi Rosu

+
Bex pada konsentrasi suboptimal.
Sel transfected
dengan kontrol siRNA
(SEBUAH)
, RXR
Sebuah
siRNA -specific
(B)
, PPAR
Sebuah
siRNA -specific
(C),
atau PPAR
c
siRNA -specific
(D)
dan
dirangsang dengan Ang-II (1
l
M
; 1 h) pada 47 jam pasca-transfeksi. Dalam beberapa percobaan, sel-sel praperawatan dengan Rosu (10 n
M
)
ditambah Bex (0,3
l
M
) 20 jam sebelum tantangan Ang-II. Kuantifikasi aktivitas RhoA-GTP ditentukan
dengan menggunakan kolorimetri a
G-Lisa RhoA aktivasi assay. Hasil yang mean
SEM dari
n

=
5-7 percobaan independen dan disajikan sebagai persentase
kontrol sel siRNA-transfected; **
p
<
0.01 relatif terhadap kelompok kendaraan masing-masing,
+
p
<
0,05 relatif terhadap masing-masing
Ang-II dirangsang sel. Berikut protokol yang sama tapi setelah stimulasi dengan 1
l
M
Ang-II selama 24 jam pada 24 jam pasca
transfeksi, ekspresi Nox5
(E-H)
ditentukan oleh imunoblotting. Hasil (mean
SEM lima hingga enam independen
eksperimen) dinyatakan sebagai kali lipat dari Nox5:
b
-actin kontrol sel siRNA-transfected. bercak perwakilan yang
ditampilkan; **
p
<
0.01 relatif terhadap kelompok kendaraan masing-masing,
+
p
<
0,05 relatif terhadap sel Ang-II-dirangsang masing.
ROSU
1
BEX mengganggu ANG-II-induced leukosit ADHESI 909

khasiat signifikan ketika dinilai secara individual. untuk lebih

mengkonfirmasi pengamatan mencolok ini
in vivo,
harian Rosu adminAdministration pada dosis empat kali lipat-lebih rendah dari yang diperlukan untuk
mengurangi
pembentukan aterosklerosis lesi (27), atau Bex pada dosis yang
sebelumnya tidak ditemukan untuk menghambat TNF akut
Sebuah
imbas ar
teriolar leukosit adhesi (55), telah diuji secara individu atau dalam
Kombinasi pada tikus mengalami infus Ang-II kronis
(56). Dalam model ini inflamasi sistemik, arteriol leuadhesi kocyte tetap tidak berubah di Rosu atau Bex-diperlakukan
hewan, sedangkan administrasi gabungan dari kedua obat
memicu efek penghambatan sinergis. Selanjutnya, athpembentukan Eroma dan MC infiltrasi di apoE
/
tikus subdiproyeksikan untuk diet tinggi lemak jelas berkurang pada hewan
diobati dengan kombinasi obat, sehingga memvalidasi kami
in vitro
pengamatan dalam relevan
in vivo
model.
Leukosit / interaksi arteri mengharuskan kedua ekspresi
dari beberapa jenis CAMS dalam endotelium dan leukosit
serta keberadaan molekul reseptor counter di
leukosit / endotel sel (14, 31). Selain adhesi
molekul, kemokin juga memiliki potensi untuk merekrut
jenis sel tertentu dan terlibat dalam regulasi leutrafficking kocyte (14). Kemampuan Ang-II untuk meningkatkan

ekspresi endotel E-selektin, ICAM-1, dan VCAM-1

dan juga produksi beragam leukocytemerekrut kemokin terkenal (2, 36, 42, 46, 54, 60).
Statin dilaporkan untuk mengurangi baik inflamasi yang diinduksi
ekspresi ini CAMS endotel dan sintesis
banyak kemokin (24, 38). Baru-baru ini, kami memiliki
menunjukkan penurunan ekspresi E-selektin, ICAM-1,
dan VCAM-1 dan penurunan sintesis CXCL1 atau
CCL2 oleh endotelium dengan agonis RXR dalam inflamasi
lingkungan matory (55). Oleh karena itu, mungkin tidak
mengherankan bahwa pretreatment HUAECs dengan Rosu
+
Bex
Kombinasi berkurang baik ekspresi CAMS dan
sintesis kemokin yang terlibat dalam penangkapan MC
ditimbulkan oleh Ang-II. Selanjutnya, dalam
in vivo
pengaturan,
dikombinasikan pemberian dosis suboptimal dari Rosu
+
Bex,
selain pelemahan ekspresi peningkatan arteriolar E-selektin, ICAM-1, VCAM-1, dan fractalkine, dan
tingkat beredar peningkatan CXCL1, CCL2, dan di- CCL5
diproduksi oleh paparan Ang-II kronis juga menurun Ang-IIdiinduksi CD11b peningkatan regulasi dari sirkulasi monosit tapi
bukan pada neutrofil. Pengamatan ini menarik mungkin juga nyarankangest bahwa pengobatan ini dapat mengakibatkan peningkatan vaskular
Fungsi tanpa mengorbankan tanggapan neutrophilic lainnya
diperlukan dalam pertahanan tuan rumah.
Setelah menetapkan tindakan Rosu
+
Bex di
komponen tersebut dari leukosit kanonik

rekrutmen cascade, kami berusaha untuk mengetahui efeknya pada

beberapa intraseluler sinyal kaskade dipicu oleh aktivasi
ARA. 8. Kombinasi Rosu
1
Bex pada konsentrasi suboptimal dibalik penghambatan pada oksida nitrat (NO)
bioavailabilitas diinduksi oleh Ang-II di HUAECs.
sel endotel diinkubasi dengan Rosu (10 n
M
), Bex (0,3
l
M
), Atau
Kombinasi Rosu (10 n
M
) Ditambah Bex (0,3
l
M
) Selama 20 jam dan kemudian dirangsang dengan Ang-II (1
l
M
, 4 h), dan NO intraseluler
dipantau dengan (DAF-2-FM diacetate)
(SEBUAH)
. Hasil (mean
SEM minimal lima percobaan independen dilakukan di
rangkap tiga); **
p
<
0.01 relatif terhadap kelompok kendaraan,
++
p
<
0.01 relatif terhadap Ang-II memperlakukan kelompok. Dalam pengalaman-

tambahan
KASIH, sel endotel diobati sebelumnya dengan apocynin antioksidan (30
l
M
selama 1 jam) atau dengan inhibitor RhoA (C3
transferase, 2
l
g / ml selama 4 jam) sebelum stimulasi Ang-II (1
l
M
, 1 h). NO intraseluler dipantau dengan (DAF-2-FM
diacetate)
(B)
. Hasil (mean
SEM minimal lima percobaan independen dilakukan dalam rangkap tiga); **
p
<
0.01 relatif
kelompok kendaraan,
++
p
<
0.01 relatif terhadap kelompok Ang-II-diobati. Kontrol atau siRNA Nox5-transfected
HUAEC yang
dirangsang dengan Ang-II (1
l
M
selama 4 jam), dan kuantifikasi konten NO intraseluler ditentukan sebagai awal
(C)
. hasil
adalah mean
SEM dari

n
=
5 percobaan independen dilakukan dalam rangkap tiga, *
p
<
0,05 atau **
p
<
0.01 relatif terhadap
Kelompok kendaraan masing,
++
p
<
0.01 relatif terhadap sel Ang-II-dirangsang masing. Dalam eksperimen lain, sel-sel
yang
transfected dengan kontrol siRNA
(D)
, RXR
Sebuah
siRNA -specific
(E)
, PPAR
Sebuah
siRNA -specific
(F),
atau PPAR
c
siRNA -specific
(G)
dan dirangsang dengan Ang-II (1
l
M
; 4 h) pada 44 jam pasca-transfeksi. Dalam beberapa percobaan, sel-sel praperawatan dengan Rosu

(10 n
M
) Ditambah Bex (0,3
l
M
) 20 jam sebelum tantangan Ang-II dan kuantifikasi NO bioavailabilitas ditentukan.
hasil
adalah mean
SEM dari
n
=
5 percobaan independen dilakukan dalam rangkap tiga, **
p
<
0.01 relatif terhadap kendaraan masing-masing
kelompok,
++
p
<
0.01 relatif terhadap sel Ang-II-dirangsang masing.
910
ESCUDERO ET AL.
Google Terjemahan untuk Bisnis:Perangkat PenerjemahPenerjemah Situs
WebPeluang Pasar Global

reseptor AT1 Ang-II. The RhoA-Rho kinase

telah terlibat dalam leukosit perekrutan (4) dan RhoA
dapat diaktifkan dengan Ang-II, seperti yang ditunjukkan di sini dan di sebelumnya
Laporan (22). Kami menunjukkan bahwa knockdown dari RhoA ditargetkan di
HUAECs berkurang adhesi MC dipicu oleh

Ang-II. Khususnya, Rosu + Bex dihapuskan Ang-II-induced aktivasi RhoA. Meskipun

blokade jalur mevalonate oleh statin dapat mencegah sintesis intermediet
isoprenoid, seperti farnesyl pirofosfat atau geranylgeranyl pirofosfat yang terlibat
dalam modifikasi pasca-translasi dari berbagai protein termasuk
c
subunit protein G heterotrimeric seperti Rho (5,19), konsentrasi statin diperlukan
untuk menghambat Rho-kinase yang jauh lebih besar daripada yang diterapkan di
sini (lm kisaran vs.nM) (38, 51). Selanjutnya, untuk yang terbaik dari pengetahuan
kita, efek dari Bex pada aktivasi RhoA tidak pernah..

Coba browser baru dengan terjemahan otomatis.Unduh Google ChromeTutup

Top of Form
Terjemahan
Bottom of Form

Yang penting, knockdown spesifik endotel RXR,

PPAR
Sebuah
, Atau PPAR
c
terbalik efek penghambatan yang diberikan oleh
Rosu
+
Bex pada Ang-II-induced mononuklear leukosit adhesion. Akhirnya, interaksi yang jelas antara RXR / PPAR
Sebuah
dan
RXR / PPAR
c
terungkap pada co-inkubasi dengan Rosu dan
Bex pada konsentrasi suboptimal. Mengingat PPAR yang
Sebuah
atau PPAR
c
agonis dapat menghambat aktivasi RhoA (45, 50) dan
mengerahkan sifat antioksidan (40), tampaknya mungkin bahwa inhibitor
tion ekspresi Nox5 dan pencegahan ROS
menghambat aktivasi RhoA
melalui
RXR / PPAR
Sebuah
dan RXR / PPAR
c
.
Memang, knockdown dari RXR
Sebuah
, PPAR
Sebuah
, Atau PPAR

c
dihapuskan
aksi penghambatan kombinasi obat pada Ang-IIdiinduksi aktivasi RhoA dan ekspresi Nox5. Sebagai tambahan,
RhoA juga telah dilaporkan menjadi regulator hulu
anggota protein kinase (MAPK) keluarga mitogen-diaktifkan,
seperti p38 MAPK (33), dan yang terakhir dapat mengatur
transkripsi banyak gen melalui aksinya pada hilir
target seperti NF
j
B (20, 53); keduanya terlibat dalam ditanggapan flammatory seperti perekrutan MC yang disebabkan oleh
Ang-II (54). Oleh karena itu, penghambatan Ang-II-induced
aktivasi Nox5 dan ekspresi oleh Rosu
+
kombinasi Bex
dapat menghambat aktivasi RhoA dan MAPKs berbeda yang
menyebabkan aktivasi beberapa faktor transkripsi, termasuk
NF
j
B, dan pengaturan lebih lanjut dari gen yang mengkode berbeda
CAMS dan kemokin, yang secara aktif berpartisipasi dalam
mononuklear leukosit perekrutan yang disebabkan oleh Ang-II
(Tambahan Gambar. S8).
Akhirnya, Ang-II mengganggu fungsi endotel melalui supergenerasi anion oksida dan pembentukan peroxynitrite, dan eNOS
penghambatan dan uncoupling, mengurangi bioavailabilitas NO (32,
43), dan sifat anti-perekat NO secara luas recognized (17, 21). Di sini, kami melaporkan bahwa stimulasi Ang-II dikurangi
NO ketersediaan di HUAEC dan pengurangan ini terbalik dengan
pretreatment dengan Rosu
+
Bex. Selain itu, membungkam dari Nox5
dicegah efek yang disebabkan oleh Ang-II dan, dengan tidak adanya

RXR
Sebuah
, PPAR
Sebuah
, orPPAR
c
, Kombinasi Rosu
+
Bex adalah
tidak dapat sepenuhnya mengembalikan endotel NO bioavailabilitas. Ini
Hasil penelitian menunjukkan bahwa efek dicapai dengan obat kombinasition terutama karena sifat antioksidan mereka.
Sebagai kesimpulan, penelitian ini memberikan bukti pertama
yang dikombinasikan terapi dengan Rosu dan Bex di suboptikonsentrasi mal / dosis diberikannya sinergis menguntungkan
efek pada disfungsi endotel yang dihasilkan oleh Ang-II.
aktivitas anti-inflamasi ini ditemukan menjadi sayadiated melalui Nox5-RhoA-RXR / PPAR-terkait
mekanisme, menghubungkan jalur redoks-sinyal untuk MC
pengerahan.
Bahan dan metode
Manusia
in vitro
studi
Semua penyelidikan dengan sampel manusia yang dilakukan dalam hal ini
studi sesuai dengan prinsip-prinsip yang digariskan dalam Declaration dari Helsinki dan telah disetujui oleh institusi
komite etik di University Hospital Clinic of Valencia, Spanyol. izin tertulis diperoleh dari
semua relawan.
Budaya sel
HUAECs diisolasi dengan pengobatan kolagenase (26)
dan dipelihara di basal cell endotel manusia menengah-2
(EBM-2) ditambah dengan menengah pertumbuhan endotel

2 (EGM-2) dan 10% FCS. Sel pada bagian 1 ditumbuhkan

untuk pertemuan pada 24-well piring budaya. sebelum setiap
percobaan, sel-sel diinkubasi selama 16 jam dalam medium
mengandung 1% FCS dan kemudian kembali ke 10% FCSmedia Suplementasi pada saat dimulainya semua mantan
protokol perimental.
interaksi leukosit-HUAEC dalam kondisi aliran
HUAECs di bagian 1 yang tumbuh pertemuan dan
dirangsang dengan Ang-II (1
l
M
) Selama 4 jam. Rosu (10-30 n
M
), Bex
(0,3-1
l
M
), Atau kombinasi dari keduanya ditambahkan ke piring
20 jam sebelum stimulasi Ang-II. Di set percobaan,
sel diinkubasi dengan Y27632 ROCK inhibitor
(10
l
M
) 1 jam sebelum stimulasi Ang-II (1
l
M
, 4 h). Manusia
MC diperoleh dari mantel buffy dari donor yang sehat dengan
Ficoll-Hypaque density gradient sentrifugasi (37). Itu
chamber aliran Glycotech dirakit dan ditempatkan ke sebuah
terbalik tahap mikroskop, dan baru diisolasi MC manusia
(1

10

6
/ ML) kemudian perfusi di endotel yang
monolayers (HUAECs atau HUAECs transfected). Dalam semua mantan
periments, interaksi leukosit ditentukan setelah
5 menit pada 0,5 dyn / cm
2
. Sel berinteraksi pada permukaan
endotelium divisualisasikan dan dicatat (

20 obyektif,

10 lensa) menggunakan fase kontras mikroskop (Axio diamati

Server A1; Carl Zeiss mikroskop).
Arus cytometry
Konfluen sel endotel dirangsang dengan Ang-II
(1
l
M
) Selama 4 jam (ICAM-1 dan VCAM-1) atau 24 jam
(CX
3
ekspresi CL1). Dalam beberapa percobaan, sel-sel pra
diobati dengan Rosu (10 n
M
), Bex (0,3
l
M
), Atau kombinasi dari
Rosu (10 n
M
) Ditambah Bex (0,3
l
M
) 20 jam sebelum stimulasi Ang-II

lation. Sel terpisah, dicuci, dan diinkubasi pada 2

10
6
sel / ml dengan 1/100 pengenceran antibodi primer terhadap
manusia VCAM-1 atau ICAM-1 di PBS dengan 0,2% BSA dan
0,05% NaN
3
selama 1 jam di atas es. Deteksi antibodi primer
dilakukan menggunakan sesuai Alexa Fluor 488antibodi sekunder (dilusi 1/250). Untuk expression fractalkine
sion, sel diinkubasi dengan mAb PE-conjugated terhadap
CX manusia
3
CL1 (1/25 dilusi) selama 1 jam di es di sama
penyangga. Setelah dua mencuci, sel disuspensikan dalam PBS conyang memuat 2% paraformaldehyde. Sinyal fluoresensi dari
sel berlabel kemudian dianalisis dengan aliran cytometry (FACSAyat aliran cytometer; BD Biosciences). Ekspresi
ICAM-1, VCAM-1, dan CX
3
CL1 dinyatakan sebagai mean
intensitas fluoresensi (LKM).
reaksi berantai real time-polymerase
Konfluen HUAEC atau sel endotel murine yang stimulated dengan Ang-II (1
l
M
) Selama 4 jam. Dalam beberapa percobaan, sel
diobati sebelumnya dengan Rosu (10 n
M
), Bex (0,3
l
M

), Atau com- sebuah

bination dari Rosu (10 n
M
) Ditambah Bex (0,3
l
M
) 20h sebelum Ang-II
stimulasi. RNA dari sel endotel diperoleh dengan menggunakan
Trizol Reagent, dan kemurnian dan konsentrasi ditentukan
oleh A260 / 280 rasio. RNA (500ng) itu terbalik ditranskripsikan
dengan kit Maxima Pertama-Strand Sintesis cDNA dan amplified dengan Luminar Warna HiGreen HigBox qPCR Guru
Campuran. Reaksi dijalankan pada 7900 Cepat Real-Time PCR
Sistem, dan hasil dianalisis dengan perangkat lunak yang disediakan